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문제 정의
- 따라서 본 연구는 고지방식이로 고지혈증을 유발시킨 후 지방의 섭취 수준에 따른 이소플라본(제니스테인)의 심혈관계 질환 억제효과를 체내 지질대사와 항산화능 변화 측정을 통해 알아보고 지방과의 상호작용에 대해서도 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 고지방식 섭취로 유도된 고지혈증 모델 숫컷 흰쥐를 이용하여 심혈관계 질환과 관련 있는 영양소 성분인 지방과 제니스테인 섭취가 체내 지질대사와 항산화능에 어떤 영향을 주는지 알아보고 이들 두 성분간의 상호작용에 대해 검토하였다. 결과를 요약하면 아래와 같다.
제안 방법
- 성숙한 수컷 흰쥐 (Sprague -Dawley male rats, 평균체중 210 g) 에게 4주간 고지방 식이 (15% fat, 1% cholesterol of diet wt.) 를 급여하여 고지혈증 모델로 설정하였다. 이들 고지혈증 흰쥐들을 지방 (7% or 15% of diet wt.
- 실험 식이와 식수는 자유 섭취시켰고, 실험 기간 동안 식이 섭취량은 일주일에 2회 일정한 시간에 급여하였고 체중은 일주일에 1회 일정 시간에 측정하였다.
- ) 과 제니스테인 (0 or 320 ㎎/㎏ diet) 함량을 달리한 실험 식이로 다시 6주간 사육하였다. 실험군은 지방과 이소플라본 첨가 수준에 따라 고지방 제니스테인 무첨가군 (HF-G0), 고지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (HF-G320), 정상지방 제니스테인 무첨가군 (NF-G0), 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NF-G320)으로 나누었다. 실험 식이는 기본적으로 AIN-93M 패턴을 따랐으며, 지방과 제니스테인 수준은 선행연구결과를 기준으로 정하였다.
- ) 를 급여하여 고지혈증 모델로 설정하였다. 이들 고지혈증 흰쥐들을 지방 (7% or 15% of diet wt.) 과 제니스테인 (0 or 320 ㎎/㎏ diet) 함량을 달리한 실험 식이로 다시 6주간 사육하였다. 실험군은 지방과 이소플라본 첨가 수준에 따라 고지방 제니스테인 무첨가군 (HF-G0), 고지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (HF-G320), 정상지방 제니스테인 무첨가군 (NF-G0), 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NF-G320)으로 나누었다.
- 최종일에 실험동물을 하룻밤 절식시킨 후 염산케타민(케타라, 유한양행)으로 마취하여 복대 동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액 중 일부는 일반 튜브에 채취하여 800 X g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 나머지는 EDTA 튜브에 채취하여 800 X g에서 20분간 원심분리 후 혈장과 적혈구를 분리하였다.
- 혈액 중 일부는 일반 튜브에 채취하여 800 X g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 나머지는 EDTA 튜브에 채취하여 800 X g에서 20분간 원심분리 후 혈장과 적혈구를 분리하였다. 혈장과 buffy coat층을 제거한 적혈구는 0.
- 혈액 중 일부는 일반 튜브에 채취하여 800 X g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 나머지는 EDTA 튜브에 채취하여 800 X g에서 20분간 원심분리 후 혈장과 적혈구를 분리하였다. 혈장과 buffy coat층을 제거한 적혈구는 0.9% 생리식염수를 첨가하여 800 X g에서 10 분간 원심 분리하는 세척 과정을 거친 후 0.9% 생리 식염수를 첨가하여 적혈구 현탁액이 되도록 처리되었다. 간 조직은 생리 식염수에 세척한 다음 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- 지방 급원으로는 우지 (beef tallowX, 제니스테인 (genistein, 순도 >90%)은 태평양 주식회사로부터 제공받아 사용하였다 (Table 1). 실험동물은 서울대학교 실험동물 자원 관리원의 사육실에서 사육하였으며, 사육실의 온도는 22 ± 2℃, 상대 습도 65 ± 5%, 명암은 12시간 주기 (light: 06 : 00-18 : 00)로 조절하였다.
- 실험 식이는 기본적으로 AIN-93M 패턴을 따랐으며, 지방과 제니스테인 수준은 선행연구결과를 기준으로 정하였다. 지방 급원으로는 우지 (beef tallowX, 제니스테인 (genistein, 순도 >90%)은 태평양 주식회사로부터 제공받아 사용하였다 (Table 1). 실험동물은 서울대학교 실험동물 자원 관리원의 사육실에서 사육하였으며, 사육실의 온도는 22 ± 2℃, 상대 습도 65 ± 5%, 명암은 12시간 주기 (light: 06 : 00-18 : 00)로 조절하였다.
데이터처리
- Values are means ± SE, n = 9. Values with different alphabet are significantly different by Duncan's multiple range test, p < 0.05.
- Values are means±SE, n = 9. Values with different alphabet are significantly different by Duncan's mutiple range test, p < 0.05.
- Values are means ± SE, n = 9. Values with different alphabet are significantly different by Duncan's m니ti이e range test, p < 0.05.
- 05 수준에서 Duncan's multiple range test로 유의성을 검증하였다. 또한 지방과 이소플라본 섭취에 따른 효과는 Two-way ANOVA를 이용하여 p < 0.01, p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 실험 결과는 SAS program (SAS 6.12 version) 을 이용하여 통계 처리하였으며, 모든 결과는 평균과 표준 오차 (Mean ± SE) 로 나타내었다. 실험군 간의 유의성은 AN0VA test 후 p < 0.
- 12 version) 을 이용하여 통계 처리하였으며, 모든 결과는 평균과 표준 오차 (Mean ± SE) 로 나타내었다. 실험군 간의 유의성은 AN0VA test 후 p < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 유의성을 검증하였다. 또한 지방과 이소플라본 섭취에 따른 효과는 Two-way ANOVA를 이용하여 p < 0.
이론/모형
- 간의 총 지질 함량은 Bligh & Dyer'" 의 방법을 이용하여 정량하였고, 간의 콜레스테롤과 중성 지방의 농도는 추출한 총 지방을 이소프로판올 용매로 녹인 후 각각 cholesterol hydrolase를 포함한 효소 시약 kit (영동 제약, 한국)와 lipoprotein lipase와 glycerokinase를 포함한 효소 시약 kit (영동 제약, 한국)를 이용하여 측정하였다. 간의 콜레스테롤 농도는 500 nm에서, 간의 중성 지방 농도는 546 nm에서 spectrophotometer (Beckman DU 530, USA) 로 비 색 정량하였다.
- 혈청과 간 조직내의 지질 과산화물. 함량은 Buege & Aust'"의 thiobarbituric acid (TBA) 법을 이용하여 생성된 TBARS의 ■걍을' spectrophotometer (Beckman DU-530, USA) 로 535 nm에서 측정하여 단백질 mg 당으로 나타내었다.
- 실험군은 지방과 이소플라본 첨가 수준에 따라 고지방 제니스테인 무첨가군 (HF-G0), 고지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (HF-G320), 정상지방 제니스테인 무첨가군 (NF-G0), 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NF-G320)으로 나누었다. 실험 식이는 기본적으로 AIN-93M 패턴을 따랐으며, 지방과 제니스테인 수준은 선행연구결과를 기준으로 정하였다. 지방 급원으로는 우지 (beef tallowX, 제니스테인 (genistein, 순도 >90%)은 태평양 주식회사로부터 제공받아 사용하였다 (Table 1).
- 적혈구의 헤모글로빈 함량은 Cyan methemoglobin 법을 이용한 시약 kit (아산 제약, 한국)를 사용하여 측정하였으며, 간의 원형질과 세포질의 단백질 함량은 혈청 알부민을 표준 용액으로 하여 Biuret법을 이용한 시약 kit (아산제약, 한국)를 사용하여 측정하였다.
- 혈장의 nitrite 함량은 Griess®의 방법을 이용한 Griess Reagent System (Promega #G2930, USA) 을 사용하여 microplate reader (Bio-Rad Model 680, USA) 로비색 정량하여 측정하였다.
- USA)로 비색 정량하였다. 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤 HDL 콜레스테롤 농도는 혈액 자동 분석기 (Spotchem, KDK Co., Japan)를 이용하여 측정하였으며, LDL 콜레스테롤 농도는 Friedwald 등西)법 {LDL 콜레스테롤 = 총콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤 - (중성 지방/5)} 을 이용하여 계산하였다.
- 혈청의 총지질 농도는 Frings & During의 방법을 이용하여 540 nm에서 spectrophotometer (Beckman DU-530, USA)로 비색 정량하였다. 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤 HDL 콜레스테롤 농도는 혈액 자동 분석기 (Spotchem, KDK Co.
성능/효과
- 1) 식이섭취량은 고지방 섭취군과 제니스테인 첨가군이 정상지방 섭취군과 제니스테인 무첨가군에 비해 유의적으로 감소하였으나, 체중증가 제어효과는 그 중 정상지방에 제니스테인을 320 ppm 첨가한 군에서 유의적으로 나타났다.
- 2) 혈청과 간조직의 총 지질, 총 콜레스테롤 및 중성지방은 정상지방 섭취군이 고지방 섭취군에 비해 유의적으로 감소하였으나 간조직의 총콜레스테롤은 정상지방 및 고지방 섭취 시 모두 제니스테인 첨가군이 제니스테인 무첨가군에 비해 유의적으로 증가하였다.
- 3) 혈청과 간조직의 지질과산화물 (TBARS) 함량은 정상지방 섭취군이 고지방 섭취군에 비해 유의적으로 감소하였으나, 제니스테인 섭취에 의해서는 오히려 증가하는 경향을 보였다. 특히 간의 TBARS 함량은 정상지방 섭취시에 제니스테인 첨가군이 제니스테인 무첨가군에 비해 유의적으로 증가되었다.
- 4) 적혈구의 glutathione reductase 의 활성은 정상지방에 제니스테인을 첨가군이 다른 군들에 비해 유의적으로 감소하였다. 간조직의 glutathione reductase, 읺utathione peroxidase, catalase의 활성은 정상지방 섭취군이 고지방 섭취군에 비해 유의적으로 감소하였고, catalase의 활성은 고지방 섭취 시 제니스테인 첨가군이 제니스테인 무첨가군에 비해 오히려 유의적으로 증가하였다.
- 5) 혈장의 nitrite 농도는 정상지방 섭취군이 고지방 섭취군에 비해 유의적으로 낮아졌다. 또한 제니스테인 섭취에 의한 효과는 유의적이지 않았으나, 고지방 섭취 시 제니스테인 첨가는 nitrite 함량을 다소 증가시키는 것으로 나타났다.
- 없었다. 6주간의 실험식이 급여 후 최종 체중은 실험군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았으나 체중증가량은 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NAG320) 이 정상지방 제니스테인 무첨가군 (NF-G0)보다 유의적 (p<0.05)으로 18.4% 적게 증가하여 제니스테인 섭취 따른 체중증가 제어 효과가 나타났다. 식이섭취량은 고지방섭취군 (HF-GO, HF-G320) 이 정상지방섭취군 (NF-GO, NF- G320)보다 약 9% 더 적게 섭취하였고, 제니스테인 첨가군 (NF-G320, HF-G320) 이 제니스테인 무첨가군 (NF G0, NF-G320)보다 7% 더 적게 섭취하였는데 그 중 고지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (HF-G320)。] 유의적 (p < 0.
- NF-G320)。] 고지방 섭취군 (HF-G0, HF-G320)보다 유의적 (p< 0.05)으로 각각 14.1%, 61.8% 낮아져 식이 지방의 함량을 낮출수록 지질과산화물이 덜 생성되었다. 그러나 혈청과 간의 TBARS는 제니스테인 첨가에의해 각각 7.
- 4% 적게 증가하여 제니스테인 섭취 따른 체중증가 제어 효과가 나타났다. 식이섭취량은 고지방섭취군 (HF-GO, HF-G320) 이 정상지방섭취군 (NF-GO, NF- G320)보다 약 9% 더 적게 섭취하였고, 제니스테인 첨가군 (NF-G320, HF-G320) 이 제니스테인 무첨가군 (NF G0, NF-G320)보다 7% 더 적게 섭취하였는데 그 중 고지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (HF-G320)。] 유의적 (p < 0.05)으로 가장 낮은 식이 섭취량을 보여 고지방과 제니스테인을 섭취할수록 식이섭취량이 감소하는 것으로 나타났다. 이상과 같이 제니스테인 섭취에 따른 체중증가의 제어효과는 제니스테인 섭취에 따른 식이 섭취량 감소에 기인한 것을 보인다(Table 2).
- 9% 감소하여 정상 지방 섭취 시 항산화효소들의 활성이 낮아지는 것으로 나타났다. catalase의 활성은 고지방 이소플라본 320ppm 첨가군 (HF-G320) 이 고지방 이소플라본 무첨가군 (HF-G0) 와 정상지방 섭취군 (NF-G0, NF-G320)보다유의적 (p< 0.05)으로 증가하여 고지방 섭취와 고지방 섭취 시 이소플라본 첨가에 의해 catalase의 활성이 증가하는 것으로 나타났다 (Table 5).
- 간 조직의 총 지질, 총 콜레스테롤, 중성지방 농도는 정상지방 섭취군 (NF-GO, NF-G320) 이 고지방 섭취군 (HF-G0, HF-G320) 보다 유의적 (p< 0.05)으로 각각 59.1% 66.4%, 73.5% 감소하여 정상지방 섭취가 간조직의 지질함량을 낮추는 것으로 나타났다. 그러나 총 콜레스테롤 함량은 제니스테인 첨가군 (NF-G320, HF-G320) 이 제니스테인 무첨가군 (NF-IFO, HF-IF0)보다 유의적 (p < 0.
- 간조직의 glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione reductase (GR) 의 활성도는 정상지방 섭취군 (NF-GO, NF-G320)이 고지방 섭취군 (HF-G0, HF-G320) 보다 유의적 (p< 0.05)으로 각각 46.6%, 18.9% 감소하여 정상 지방 섭취 시 항산화효소들의 활성이 낮아지는 것으로 나타났다. catalase의 활성은 고지방 이소플라본 320ppm 첨가군 (HF-G320) 이 고지방 이소플라본 무첨가군 (HF-G0) 와 정상지방 섭취군 (NF-G0, NF-G320)보다유의적 (p< 0.
- 간조직의 glutathione reductase, 읺utathione peroxidase, catalase의 활성은 정상지방 섭취군이 고지방 섭취군에 비해 유의적으로 감소하였고, catalase의 활성은 고지방 섭취 시 제니스테인 첨가군이 제니스테인 무첨가군에 비해 오히려 유의적으로 증가하였다.
- 5% 감소하여 정상지방 섭취가 간조직의 지질함량을 낮추는 것으로 나타났다. 그러나 총 콜레스테롤 함량은 제니스테인 첨가군 (NF-G320, HF-G320) 이 제니스테인 무첨가군 (NF-IFO, HF-IF0)보다 유의적 (p < 0.05)으로 63.9% 높아, 제니스테인 섭취에 의해 오히려총 콜레스테롤 함량이 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 1).
- 8% 낮아져 식이 지방의 함량을 낮출수록 지질과산화물이 덜 생성되었다. 그러나 혈청과 간의 TBARS는 제니스테인 첨가에의해 각각 7.8%, 16.1% 정도 증가하는 경향을 보였는데, 그 중 간의 TBARS는 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NF-G320)이 정상지방 제니스테인 무첨가군 (NF- G0)보다 유의적 (p< 0.05)으로 148.9% 증가하여 정상지방 섭취 시에는 제니스테인 첨가가 TBARS 생성을 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났다 (Fig. 2).
- 2%를 지방으로 공급하였으나 본 연구에서는 식이무게의 7%와 15% 를 지방으로 공급하여 지질과산화물 생성이 더 잘 생성되는조건하에 있었기 때문인 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서는 제니스테인이 이미 항산화제로서 다 사용되고 phenoxyl radicals 상태로 남아 산화촉진제로서 작용한 것으로 사료된다.
- 또한 본 연구에서 제니스테인은 항산화제로서도 작용할 수 있으나 산화촉진제로서도 작용이 가능함을 시사해주었다. 그러나 천연 항산화제로서 작용할 수 있는 제니스테인의 용량에 대해서는 좀 더 많은 부가적인 실험이 필요한 것으로 보인다.
- 정상지방 섭취에 의한 총콜레스테롤 감소는 식이로 지방을 적게 섭취하였을경우 acetyl-CoA carboxylase의 활성이 증가되어 acetyl-CoA가 콜레스테롤 합성보다는 지방산의 연소과정에 많이 이용되기 때문인 것&으로 사료되며, 정상지방 섭취에 의한 LDL 콜레스테롤의 감소는 정상 및 저지방은 LDL 수용체수와 친화도를 증가시켜 혈중 LDL 제거율을 증가시키고, lipoprotein lipase의 활성을 억제하여 VLDL°] LDL로 전환되는 것을 막아주기 때문인 것龄으로 사료된다. 또한 본 연구의 총에너지의 20%를 지방으로 공급받은 정상지방 섭취군에서의 혈중 중성지방 저하는 인슐린 비의존형 당뇨병 환자와 일반인에게 총에너지의 21%를 지방으로 공급하였을 때 혈중 중성지방 및 VLDL 중성 지방농도가 총에너지의 42%를 지방으로 공급받은 군과 유사하다고 보고한 Abbott 등2® 의 연구와는 달랐으나, 이런 본연구의 결과는 심혈관계 질환의 치료식으로 지방의 함량을 낮추었을 경우 나타나는 단점 중의 하나였던 고 중성 지질 혈증에 대한 우려를 없애주는 결과였다. 그러나 아직 여러 연구들에서 상반된 결과들이 많아 좀 더 부가적인 연구가 필요한 실정이다.
- 비해 유의적으로 낮아졌다. 또한 제니스테인 섭취에 의한 효과는 유의적이지 않았으나, 고지방 섭취 시 제니스테인 첨가는 nitrite 함량을 다소 증가시키는 것으로 나타났다.
- 또한 천연항산화제 중 골다공증, 유방암, 전립선암과 같은 만성 질환 및 심혈관계 질환의 위험도를 낮춰준다고 알려져 있는 이소플라본은 대두에 풍부하며, 폐경기 고지혈증에서 혈중 지질 함량을 개* 선하며 LDL 콜레스테롤의 산화를 방지하고, LDL 수용체 형성令에 영향을 주어 동맥경화를 예방하는 것으로 알려졌다.
- 감소하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 제니스테인 섭취에 의해 NO의 수치가 유의적으로는 증가하지는 않았으나, 전체적으로 제니스테인 320 ppm를 섭취한 군에서 다소나마 증가하는 추세를 보여 위 연구와 유사한 패턴을 보였다.
- 또한 Nam & P* ark >의 연구에서 고지방식이는 중성지방의 함량을 높이고, LDL 수용체와 결합능이 떨어지는 변형된 LDL를 생성하여, 혈중에서 자유 유리기에 의해 쉽게 산화되어 더 많은 지질과 산화물을 생성한다고 보고 하였다. 본 연구에서도 중성지방수치가 높았던 고지방 섭취군 (HF-GO, HF-G320)이 저지방 섭취군 (NF-GO, NF-G320)보다 TBARS 수치가 높았다.
- 이상의 결과를 보면 지방과 제니스테인 섭취가 심혈관계질환에 미치는 영향은 제니스테인보다는 식이 지방에 의한 것이 더 큰 것으로 나타나 심혈관계 질환의 예방과 치료 차원 면에서 소량 섭취하는 기능성 식품보다는 주된 에너지원인 지방의 제한이 더 우선적으로 이루어져야 될 것을 시사하였다. 또한 본 연구에서 제니스테인은 항산화제로서도 작용할 수 있으나 산화촉진제로서도 작용이 가능함을 시사해주었다.
- 적혈구의 catalase, glutathione peroxidase (GSH— Px)의 활성은 실험군 간의 유의적인 차이가 없었으며 glutathione reductase (GR) 활성은 정상지방 제니스테인 320 ppm 첨가군 (NF-G320)이 정상지방과 고지방의 제니스테인 무첨가군 (NF-G0, HF-G6 보다 유의적 (p < 0.05)으로 각각 25.3%, 34.4% 낮아져 정상지방과 이소플라본 섭취에 의해 GR의 활성이 낮아지는 것으로 나타났다 (Table 4).
- 보였다. 특히 간의 TBARS 함량은 정상지방 섭취시에 제니스테인 첨가군이 제니스테인 무첨가군에 비해 유의적으로 증가되었다.
- 혈장의 nitrite 농도는 고지방 섭취군 (HF-G0, HF- G320) 에 비해 정상지방 섭취군 (NF-G0, NF-G320) 에서 유의적 (p< 0.05 으로 65% 낮았으며 제니스테인 첨가에 의한 효과는 유의적으로는 나타나지 않았으나 고지방 섭취 시 nitrite 함량을 15% 정도 다소 증가시키는 것으로 나타났다 (Fig. 3).
- 혈청 총 지질과 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤의 농도는 정상지방 섭취군 (NF-GO, NF-G320) 이 고지방 섭취군 (HF-GO, HF-G320)보다 유의적 (p < 0.05)으로 각각 69.9%, 51.1%, 58.3%, 70% 감소하여 정상지방 섭취가 고지혈증 유발 흰쥐의 혈청 지질대사를 개선하는 것으로 나타났다. HDL 콜레스테롤 농도는 실험군 간에유의적인 차이가 없어, 지방과 제니스테인 섭취에 의한 효과는 나타나지 않았다 (Table 3).
후속연구
- 또한 본 연구에서 제니스테인은 항산화제로서도 작용할 수 있으나 산화촉진제로서도 작용이 가능함을 시사해주었다. 그러나 천연 항산화제로서 작용할 수 있는 제니스테인의 용량에 대해서는 좀 더 많은 부가적인 실험이 필요한 것으로 보인다.
- 그러나 4% 콜레스테롤 식이를 공급하여 고지혈증을 유도시킨 수컷 Sprague-Dawley 흰쥐를 대상으로 한 Rahman 등迎의 연구에서는 고지방 식이를 먹인 군에서 NO synthase의 활성이 증가하였다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 얻었다. 그런데 여러 연구들마다 상반된 결과를 나타내고 있는 것은 아마도 NO가 환경에 따라 산화촉진제와 항산화제로 모두 작용할 수 있기 때문으로 사료되며, 39 이에 대해서는 보다 장기간의 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 할 수 있기 때문인 것으로 사료된다. 이는 일중항산소 (】。2)로 유도한 적 혈구의 광용혈 과정 에 있어 제니스테인의 첨가 (10~100 “M) 가 농도-의존적으로 양성자를 제공하여 적혈구 용혈을 억제하였다는 Park%>의 연구에 의해 뒷받침된다 그러나 고지방 섭취 시 제니스테인 첨가에 의한 간 내 catalase 활성 증가는 고지방 섭취 시 생성된 다량 유리기 제거를 위해 제니스테인이 항산화제로 사용되고 나서 산화촉진제 형태인 phenoxyl radicals 전환되었기的 때문으로 사료되나 제니스테인의 자유 유리기 제거능이 어느 정도 수준인지는 더 많은 연구가 필요하다.
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