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문제 정의
- 이는 난자내 방추사,미세소관 그리고 미세섬유 등이 낮은 온도나 동결액의 첨가시의 삼투압의 스트레스 등에 의하여 쉽게 손상을 받기 때문이며, Suzuki 등(1996)은 동해방지제의 사용이 난자의 dehydration 또는 rehydration 될 때 방주사의 이상을 초래하여 염색체 이상을 유도한다고 보고하였다. 본 실험에서는 동결-융해 후 수정란의 지질 과산화를 방 지하기 위하여 SOD 첨가 영향을 검토하였다. 처리구별 로 통계적으로는 유의차를 나타내지는 않았으나 1 unit /ml 첨가구의 생존율이 더 높은 경향을 나타내어 90D의 첨가시 원형질막의 손상을 방지에 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
- 본 연구는 돼지 수정란의 OPS 방법에 의한 동결 및 융해 후 수정란의 발육단계와 배양액내에 SOD의 첨가가 수정란의 생존성에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 본 실험에서는 동결 상해로 인한 세포질이 파괴되고 투명대가 손상 되는 난자가.다수 관찰됨에 따라 이를 방지하기 위하여 돼지 배반포기 수정란을 초급속 동결-융해 후 체외배양 시 SOD를 첨가하여 그 영향을 검토하였다. 세포의 산화 에 의한 상해는 세포 사멸의 주된 원인이며 원형질막에서 지질산화는 활성산소에 의해 족매된 arachidonic add 의 과산화와 관련된 기작에 의해 매우 불안정하며 결국 원형질막 구조의 변화를 초래한다.
- 동결-융해된 수정란은 형태적인 정상성을 검사하고, 형태적으로 정상인 수정란을 NCSU-23 배양액에 5.0 mM hypotaurine, 4 mg/ml BSA, 10 ng/ml EGF 및 0—10 units/ml SOD를 첨가하여 48시간 배양하여 발달율을 조 사하였다.
- 동결에 사용되는 동결액 조성에서 vitrification solution (VS)1은 HM에 10% ethylene glycol(EG), 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 사용하였고, VS2는 sucrose media에 20% EG 및 20% DMSO를 첨가하여 사용하였다. 동결과정은 4 well dish에 HM, VS1을 첨가한 후 mineral oil로 피복하여 실험 시작 전 2~3시간 동안 preincubation을 실시하였다. 한편 난자는 HM 에 옮겨가며 세척을 실시한 후 VS1에서 3분 동안 평형 을 실시하여 VS2 100 pl 소적에 옮겨 다시 세척하였다.
- 6 M sucrose과 20% FCS를 첨가하여 사용하였다. 동결에 사용되는 동결액 조성에서 vitrification solution (VS)1은 HM에 10% ethylene glycol(EG), 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 사용하였고, VS2는 sucrose media에 20% EG 및 20% DMSO를 첨가하여 사용하였다. 동결과정은 4 well dish에 HM, VS1을 첨가한 후 mineral oil로 피복하여 실험 시작 전 2~3시간 동안 preincubation을 실시하였다.
- 체외 수정 8시간 후, 체외 발육을 위하여 5.0 mM hypotaurine, 4 mg/ml BSA 및 ng/ml epitherimal growth factor(EGF)가 첨가된 NCSU-23 배양액 45 ul 소적에 10개씩의 수정란을 넣어 39℃, 5% CO2 그리고 포화습도 가 유지되는 배양기내에서 7일간 배양하여 배반포 발달 율을 조사하였다.
- 채란된 난자는 형태적으로 정상적이며 난구세포의 균 일성과 세포질이 정상인 것만을 선택하여 체외성숙에 사용하였다. 체외성숙용 배양액은 5.0 mM hypotaurin, 0.57 mM cystein, 10% pFF, 10 lU/ml PMSG 및 10 IU/ ml hCG가 함유된 NCSU-23(Wang 등, 1997) 배양액에서 24시간 배양 후 hormone 물질을 제거한 성숙 배양액 내에서 24시간 동안 추가 성숙배양을 실시하였다.
- 2 pl 동결보존액을 삼투 압으로 흡입하여 수정란이 들어있는 동결보존액을 극소 량으로 하여 초급속 냉동하였다. 한편, 동결을 위한 holding medium(HM)은 TCM-199 (Gibco-BRL. Grand Island, NY, USA)에 2.5 mM Hepes 및 20% FCS를 첨가 하여 기본 배양액으로 하였으며, sucrose media는 TCM-199에 0.6 M sucrose과 20% FCS를 첨가하여 사용하였다. 동결에 사용되는 동결액 조성에서 vitrification solution (VS)1은 HM에 10% ethylene glycol(EG), 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 사용하였고, VS2는 sucrose media에 20% EG 및 20% DMSO를 첨가하여 사용하였다.
대상 데이터
- 난자의 체외성숙 및 체외배양을 위해 기본 배양액으로는 10.87 mM NaCl, 0.478 mM KClZ 0.17 mM CaC& 2H2O, 0.119 mM KH2PO4, 0.119 mM MgSO4 - 7H2O, 25.07 mM NaHCOs, 1.00 mM glutamine, 7.00 mM taurine, 5.55 mM glucose, 50 yl/ml gentamycin이 첨가된 NCSU-23(North Carolina State University-23)을 사용하였다.
- 세척과정에서 30초간 동해보호제에 노출 후 즉시 2 pl 소적에 5개의 난자를 넣어 모세관작용에 의해 난자를 흡 입한 후 바로 -196℃ LN2 내에 침적하여 동결을 실시하였다. 동결된 straw는 LN2 container에 옮겨 7일 이상 보관한 후 융해하여 실험에 이용하였다. 융해 media는 HM과 0.
- 동결된 straw는 LN2 container에 옮겨 7일 이상 보관한 후 융해하여 실험에 이용하였다. 융해 media는 HM과 0.6 M sucrose액을 2:1의 비율로 혼합하여 thawing medium(TMl)으로 사용하였으며, TM2는 HM과 0.6 M sucrose를 4:1의 비율로 혼합하여 사용하였다. Straw는 LN2 container내에서 꺼내는 즉시 TM1 media에 넣 어 5분 동안 융해한 후 TM2에서 5분간 유지하다가 HM 에서 5분 동안 융해하였다.
데이터처리
- 자료의 분석은 SAS 프로그램의 GLM 분석을 이용하여 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 돼지 수정란을 OPS 기법으로 동결-융해 후 형태적으 로 정상인 배반포를 SOD가 첨가된 배양액 내에서 48시간 배양한 결과, SOD의 첨가 수준에 따른 생존율은 SOD 1 unit/ml 첨가구의 성적이 대체로 높게 나타났으 나 통계적 유의차는 인정되지 않았다. 그러나 배반포기 수정란을 발육단계별로 48시간 배양 후 발육이 진행된 수정란은 초기, 중기 및 확장배반포가 각각 30.0, 32.5 및 38.7%로, 확장배반포의 생존율이 가장 우수하였다(P< 0.05). 또한 48시간 배양 후 부화된 수정란은 후기배반포 (22.
- 돼지 배반포를 발육단계별로 분류하여 OPS 기법으로 동결-융해 후 형태적인 정상성을 검사한 결과는 초기, 중 기 및 후기배반포가 각각 30.8, 38.6 및 35.5%의 성적을 보여 유의적인 차이가 없었다(Table 1). 또한 수정란의 동해는 모든 발육단계에서 61.
- 돼지 수정란을 OPS 기법으로 동결-융해 후 형태적으 로 정상인 배반포를 SOD가 첨가된 배양액 내에서 48시간 배양한 결과, SOD의 첨가 수준에 따른 생존율은 SOD 1 unit/ml 첨가구의 성적이 대체로 높게 나타났으 나 통계적 유의차는 인정되지 않았다. 그러나 배반포기 수정란을 발육단계별로 48시간 배양 후 발육이 진행된 수정란은 초기, 중기 및 확장배반포가 각각 30.
- 05). 또한 48시간 배양 후 부화된 수정란은 후기배반포 (22.6%)가 제일 높았고 배반포(17.5%)와 초기배반포(16.7 %) 순으로, 통계적 유의성은 인정되지 않았으나 발육단 계가 높은 배반포를 동결-융해하였을 때 생존율이 높은 경향을 보였다.
- 5%의 성적을 보여 유의적인 차이가 없었다(Table 1). 또한 수정란의 동해는 모든 발육단계에서 61.4 ~69.2%를 나타내어 유의 차는 인정되지 않았으나, 완전한 세포상해의 경우는 초기배반포가 46.2%로 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).
- 본 연구는 OPS 방법에 의한 돼지 배반포기 수정란의 동결-융해 후 형태적인 정상성을 검토한 결과, 배반포 stage에 따른 유의차를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 동결시 수정란의 발육단계가 높을수록 발육의 지연 또는 정지되는 수정란보다는 정상적으로 발육이 진행된다는 보고 (Lee 등, 2003)와는 차이가 있다.
- 본 연구의 결과로부터, 돼지 수정란의 OPS 방법에 의한 동결-융해 후 생존성의 향상을 위해서는 후기배반포 기 단계에 동결하는 것이 유리하며, SOD의 첨가는 수정 란의 손상을 어느 정도 방지할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 동결-융해 후 수정란의 지질 과산화를 방 지하기 위하여 SOD 첨가 영향을 검토하였다. 처리구별 로 통계적으로는 유의차를 나타내지는 않았으나 1 unit /ml 첨가구의 생존율이 더 높은 경향을 나타내어 90D의 첨가시 원형질막의 손상을 방지에 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
- 그러나 형태적인 정상성만으로는 생존성을 판정할 수 없다. 한편, 동결-융 해 후 48시간 배양 후의 생존성을 검토한 결과, 후기배 반포기에 동결하는 것이 유의적으로 높은 성적을 나타내었다. 이러한 결과는 Lee 등(2003)이 통계적 유의차는 인 정되지 않았으나 발육단계가 높을수록 후기배반포와 부 화까지 발육율의 성적이 높게 나타났다는 보고와 Dobrinsky 등(2000) 이 cytochalasin-B가 돼지 수정란의 vitification 동결에 미치는 영향의 실험에서 발육단계가 높을수록 생존율이 유의적으로 높다는 결과와 대체로 일치 하였다.
후속연구
- Vajta 등(1998)은 OPS 방법이 동결과 융 해율을 증가시켰으며, 동결보호제를 낮은 농도로 사용함 으로써 독성을 감소시키고 삼투압 손실을 줄이는 것으로 보고했다. OPS 방법이 쉽고 유용하게 사용될 수 있지만 LN2 내에 직접 넣으면 straw가 떠다니므로 동결속도의 감소로 난자에 손상을 줄 가능성이 있지만 이들 기술적 인 문제만 해결된다면 매우 효과적인 동결법으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다. (Kim 등, 2001).
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