젖소 초유로부터 분리한 Insulin-like Growth Factor-1 분획이 In Vitro에서 마우스의 면역 활성에 미치는 영향 Effects of IGF-I Rich Fraction from Bovine Colostral Whey on Immune Activity of Mouse In Vitro원문보기
젖소 초유 whey 내에 존재하는 IGF-I을 분리하기 위하여 ultrafiltration을 사용하여 30과 1 kDa 사이의 IGF-I rich fraction을 분획하였다. 분획한 IGF-I rich fraction내에 IGF-I의 존재 여부는 SDS-PACE와 western blotting으로 확인하였고, sandwich ELISA로써 분획 내 IGF-I을 정량하였다. 그 결과 IGF-I은 단백질 mg당 10 ng으로 측정되었다. 분획한 IGF-I rich fraction을 마우스 복강 macrophge의 면역 활성에 미치는 영향 즉, IL-6, NO, $TNF-{\alpha}$, Phagocytosis, $H_{2}O_{2}$,의 분비 유도 및 생성량을 측정하였고, splenocyte의 면역 활성으로는 splenocyte의 증식 효과와 natural killer cell의 항암작용을 측정하였다. 실험 결과 IGF-I rich fraction $1{\mu}g/mL$ 투여군에서 IL-6의 생성량은 9.85 ng, NO의 생성량은 $17.1{\mu}M$, phagocytosis는 양성 대조구에 대비하여 78.3%의 탐식작용을 나타내었고 $TNF-{\alpha}$와 $H_{2}O_{2}$의 생성량은 대조구에 대비하여 각각 34.5 및 6% 더 많은 양을 생산하였다. Splenocyte 면역활성에 미치는 영향으로 T cell과 B cell 증식은 대조군에 대비하여 각각 36 및 76%로 더 높은 증식 효과를 나타내었고, NK cell의 활성은 대조군보다 55.4%의 높은 활성을 보였다.
젖소 초유 whey 내에 존재하는 IGF-I을 분리하기 위하여 ultrafiltration을 사용하여 30과 1 kDa 사이의 IGF-I rich fraction을 분획하였다. 분획한 IGF-I rich fraction내에 IGF-I의 존재 여부는 SDS-PACE와 western blotting으로 확인하였고, sandwich ELISA로써 분획 내 IGF-I을 정량하였다. 그 결과 IGF-I은 단백질 mg당 10 ng으로 측정되었다. 분획한 IGF-I rich fraction을 마우스 복강 macrophge의 면역 활성에 미치는 영향 즉, IL-6, NO, $TNF-{\alpha}$, Phagocytosis, $H_{2}O_{2}$,의 분비 유도 및 생성량을 측정하였고, splenocyte의 면역 활성으로는 splenocyte의 증식 효과와 natural killer cell의 항암작용을 측정하였다. 실험 결과 IGF-I rich fraction $1{\mu}g/mL$ 투여군에서 IL-6의 생성량은 9.85 ng, NO의 생성량은 $17.1{\mu}M$, phagocytosis는 양성 대조구에 대비하여 78.3%의 탐식작용을 나타내었고 $TNF-{\alpha}$와 $H_{2}O_{2}$의 생성량은 대조구에 대비하여 각각 34.5 및 6% 더 많은 양을 생산하였다. Splenocyte 면역활성에 미치는 영향으로 T cell과 B cell 증식은 대조군에 대비하여 각각 36 및 76%로 더 높은 증식 효과를 나타내었고, NK cell의 활성은 대조군보다 55.4%의 높은 활성을 보였다.
Insulin-like growth factor-I(IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey. IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PACE and western blotting and then the quantity of IGF-I was measured by sandwich ELIS...
Insulin-like growth factor-I(IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey. IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PACE and western blotting and then the quantity of IGF-I was measured by sandwich ELISA. ICF-I concentration in IGF-I rich fraction was 10 ng/mg proteins. IGF-I rich fraction, standard IGF-I and colostral whey weie treated to murine peritoneal macrophages. And then we experimented that effect of immune activity on macrophage and splenocyte. As a result, in group treated with IGF-I rich fraction $1{mu}g/mL$, production of interleukin-6 and nitric oxide were 9.85 ng and $17.17{\mu}M$ and production of phagocytosis, tumor necrosis factor-${\alpha}\;and\;H_{2}O_{2}$ were 78.3, 34.5 and 6% compared to the control group. In splenocyte immune response, B cell and T cell proliferation and NK cell activity were 103, 126 and 22.2% in group treated with IGF-I rich fraction $1{\mu}g/mL$ to compared to the control, respectively.
Insulin-like growth factor-I(IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey. IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PACE and western blotting and then the quantity of IGF-I was measured by sandwich ELISA. ICF-I concentration in IGF-I rich fraction was 10 ng/mg proteins. IGF-I rich fraction, standard IGF-I and colostral whey weie treated to murine peritoneal macrophages. And then we experimented that effect of immune activity on macrophage and splenocyte. As a result, in group treated with IGF-I rich fraction $1{mu}g/mL$, production of interleukin-6 and nitric oxide were 9.85 ng and $17.17{\mu}M$ and production of phagocytosis, tumor necrosis factor-${\alpha}\;and\;H_{2}O_{2}$ were 78.3, 34.5 and 6% compared to the control group. In splenocyte immune response, B cell and T cell proliferation and NK cell activity were 103, 126 and 22.2% in group treated with IGF-I rich fraction $1{\mu}g/mL$ to compared to the control, respectively.
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제안 방법
Ding 등(1988)과 Green 등(1982)에 의한 Griess 방법에 따라 분리 한 macrophage에 각 시료를 농도별로 처리하고 18시간 동안 배양한 후 배양 상등액 중의 nitric oxide 생성 농도를 측정하였다. NO의 생성 농도는 sodium nitrite의 표준 곡선을 작성하고 이에 준하여 계산하였다.
Macrophage에서 분비된 2의 생성량은 Nathan과 Root (1977)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
NK cell의 활성은 YAC-1 cell을 target cell로 하였으며 YAC-1 cell 에 대한 세포 독성율을 측정함으로써 NK cell 활성에 미치는 영향으로 나타내었다(Fig. 9). 그 결과 1 g/mL의 농도에서 IGF-I rich fractione 22.
NO의 생성 농도는 sodium nitrite의 표준 곡선을 작성하고 이에 준하여 계산하였다.
Splenocyte의 분리 및 배양은 Holsapple 등(1984)의 방법을 수정하여 사용하였다. 분리한 splenocyte는 10mL의 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁하여 96-well microplate에 200"L/well 분주 시 5xlO5 cells의 농도가 되도록 조정하여 실험에 사용하였다.
LPS를 처 리하였다. 각 시료를 처 리하고 18시간 배양한 후 배양 상등액을 회수하여 상등액 중의 IL-6 양을 sandwich ELISA assay를 사용하여 정 량하였다.
따라서 본 연구에서는 젖소 초유로부터 IGF-I rich fraction 을 분획 하고, 분획된 IGF-I rich fraction 및 standard IGF-1 과whey를 각 농도별로 처리하여 면역 조절 작용에 관여하는lymphocytes와 macrophage 활성 에 IGF-I rich fraction0] 미치는 영향을 실험하였다.
분리 한 macrophage는 Ding 등(1988)의 방법에 의해 lx105 cells/well의 농도로 분주한 후 IGF・I rich fraction, standard IGF-I 및 colostral whey를 각 농도별로 첨가하였으며, 양성대조 구는 LPS를 처 리하였다. 각 시료를 처 리하고 18시간 배양한 후 배양 상등액을 회수하여 상등액 중의 IL-6 양을 sandwich ELISA assay를 사용하여 정 량하였다.
분리하였다. 분리한 IGF-I rich actione SDS-PAGE(Fig. 1A)을 실시한 후 western blotting (Fig. IB)으로 분획 중의 함유된 IGF-I을 확인하였다. 분획 한 IGF-I rich fraction!- SDS-PAGE로서 확인한 결과 20 kDa 이하 분자량을 지닌 성분만을 확인하였다.
그 결과 IGF-Ie 단백질 mg당 10 ng으로 측정 되었다. 분획 한 IGF-I rich fraction을 마우스 복강 macrophge의 면역 활성에 미치는 영향 즉, IL-6, NO, TNF-a, Phagocytosis, 6의 분비 유도 및 생성량을 측정하였고, splenocyte의 면역 활성으로는 splenocyte의 증식 효과와 natural killer cell의 항암작용을 측정하였다. 실험 결과 IGF-I rich fraction 1 "g/mL 투여군에서 IL-6의 생성량은 9.
분획하였다. 분획한 IGF-I rich fhiction내에 IGF-I 의 존재 여부는 SDS-PAGE와 western blotting으로 확인하였고, sandwich ELISA로써 분획 내 IGF-I을 정 량하였다. 그 결과 IGF-Ie 단백질 mg당 10 ng으로 측정 되었다.
젖소 초유 whey 내에 존재하는 IGF-I을 분리하기 위하여ultrafiltration을 사용하여 30과 1 kDa 사이의 IGF-I rich fraction을 분획하였다. 분획한 IGF-I rich fhiction내에 IGF-I 의 존재 여부는 SDS-PAGE와 western blotting으로 확인하였고, sandwich ELISA로써 분획 내 IGF-I을 정 량하였다.
Macrophage# IxlO5 cells/well로 분주하고 IGF-I rich fraction, IGF-I 및 costral whey를 각 농도별로 처리하고 양성 대조구에는 lipopysaccharide(LPS)를처리하여 24시간 배양시킨 후 상등액을 회수하였다. 회수한상등액은 TNF-a에 민감한 L929 cell 에 actinomycin D와 힘께 넣은 후 L929의 사멸능력으로 TnF-a의 생성도를 측정하였다.
대상 데이터
Standard IGF-1은 R&D systems(USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 세포배양에 사용한 RPMI 1640은 Gibco(USA)에서, Fetal bovine serum(FBS)는 Gemini(USA)로부터 구입하였으며 이외 특별한 언급이 없는 한 시약은 Sigma(USA)에서구입하여 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 동물은 ICR 마우스(8, 4주령)로서 (주) 오리엔트로부터 구입하였으며, 마우스 식이는 표준사료 (Purina Korea)를 공급하였고 1주간 예비사육한 후 실험에 사용하였다. 1주 동안 사육한 후 마우스를 희생시켜 무균 상태에서 macrophage와 splenocyte를 분리하였다.
초유는 수원시 소재 축산 농가에서 사육중인 홀스타인으로부터 분만 후 24시간 이내에 분비된 것을 착유하여 실험에 공시 유로 사용하였다.
데이터처리
본 실험의 측정 결과는 SPSS(Ver. 10.0 package program) 을 이용하여 통계 처리하였으며, Duncan's multiple range test 에 의하여 분석하였고, 유의적 검증eQV0.01 수준으로 시행하였다.
이론/모형
IGF-I rich fraction 분리는 whey를 Hossner와 Yemm(2000) 의 방법을 이용하여 30과 1 kDa의 ultrafiltration cartridge (prep/scale-TFF, Millipore, USA)로 free form의 IGF-1 이 함유되어 있는 IGF-I rich fraction(30~l kDa)을 분리하였다. 위의 모든 과정은 4℃의 cold room에서 실시하였다.
Macrophage의 phagocytosis 측정은 Okimura 등(1986)과 Stossel 등(1973)의 zymosan particle과 NBT(4-nitroblue tetra- zolium chloride) reduction 방법을 이용하여 측정하였다.
NK celt의 활성 측정은 Ortakb와 Hemerman(1984)의 방법에 따라 NK cell에 민감한 YAC-1 cell에 대한 cytotoxicity로서 측정하였고, 아래의 식에 의해 산출하였다.
SDS-PAGE를 마친 gele coomassie blue R-250 시약으로 염색한 후 탈색시켜 밴드를 확인하였고, Hossenlopp 등 (1986)의 방법에 의해 western blotting을 실시하여 IGF-I의 존재를 확인하였다. 또한 IGF-I rich fraction 내에 함유되어있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 측정하였다(Battelli et al.
Ultrafiltration에 의해 얻어진 IGF-I rich fraction(30~l kDa) 은 효과적인 분리 및 분획한 IGF-I rich fraction(30~l kDa) 내에 IGF-I이 포함되어 있는지를 확인하기 위해 Laemmli(1970)의 방법으로 SDS-PAGE를 실시하였다.
확인하였다. 또한 IGF-I rich fraction 내에 함유되어있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 측정하였다(Battelli et al., 1999).
복강 macrophage의 분리는 Klimetzek와 Remold(1980)의방법을 이용하였다. 마우스의 복강으로부터 분리하여 회수한 macrophage를 96-well microplate에 200L/well 분주 시 1X105 cells의 농도로 조정하여 실험에 사용하였다.
분리한 splenocyte는 Landreth 등(1992)의 방법에 의해 5xl05 cells/wdl이 되도록 200L씩 분주한 후 48시간 동안 배양하였으며, 세포 증식을 위한 mitogen으로 B cell과 T cell 은 각각 LPS 오* concanavalin A(Con A)를 사용하였다.
성능/효과
1 g/mL의 농도에서는 LPS 처리구와 거의 유사한 수준으로 과산화수소를 생성하였다. Colostral whey는 1 "g/mL의 처리구에서 대조구에 비해 2%의 과산화수소 생성량 증가를 나타내었으나, 0.1 /zg/mL 이하의 농도에서는 과산화수소의 생성에 거의 영향을 주지 못했다. 과산화수소는 활성화된 macro- phage에서 생성되는 대사산물로써 독성 산소에서 유래되 어비 특이적인 생체 방어기작으로서 감염된 세포들을 죽이는독성이 있는 물질이다.
001 g/mL의 농도에서는 32, 18%의 증식율을 나타내었다. IGF-I 처리구는 1, 0.1, 0.01 및 0.001g/mL에서 각각 대조구보다 128, 87, 55 및 36%의 높은 결과를 나타내었고, colostral whey도 1 "g/mL의 처리구에서 는 64%의 T cell 증식 효과를 보였다. 이와 같은 결과를 양성 대조구와 비교해보면 IGF-I rich fraction과 IGF-I 처 리구는 1, 0.
분획 한 IGF-I rich fraction을 마우스 복강 macrophge의 면역 활성에 미치는 영향 즉, IL-6, NO, TNF-a, Phagocytosis, 6의 분비 유도 및 생성량을 측정하였고, splenocyte의 면역 활성으로는 splenocyte의 증식 효과와 natural killer cell의 항암작용을 측정하였다. 실험 결과 IGF-I rich fraction 1 "g/mL 투여군에서 IL-6의 생성량은 9.85 ng, NO의 생성량은 17.1phagocytosis는 양성 대조구에 대비하여 78.3%의 탐식 작용을 나타내었고 TNF-a와 2의 생성량은 대조구에 대비하여 각각 34.5 및 6% 더 많은 양을 생산하였다. Splenocyte 면역 활성에 미치는 영향으로 T cell 과 B cell 증식은 대조군에 대비하여 각각 36 및 76%로 더 높은 증식 효과를 나타내었고, NK cell의 활성은 대조군보다 55.
IB)으로 분획 중의 함유된 IGF-I을 확인하였다. 분획 한 IGF-I rich fraction!- SDS-PAGE로서 확인한 결과 20 kDa 이하 분자량을 지닌 성분만을 확인하였다.이러한 결과는 ultrafiltration이 IGF-I rich efraction을 분리하는 과정에서 whey중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거시키는 방법임을 확인할 수 있었다.
3). IGF-I rich fraction, IGF-I 및 whey를 동일한 농도로 자극하였을 때 macrophage의 NO 분비 능력IL-6와 마찬가지로 IGF-I이 가장 높았으나 IGF-I rich faction도 IGF-I과 유사한 수준의 분비 능력을 보였으며 colostral whey에서 가장 낮게 나타났다. .
7은 IGF-I rich fraction, IGF-I 및 colostral whey가 in에서 B cell 증식에 미치는 영향을 실험한 결과이다.IGF-I rich fraction을 1, 0.1 및 0.01 g/mL의 농도로 자극 시 B cell 증식 효과는 대조구에 대비해 각각 103, 105 및 55%의 증식 능력을 보였고, 0.001 g/mL의 농도에서는 46%의 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한 IGF-I 처리구는 1, 0.
6과 같다. IGF-I rich011의 마우스 복강 macrophage에 의한 과산화수소의 생성은 IGF-I rich fraction의 경우 1, 0.1 g/ mL의 농도에서 대조구보다 각각 6, 2% 더 많이 생성하였고, 0.01 g/mL 이하의 농도에서는 거의 효과가 없는 것으로 나타났다. IGF-Ie 1~0.
01 g/mL 이하의 농도에서는 거의 효과가 없는 것으로 나타났다. IGF-Ie 1~0.001 g/mL의 농도에서 대조구에 비해서 15, 18, 9 및 6%의 과산화수소 생성 증가를 나타내었으며, 0.1 g/mL의 농도에서는 LPS 처리구와 거의 유사한 수준으로 과산화수소를 생성하였다. Colostral whey는 1 "g/mL의 처리구에서 대조구에 비해 2%의 과산화수소 생성량 증가를 나타내었으나, 0.
5 및 6% 더 많은 양을 생산하였다. Splenocyte 면역 활성에 미치는 영향으로 T cell 과 B cell 증식은 대조군에 대비하여 각각 36 및 76%로 더 높은 증식 효과를 나타내었고, NK cell의 활성은 대조군보다 55.4%의 높은 활성을 보였다.
각 시료를 1 g/mL 농도로 자극하였을 때 마우스 복강macrophage에서 분비되는 NO의 생성량은 IGF-I rich fraction 이 17.1 M, IGF-Ie 18.8 M 그리고 colostral whey는 11.6 M이었다(Fig. 3). IGF-I rich fraction, IGF-I 및 whey를 동일한 농도로 자극하였을 때 macrophage의 NO 분비 능력IL-6와 마찬가지로 IGF-I이 가장 높았으나 IGF-I rich faction도 IGF-I과 유사한 수준의 분비 능력을 보였으며 colostral whey에서 가장 낮게 나타났다.
5와 같다. 각 시료를 1 g/mL 농도로 처리한 결과 양성대조 구에 대비하여 IGF-I rich ctioiie 78.3%, IGF-I이 103.6%, 그리고 colostral wheye 62.8%로 phagocytosis를 증진하였고, IGF-I이 가장 높게 나타났으며 IL-6와 NO의 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 이와 같이 IGFJ보다 더 높은 phagocytosis를 나타낸 것은 IGF-I 자체가 마우스 복강 macrophage를 자극하여 탐식작용을 나타낸 결과이며 또한 분획한 IGF-I rich fiactige 분획 중에 IGF-I과 다른 일부 포함되어 있는 생리 활성 물질과의 상승 효과에서 비롯된 결과로서 생각된다.
9). 그 결과 1 g/mL의 농도에서 IGF-I rich fractione 22.2%, IGF-Ie 27.7%, colostral whey는 YAC-1 cell에 대해 15.21%의 세포 독성을 나타내었다. 또한 IGF-I rich fraction과 IGF-Ie 1 ~0.
001 g/mL의 농도에서는 23, 8%의 세포 증식율로 대조구보다 높게 나타났다. 그러나 colostral whey 처리구는 1 ~0.001 g/mL의 모든 농도에서 LPS 처리한 양성 대조구보다 낮은 세포 증식 효과를 나타냄으로써colostral whey에서 분획한 IGF-I rich fractione splenocyte의활성에 효과를 지니는 성분임을 확인할 수 있는 결과이다.
그리고 IGF-I rich fraction 중에 존재하는 IGF-I 함량을 sandwich ELISA로 측정한 결과, IGF-I rich inaction에는 단백질 1 mg 당 10 ng의 IGF-I을 함유하는 것이 확인되었다.
4 와 같다. 대조구에 대비하여 LPS로 자극한 양성대조구는 45.4%, IGF-I rich fraction, IGF-I 및 colostral whey 1 “g/mL 처리구는 34.5, 40.5와 26.5%의 L929 cell lysis를 보였으며 IGF-I rich fraction과 IGF-Ie 양성 대조구와 유사한 TNF-a 생성 능력을 가지는 것을 확인하였다. Tumor necrosis fhctoi는 염증 및 암 등의 질환에서 면역능이나 대사조절에 중요한 역할을 담당하며 NO와 함께 macrophage가 활성을 가질 때 분비하는 내인성 매개인자로 알려져 있다(Riches et al.
본 실험과 유사한 실험을 실시한 Hossner와 Yemm(2000)은 초유를 30 kDamembrane으로 diafiltration 처리한 후 회수한 30 kDa 이상의 분획 중에 IGF-I를 함유하는 30 kDa 이하의 성분들이 상당량 확인되었음을 보고하였다. 따라서 본 연구에서 IGF-I을 선택적으로 분리하기 위해서 사용한 ultrafiltration이 Hossner과 Yemm이 처리한 diafiltration보다 효과적으로 IGF-I을 분획하고 IGF-I 농축물을 제조하는데 적합한 방법으로 생각된다.
따라서 본 연구에서 얻어진 결과는 colostral whey로부터 분리한 IGF-I rich fiaction이 splenocyte의 활성화에 상당한영향력을 가짐을 확인하였으며 또한 숙주의 면역 활성에 중대한 역할을 기여할 수 있는 물질임을 알 수 있는 결과이다.
21%의 세포 독성을 나타내었다. 또한 IGF-I rich fraction과 IGF-Ie 1 ~0.001 g/mL의 모든 농도에서 대조구보다 높은 세포 독성을 보였으나, colostral whey의 경우 1, 0.1 g/mL의 농도에서만 대조구 비해 높은 효과를 나타내었으며 이들의 YAC-1 cell lysis에 대한결과는 모두 농도 의존적인 경향으로 나타났다.
001 g/mL의 농도에서는 46%의 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한 IGF-I 처리구는 1, 0.1, 0.01 및 0.001 g/mL의 농도로 자극한 결과 각각 135, 112, 99 및 58%의 세포 증식율을 나타내었고, colostral whey 처리 구에서는 1, 0.1 g/mL의 농도로 처리한 결과 각각 52, 33%의 세포 증식율을, 0.01, 0.001 g/mL의 농도에서는 23, 8%의 세포 증식율로 대조구보다 높게 나타났다. 그러나 colostral whey 처리구는 1 ~0.
위한 종양 면역의 연구 중에 발견되었고(Ortaldo andHemerman, 1984; Trinchieri, 1989), natural killer cell-mediated responses는 viruses와 여러 형태의 tumor에 대한 방어 기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 바이러스 감염 초기 단계에서 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 기능을 가지며 미생물 감염을 방지하는 기능도 있어 암세포를 사멸시킬 뿐만 아니라 바이러스 감염 시 초기 방어단계에 작용하여 바이러스에 감염된 세포의 제거에 높은 효과를 나타낸다. 또한 세포 내의 monocyte에 잠복하는 세균에도 autologous monocyte를 lysis시키고 진균의 감염 시에도 직접 작용하지는 않지만 neutrophile 을 활성화시키고 순환시킬 수 있는 cytokine을 분비하는 등 숙주 방어 기전에 중요한 역할을 하므로 NK 세포가 손상을 입으면 암이나 감염에 노출되기 쉬운 것으로 알려져 왔다.
실험 결과 IGF-I rich fraction 의 IL-6 분비 유도에 미치는 영향은 1 g/mL의 최고 농도처리 시로 나타났으며, standard 1GF-I과 유사한 수준의 분비 유도 능력이 있음을 확인하였고, colostral whey에서는 그 분비 유도 능력이 가장 낮게 나타났다. 본 실험에서 IGF-I rich 1011에 의한 마우스 복강 macrophage로부터 IL-6 생성은 시료의 농도에 의존적이었으며 IGF-I과 colostral whey도 같은 경향을 나타내었다. 또한 이러한 결과는 IGF-I 이macrophage의 활성을 증진하여 IL-6의 생성을 증가시킴을 확인한 결과이며 Muraguchi 등(1988)이 보고한 바와 같이 증가된 IL-6는 B 세포의 성숙, T세포의 증식과 IL-2 생성 량 증진과 cytotoxic T세포의 유도 등 체액성 면역과 세포 면역 반응에 크게 영향을 미칠 것으로 생각된다.
과산화수소는 활성화된 macro- phage에서 생성되는 대사산물로써 독성 산소에서 유래되 어비 특이적인 생체 방어기작으로서 감염된 세포들을 죽이는독성이 있는 물질이다. 본 실험에서 IGF-I rich faction과 IGF-Ie macrophage를 활성화하여 과산화수소의 생성을 증진하는 것으로 확인됨에 따라 IGF-I rich fraction과 IGF-Ie생체 내의 항균 작용 및 면역력을 증강시킬 수 있을 것으로 생각된다.
8과 같다. 분리한 macrophage에 IGF-I rich fraction 1, 0.1g/mL 농도 처리구는 대조구에 비해 126, 65%의 T cell 증식 효과를 보였으며 0.01, 0.001 g/mL의 농도에서는 32, 18%의 증식율을 나타내었다. IGF-I 처리구는 1, 0.
7 ng/mL를 분비하였다. 실험 결과 IGF-I rich fraction 의 IL-6 분비 유도에 미치는 영향은 1 g/mL의 최고 농도처리 시로 나타났으며, standard 1GF-I과 유사한 수준의 분비 유도 능력이 있음을 확인하였고, colostral whey에서는 그 분비 유도 능력이 가장 낮게 나타났다. 본 실험에서 IGF-I rich 1011에 의한 마우스 복강 macrophage로부터 IL-6 생성은 시료의 농도에 의존적이었으며 IGF-I과 colostral whey도 같은 경향을 나타내었다.
분획 한 IGF-I rich fraction!- SDS-PAGE로서 확인한 결과 20 kDa 이하 분자량을 지닌 성분만을 확인하였다.이러한 결과는 ultrafiltration이 IGF-I rich efraction을 분리하는 과정에서 whey중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거시키는 방법임을 확인할 수 있었다. 본 실험과 유사한 실험을 실시한 Hossner와 Yemm(2000)은 초유를 30 kDamembrane으로 diafiltration 처리한 후 회수한 30 kDa 이상의 분획 중에 IGF-I를 함유하는 30 kDa 이하의 성분들이 상당량 확인되었음을 보고하였다.
001g/mL에서 각각 대조구보다 128, 87, 55 및 36%의 높은 결과를 나타내었고, colostral whey도 1 "g/mL의 처리구에서 는 64%의 T cell 증식 효과를 보였다. 이와 같은 결과를 양성 대조구와 비교해보면 IGF-I rich fraction과 IGF-I 처 리구는 1, 0.1 g/mL의 농도에서 colostral whey는 1 g/mL의 농도처리구에서 양성 대조구보다 높은 결과를 나타내었다.
후속연구
이것은 IGF-I이 insulin과 유사한 기능을 가진다는 점에 착안하면 일맥상통하는 부분이며, 또한 IGF-I이 superoxide의 형성을 억제하면 조직의 손상을 줄이는데 이용할 수 있으므로 노화 예방에도 이용되어질 수 있다. 이에 본 실험에서 젖소 초유로부터 분획 한 IGF-I rich fraction이 in 에서 IGF-I과 유사한 NO 분비 유도 능력 을 가지고 있음을 확인함과 동시에 위에서 보고된 노화 방지 및 superoxide의 형성 억제 등에 영향을 끼칠 수 있을 것으로 생각된다.
참고문헌 (28)
Battelli, M. G., Abbondanza, A., Musiani, S., Buonamici, L., Stroccm, P., Tazzari, P. L., Gramantieri, L., and Stirpe, F. (1999) Determination of xanthine oxidase in human serum by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Clin. Chim. Acta. 281, 147-158
Butler, J. E. (1994) Passive immunity and immunoglobulin diversity. In Proceedings of the IDF seminar: Indigenous antimicrobal agents of milk-recent developments. Brussels: International Dairy Federation. 14-50
Clark, R., Strasser, J., McCabe, S., Robbins, K., and Jardieu, P. (1993) Insulin-like growth factor-I stimulation of lymphopoiesis. J. Clin. Invest. 92, 540-548
Ding, A. H., Nathan, C. F., and Stuher, D. J. 1988. Release of reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophage. Composition of activating cytokines and evidences for independent production. J. Immunol. 141, 2407-2412
Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S. and Tannenbaum, S. R. (1982) Analysis of nitrate, nitrite and [ $^{15}N$ ] nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126, 131-138
Hagiwara, K., Kataoka, S., Yamanaka, H., Kirisawa. R., and Iwai, H. (2000) Detection of cytokines iri bovine colostrum. Vet. Immunol. Immunopathol. 76, 183-90
Heemskerk, M. H., Hooijberg, E., Ruizendaal, J. J., van der Weide, M. M., Kueter, E., Bakker, A. Q., Schumacher, T. N., and Spits, H. (1999) Enrichment of an antigen-specific T cell response by retrovirally transduced human dendritic cells. Cell. Immunol. 195, 10-17
Holsapple, M. P., Tucker, A. N., McNerney, P. J., and White, K. L. Jr. (1984) Effects of N-nitroso-dimetylamine on humoral immunity. J. Pharmacal. Exp. Ther. 229, 493-500
Hossenlopp, P., Seurin, D., Segovia-Quinson, B., Hardouin, S., and Binoux, M. (1986) Analysis of serum insulin-like growth factor binding protein using western blotting: use of the method for titration of the binding proteins and competitive binding studies. Anal. Biochem. 154, 138-143
Hossner, K. L. and Yemm, R. S. (2000) Improved recovery of insulin-like growth factors(IGFs) from bovine colostrum using alkaline diafiltration. Biotechnol. Appl. Biochem. 32, 161-166
Kashyap, S. R., Roman, L. J., Lamont, J., Masters, B. S., Bajaj, M., Suraamomkul, S., Belfort, R., Bema, R., Kellogg, D. L. Jr., Liu, Y., and DeFronzo, R. A. (2005) Insulin resistance is associated with impaired nitric oxide synthase activity in skeletal muscle of type 2 diabetic subjects. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 1100-1105
Keller, R., Geiges, M., and Keist, R. (1990) L-argininedependent reactive nitrogen intermediates as mediators of tumor cell killing by activated macrophages. Cancer Res. 50, 1421-1425
Klimetzek, V. and Remold, H. G. (1980) The murine bone marrow macrophage, a sensitive indicator cell for murine migration inhibitory factor and a new method for their harvest. Cell. Immunol. 53, 257-266
Muraguchi, A., Hirano, T., Tang, B., Matsuda, T., Horii, Y., Nakajima, K., and Kishimoto, T. (1988) The essential role of B cell stimulatory factor 2 (BSF-2/IL-6) for the terminal differentiation of B cells. J. Exp. Med. 167, 332-344
Nathan, C. F. and Root, R. K. (1977) Hydrogen peroxide release from mouse peritoneal macrophages: dependenceon sequential activation and triggering. J. Exp. Med. 146. 1648-1662
Okimura, T., Ogawa, M., and Yamauchi, T. (1986) Stress and immune responses. III. Effect of restraint stress on delayed type hypersensitivity(DTH) response, natural killer(NK) activity and phagocytosis in mice. Jpn. J. Phamacol. 41, 229-235
Ortaldo, J. R. and Hernerman, R. B. (1984) Heterogeneity of natural killer cells. Annu. Rev. Immunol. 2, 359-394
Regester, G. O., Smithers, G. W., Mitchell, I. R., McIntosh, G. H., and Dionysius, D. A. (1997) Bioactive factors in milk: Natural and induced. In: Milk composition, production and biotechnology. Welch, R. A. S., Bums, D. J. W., Davis, S. R., Popay, A. I., and Prosser, C. G. (eds.), CAB International. NY, pp. 119-132
Schams, D. (1994) Growth factors in milk. Endocr. Regul. 28, 3-8
Simmen, F. A., Simmen, R. C. M., and Reihnart, G. (1988) Maternal and neonatal somatomedin-C/insulin-like growth factor-I(IGF-I) and IGF binding proteins during early lactation in the pig. Dev. Biol. 130, 16-27
Stossel, T. P. (1973) Evaluation of opsonic and leukocyte function with a spectrophotomeric test in patients with infection and with phagocytic disorders. Blood. 42, 121-130
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