조사료로서 소화율을 향상시킨 신품종 형질 전환 오차드그래스를 개발할 목적으로 lignin 합성경로에 있어서 중요한 효소 유전자 중의 하나인 COMT 유전자를 cloning하여 그 특성을 해명하였다. 오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성 유전자일 것으로 판단되었다. Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다. PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다. Dgcomt 유전자의 발현억제는 식물체의 목질화와 더불어 증가되는 lignin의 축적량을 감소시킬 것으로 기대되며 향후 소화율이 증가된 고품질 신품종 목초의 개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
조사료로서 소화율을 향상시킨 신품종 형질 전환 오차드그래스를 개발할 목적으로 lignin 합성경로에 있어서 중요한 효소 유전자 중의 하나인 COMT 유전자를 cloning하여 그 특성을 해명하였다. 오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성 유전자일 것으로 판단되었다. Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다. PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다. Dgcomt 유전자의 발현억제는 식물체의 목질화와 더불어 증가되는 lignin의 축적량을 감소시킬 것으로 기대되며 향후 소화율이 증가된 고품질 신품종 목초의 개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
To develop a new variety of orchardgrass with improved digestibility, caffeic acid O-methyltransferase (Dgcomt), which is a methylation enzyme involved in the early stages of lignin biosynthesis, was isolated and characterized. Dgcomt was expressed not only in leaves but also in stems and roots. The...
To develop a new variety of orchardgrass with improved digestibility, caffeic acid O-methyltransferase (Dgcomt), which is a methylation enzyme involved in the early stages of lignin biosynthesis, was isolated and characterized. Dgcomt was expressed not only in leaves but also in stems and roots. The expression levels of transcripts were high in stems and roots which are the most lignified tissues, and only moderate levels of transcripts were expressed in leaves. To develop transgenic orchardgrass plants by down-regulating the Dgcomt gene, an RNAi suppression vector with partial Dgcomt DNA fragment was constructed and transferred into the genome of orchardgrass via Agrobacterium-mediated gene transfer method. PCR and Southern blot analyses with genomic DNAs from putative transgenic plants revealed that the T-DNA region containing RNAi construct was successfully integrated into the genome of orchardgrass. Northern blot analysis revealed that the majority of the down-regulated transgenic lines showed significant reduction in Dgcomt gene expression. These RNAi transgenic orchardgrass will be useful for molecular breeding of new variety with improved digestibility by down-regulating lignin biosynthetic enzyme.
To develop a new variety of orchardgrass with improved digestibility, caffeic acid O-methyltransferase (Dgcomt), which is a methylation enzyme involved in the early stages of lignin biosynthesis, was isolated and characterized. Dgcomt was expressed not only in leaves but also in stems and roots. The expression levels of transcripts were high in stems and roots which are the most lignified tissues, and only moderate levels of transcripts were expressed in leaves. To develop transgenic orchardgrass plants by down-regulating the Dgcomt gene, an RNAi suppression vector with partial Dgcomt DNA fragment was constructed and transferred into the genome of orchardgrass via Agrobacterium-mediated gene transfer method. PCR and Southern blot analyses with genomic DNAs from putative transgenic plants revealed that the T-DNA region containing RNAi construct was successfully integrated into the genome of orchardgrass. Northern blot analysis revealed that the majority of the down-regulated transgenic lines showed significant reduction in Dgcomt gene expression. These RNAi transgenic orchardgrass will be useful for molecular breeding of new variety with improved digestibility by down-regulating lignin biosynthetic enzyme.
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문제 정의
따라서 조사료에 있어서 직접적인 소화율 저해인자인 동시에 사료영양가치를 저하시키는 주된 요인인 lignin의 함량이 낮은 고품질 목초및 사료작물 신품종 개발은 가장 시급하고도 필수적인 육종목표라 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 목초의 lignin 생합성 대사경로에 관련된핵심유전자의 하나인 caffeic acid O-methyltrans fferase의 발현을 조절하여 소화율이 높은 신품종 목초를 개발하고자 하였다.
조사료로서 소화율을 향상시 킨 신품종 형 질전환 오차드그래스를 개발할 목적으로 lignin 합성경로에 있어서 중요한 효소 유전자 중의하나인 COMT 유전자를 cloning하여 그 특성을해 명 하였다. 오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성유전자일 것으로 판단되었다.
제안 방법
RNAi 기법을 이용하여 오차드그래스의 Dgcomt 유전자의 발현을 억제시키고자, Dgcomt 유전자단편의 양 말단에 특정 제한효소 부위 BamHi, KprA, X"?I)를 PCR로 도입 한 다음 intron을 포함하는 RNAi 벡터인 pKANNIBAL 에 sense와 antisense 방향으로 각각 도입하였다 pKANNIBAL 벡터에 삽입된 RNAi Dgcomt cassette를 Notl으로 절단하여 hygromycin 선발표지를 가지는 pCAMBIA1300 벡터에 subcloning 하여 Dgcomt RNAi 발현벡터, pCAMicomt를 구축하였다<Fig. 4).
캘러스 유도배지 [MSaH지 (Mwashdge와 Skoog, 1962), 3 mg/L 2, 4-0 (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid), 0.1 mg/L BA (6-benzyladenine), 1 g/L casein hydrolysate, 1 mg/L thiamin-HCl, 100 mg/L myoinositol, 500 mg/L L-proline, 30 g/L sucrose, 5 g/L gelrite] 에 살균된 종자를 치상하여 24±2 ℃ 의 생장실에서 약광조건(150 pmol m'")으로 4주간 배양한 후 종자로부터 형성된 배발생 캘러스를 선발하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환에 이용하였다.
Dgcomt 유전자의 발현양상을 조사하기 위하여, Northern blot 분석을 실시하였다. 오차드그래스의 잎, 줄기 및 뿌리 조직으로부터 분리한total RNA를 formaldehyde agarose gel 전기영동하고 nylon membrane에 transfer한 다음 0.
오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성유전자일 것으로 판단되었다. Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다. PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다.
RNAi 발현벡터의 재분화된 오차드그래스 식물체 내에 RNAi 발현벡터의 도입을 확인하기 위하여 형질전환체로부터 genomic DNA를 분리한 후, 35S promoter의 3'-쪽의 sense primer와 sense 방향의 Dgcomt cDNA 단편의 anitisense primer를이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과, wild-type에서는 증폭산물이 검출되지 않았으나, 형질전환체의 경우 임의로 선발한 5개체 모두에서 예상크기와 동일한 0.
RNAi 형질전환체에 있어서 Dgcomt 유전자의 발현양상을 조사하기 위하여 형질전환 식물체 5개체의 줄기조직으로부터 total RNA를 분리한 후 Dgcomt probe를 이용하여 Northern blot 분석을 실시하였다. 그 결과 형질전환 식물체는 wild-type과 비슷한 발현량을 보이는 개체로부터 발현이 현저히 감소된 개체까지 다양한수준의 Dgcomt 유전자 발현정도를 나타내었다(Fig.
RT (reverse transcriptase)-PCR 반응은 분리한 mRNA를 oligo(dT) primer와 reverse transcriptase (RT)를 이용하여 cDNA로 전환시킨 다음, PCR 반응을 수행하였다. Taq DNA polymerase 반응 buffer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 9.
수행하였다. Taq DNA polymerase 반응 buffer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 9.0; 1.5 mM MgCU; 0.01% gelatin; 0.1% Triton X-100) 에 10 mM의 dNTP mix, 100 pmol의 sense 및 antisese primers, 그리고 2 units의 Taq DNA polymerase (Clontech, USA)를 첨가하여 수행하였다. PCR 증폭은 아래와 같이 3단계로 실시하였다.
구축된 pCAMicomt 발현벡터를 Agrobacterium EHA105 에 도입한 후, 오차드그래스의 종자유래캘러스에 감염시켜 공동배양 한 후, 형질전환식물체를 선발배지 에서 재분화시 켰다. RNAi 발현벡터의 재분화된 오차드그래스 식물체 내에 RNAi 발현벡터의 도입을 확인하기 위하여 형질전환체로부터 genomic DNA를 분리한 후, 35S promoter의 3'-쪽의 sense primer와 sense 방향의 Dgcomt cDNA 단편의 anitisense primer를이용하여 PCR 증폭을 실시하였다.
2) Ri-FwMoI primer (5'-ATCTCGAGCr GGCGATGACGCTCAAG-3')와 Ri-Rv-Kpnl primer (5'-ATGGTACCGTTGGGTGTGAGCCACTT-3') 를 사용하여 PCR 증폭한 다음 pKANNIBAL 벡터 (Wesley 등, 2001)의 35S promoter 하류에 sense 방향으로 도입하였다 Anitisense Dgcomt cDNA는 Ri-Fw-Xbal primer (5'-AATCTAGACTGGCGAT- GACGCTC AAG-3') 와 Ri-Rv-H dill primer (5'-ATAAGCTTGTTGGGTGTGAGCCACT T-3') 를 이용하여 증폭한 후 pKANNIBAL 벡터의 intron 하류에 도입하여 pKANicomt를 구죽하였다.구축된 pKAN icomt 벡터를 Notl으로 절단하여 35S-sense comt-intron-antisense comt-ocs terminator 단편을 분리한 다음 pCAMBIA 1300 벡터에 도입하여 pCAMicomt 벡터를 구축하였다(Fig. 4).
따라 실시하였다. 구축한 pCAMicomt 발현벡터를 도입한 Agrobacterium tumefaciens EHA105를 배양한 후, 배발생 캘러스에 감염시켰다. 감염된 캘러스를 hygromycin이 첨가된 재분화배지 (이 등, 2003)로 옮겨 식물체의 재분화를 유도한 다음 재분화된 shoot을 포함한 캘러스는 N6 배지 (Chu 등 1975)를 기초로 한 선발배지(250 mg/L cefotaxime, 25 mg/L hygromycin, 1 mg/L 2, 4-D, 3 mg/L BA, 1 g/L casein hydrolysate, 500 mg/L L-proline, 3 mg/L thiamine-HCl, 30 g/L sucrose, 5 g/L gelrite) 에 옮겨 6주간 배양하였다.
)의 잎과 줄기조직으로부터 total RNA를 분리하였다. 식물조직을 액체질소를 이용하여 파쇄한 다음 TRI reagent (MRC, USA)를 이용하여 total RNA< 분리하였으며, mRNA 분리는 total RNA로부터 oligotex mRNA kit (Quiagen, Germany)를 이용하여 제조회사의 지침에 따라 정제하였다.
오차드그래스의 COMT 유전자를 분리하기위하여, 이미 알려진 옥수수를 비롯한 화본과 식물 유래의 COMT cDNA의 염기서열을 비교하여 상동성이 높은 영역의 PCR primer를 합성하였다. 오차드그래스의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭한 결과 0.
2), 이를 Dgcomt로 명명하였다. 증폭된 DNA 단편을 COMT 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 발현벡터 구축에 이용하였으며, COMT 유전자의 발현 조사를 위한 probe로 사용하였다.
이론/모형
마지막 반응은 94℃에서 30초, 68℃에서 30초그리고 72℃에서 3분간으로 27 cycle을 수행하였다. Genomic DNA로부터 PCR 증폭은 이 등 (2004)의 방법에 준하여 실시하였다.
Genomic DNA를 각각의 제한효소로 절단한 다음, 0.8% agarose gel에서 전기영동한 후, nylon membrane 에 transfer 한 다음 hybridization 반응은 이 등 (2000)의 방법에 준하여 실시하였다. Northern blot 분석은 이 등 (2000)의 방법과 같이 total RNA를 1.
오차드그래스의 형질전환은 Hood 등 (1986)의 방법에 따라 실시하였다. 구축한 pCAMicomt 발현벡터를 도입한 Agrobacterium tumefaciens EHA105를 배양한 후, 배발생 캘러스에 감염시켰다.
성능/효과
Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다. PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다. Dgcomt 유전자의 발현억제는 식물체의 목질화와 더불어 증가되는 lignin의 축적량을 감소시킬 것으로 기대되며 향후 소화율이 증가된 고품질 신품종 목초의 개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
실시하였다. 그 결과 형질전환 식물체는 wild-type과 비슷한 발현량을 보이는 개체로부터 발현이 현저히 감소된 개체까지 다양한수준의 Dgcomt 유전자 발현정도를 나타내었다(Fig. 6).
RNAi 발현벡터의 재분화된 오차드그래스 식물체 내에 RNAi 발현벡터의 도입을 확인하기 위하여 형질전환체로부터 genomic DNA를 분리한 후, 35S promoter의 3'-쪽의 sense primer와 sense 방향의 Dgcomt cDNA 단편의 anitisense primer를이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과, wild-type에서는 증폭산물이 검출되지 않았으나, 형질전환체의 경우 임의로 선발한 5개체 모두에서 예상크기와 동일한 0.3 kb의 DNA 단편이 증폭되었다(Fig. 5). Dgcomt probe를 이용한 Southern blot 분석에서도 Dgcomt 유전자 특이적인 hybridization band를 나타내었다(결과 생략).
그 결과, 오차드그래스의 줄기와 뿌리조직에서 Dgcomt 유전자의 발현양이 높게 나타났으며, 잎에서의 발현은 이들 조직보다 다소 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Dgcomt 유전자가 식물체의 영양생장이 진행됨에 따라 잎조직에 비해 비교적 목질화가 빨리 일어나는 조직인 줄기와 뿌리에서 lignin의 생합성에 많이 관여하고 있다는 증거이며, Dgcomt 유전자가 식물에 있어서 lignin 생합성 과정에 있어서중요한 기능을 담당할 것으로 판단되는 결과이다.
9%의 높은 상동성을 각각 나타내었다. 따라서 본 실험에서 분리한 DNA 단편이 오차드그래스의 COMT 유전자의 일부임을 확인하였으며 (Fig. 2), 이를 Dgcomt로 명명하였다. 증폭된 DNA 단편을 COMT 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 발현벡터 구축에 이용하였으며, COMT 유전자의 발현 조사를 위한 probe로 사용하였다.
1). 또한 오차드그래스의 mRNA를 이용한 RT-PCR 증폭에서도 genomic PCR과 동일한 크기의 증폭산물을 나타내었다(결과 생략).
본 실험에서 개발한 형질전환 식물체 내에서 lignin 생합성 경로에 중요한 유전자 중 하나인 Dgcomt 유전자의 발현감소는 숙기가 진행됨에 따라 축적량이 증가하는 lignin 함량을 현저히감소시킬 수 있을 것으로 추측된다. 현재 이들 RNAi 형질전환 식물의 lignin 함량변화를 조사중에 있으며, 본 실험에서 확립한 기술은 소화율이 월등히 향상된 고사료가치 신품종 목초개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
명 하였다. 오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성유전자일 것으로 판단되었다. Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다.
오차드그래스의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭한 결과 0.3 kb의 증폭산물을 얻을 수 있었다(Fig. 1). 또한 오차드그래스의 mRNA를 이용한 RT-PCR 증폭에서도 genomic PCR과 동일한 크기의 증폭산물을 나타내었다(결과 생략).
나타났다. 이러한 결과는 Dgcomt 유전자가 식물체의 영양생장이 진행됨에 따라 잎조직에 비해 비교적 목질화가 빨리 일어나는 조직인 줄기와 뿌리에서 lignin의 생합성에 많이 관여하고 있다는 증거이며, Dgcomt 유전자가 식물에 있어서 lignin 생합성 과정에 있어서중요한 기능을 담당할 것으로 판단되는 결과이다. 옥수수에 있어서 리그닌 생합성 과정에 관여하는 유전자 중의 하나인 MCI (McCesAl) 경우에는 단지 뿌리에만 높은 발현을 보였으며, 알팔파, 담배 그리고 Stylosanthes humilis6^ 서의 COMT 유전자는 줄기에서 높은 발현을 나타내었다(Collazo 등, 1992; Gowri 등, 1991; Hayakawa 등, 1996; McIntyre 등, 1995).
증폭된 0.3 kb DNA 단편을 pGEM-T easy 벡터에 도입한 후 DNA 염기서열을 결정하여 분석한 결과, 오차드그래스로부터 증폭된 PCR 산물은 다른 식물 유래의 COMT 유전자와 높은 상동성을 나타내었으며, 특히 화본과 목초인 tall fescue (AF153823)와 perennial ryegrass (AF033538)의 COMT 유전자와는' 93.7%&} 90.9%의 높은 상동성을 각각 나타내었다. 따라서 본 실험에서 분리한 DNA 단편이 오차드그래스의 COMT 유전자의 일부임을 확인하였으며 (Fig.
후속연구
PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다. Dgcomt 유전자의 발현억제는 식물체의 목질화와 더불어 증가되는 lignin의 축적량을 감소시킬 것으로 기대되며 향후 소화율이 증가된 고품질 신품종 목초의 개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
따라서 lignin 함량이 많은 목초는 소화율을 감소시키고, 가용에너지 섭취를 저하시키며, 반추위 포만감만 증대시켜 건물섭취량을 감소시킴으로서 결과적으로 가축의 생산성을 감소시키는 결과를 초래한다. 그러므로 목초의 lignin 함량을 감소시킬 수 있다면 에너지 섭취율 증가에 따른 조사료의 영양가치 증가 뿐 아니라가축의 생산성 증대효과를 기대할 수 있을 것이다.
수 있을 것으로 추측된다. 현재 이들 RNAi 형질전환 식물의 lignin 함량변화를 조사중에 있으며, 본 실험에서 확립한 기술은 소화율이 월등히 향상된 고사료가치 신품종 목초개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.
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