선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 변화가 예상된다. 특히 hypoxia를 경험한 뇌세포에 정상 산소가 공급되면서 일어나는 세포 내 변화, 즉 다양한 신호 전달이나 성장 분화인 자의 변화를 cDNA RDA(representational difference analysis) 방법을 이용하여 분리하고자 하였다.
제안 방법
- 의 1999년 논문에 따라 수행되었다.'" normoxia와 hypoxia와 reoxygenation조건흐}의 성상 세포로부터 poly(A)+RNA를 분리하여 cDNA를 합성하였다. DpnII제한효소로 절단한 후, R-12/24-mer linker를 ligation하고 Klenow로 fill-in하였다.
- 300xg 에서 10분간 원심분리 한 후에 상등액은 제거하고 세포 침전물은 10% FBSt 포함한 DMEM 배지에 풀어서 175 cn? 세포 배양昌 플라스크에 배양하였다. 7~9일간 배양 후 밤새 shaker에서 흔들어서 microglia, oligodendrocyte등을 제거하고 10'5 M의 cystosine arabinoside를 48시간 동안 처리하여 남아있는 progenitor세포와 fibroblast# 제거 하였다.
- 이미 보고된 access No. AW144009는 N 말단기의 염기배열부분을 완성하기 위하여 cDNA 5' RACE를 수행하였다. PCR과 nested PCR을 수행하여 얻은 PCR 생성물, 300 bp와 500 bp를 pTBlue vector에 클로닝하여 염기배열을 결정하였다(Fig.
- 염기서열을 결정한 924 bp의 염기배열을 유전자뱅크인 NCBI에 Access No. AY800384로 등록하였으며 Gene Tool 프로그램을 이용하여 291개의 아미노산을 지닌 단백질로 전사되는 것을 추정하였다 (Fig. 3).
- Driver는 normoxia와 hypoxia 조건하에서 성상세포의 amplicon을 1:1 mi>하여 만들었고 tester 는 저산소조건 후 정상산소공급되는 reoxygenation 조건의 성상 세포의 amplicon에 두 번째 linker(J-linker)를 ligation하여 합성하였다. Hybridization 반응은 driver: tester 비율을 100:1로 하여 20시간 동안 진행하였다.
- Hypoxia chamber는 1% O2, 5% CO2)94% Ng의 저 산소 대기와 37℃의 온도로 유지되었다. Hypoxia에 노출 후 정상산소상태 (reoxygenation) 조건을 위해서는 48시간 hypoxiaS- 배양한 세포를 배양기에서 꺼내어 신선한 배지로 교체한 후 5% C(&의 일반 인큐베이터(21% 산소공급)에서 정해진 시간 동안 배양하였다.
- Meteorin이 출생한 후의 뇌의 성상세포에서 분리되었지만 뇌에서 Meteorin 유전자의 기능을 탐색하기 위하여 태어나기 전의 뇌에서 Meteorin 유전자의 발현의 변화를 조사하였다. Meteorin 유전자는 생쥐의 초기발생 10.
- AW144009는 N 말단기의 염기배열부분을 완성하기 위하여 cDNA 5' RACE를 수행하였다. PCR과 nested PCR을 수행하여 얻은 PCR 생성물, 300 bp와 500 bp를 pTBlue vector에 클로닝하여 염기배열을 결정하였다(Fig. 2). 그 결과, 전사시작 코돈 ATG 를 포함하는 N 말단기 염기배열을 완성하였으며 Fig.
- cDNA에 dCTP와 TdT로 반응시켜 polymeric tail을 형성시킨 후 AAP primer(5'-GGCCACGCGTC-GACTAGTACGGGHGGGUGGGUG-3')와 rat meteorin의 EST 중의 하나인 AW144009S] 염기배열을 기반으로 제조한 rMeteorin 프라이머 #l(5-CCATCCGTTCAGCGAAGACC-3')로 primary PCR반응을 수행하였다. PCR산물을 증폭시키기 위하여 nested PCR을 다시 수행하였다. 프라이 머로서는 AUAP(5'-GGCCACG-CGTCGACTAGTAC-3')와 rMeteorin 프라이 머 #2(5'-GCGCA-GACAGACGATGCTGGX 사용하였다.
- RNA 분리 및 RT-PCR - 발생 단계에 따른 유전자 발현 변화를 관찰하기 위하여 발생중인 ICR mouse의 대뇌를 꺼내어 Trizol Reagent(Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 산소 농도 변화에 따른 유전자 발현 관찰 실험을 위해서는 normoxia와 hypoxia 그리고 reoxygenation에 노출시킨 SD rat 성상 세포로부터 같은 방식으로 RNA를 분리하였다.
- 생후 2일 rat에서 성상세포를 분리 배양하여 cDNA를 제조하였다. cDNA에 dCTP와 TdT로 반응시켜 polymeric tail을 형성시킨 후 AAP primer(5'-GGCCACGCGTC-GACTAGTACGGGHGGGUGGGUG-3')와 rat meteorin의 EST 중의 하나인 AW144009S] 염기배열을 기반으로 제조한 rMeteorin 프라이머 #l(5-CCATCCGTTCAGCGAAGACC-3')로 primary PCR반응을 수행하였다. PCR산물을 증폭시키기 위하여 nested PCR을 다시 수행하였다.
- DpnII제한효소로 절단한 후, R-12/24-mer linker를 ligation하고 Klenow로 fill-in하였다. representative amplicone R-24-mer를 프라이머로 PCR하여 합성하였다. Driver는 normoxia와 hypoxia 조건하에서 성상세포의 amplicon을 1:1 mi>하여 만들었고 tester 는 저산소조건 후 정상산소공급되는 reoxygenation 조건의 성상 세포의 amplicon에 두 번째 linker(J-linker)를 ligation하여 합성하였다.
- 1에서 보이는 바와 같이 RT-PCR로 확인한 결과 normoxia에서 발현되는 rMeteorin이 hypoxia에서는 감소한 반면 reoxygenation 조건하에서는 그 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 따라서 rMeteorine 특히 reoxygenation상태에서 증가하는 유전자임을 확인하였으므로 전체 염기서열을 결정하고 유전자를 분리하기로 하였다.
- 상태이다. 따라서 본 연구실에서는 성상세포를 대상으로, hypoxia 이후 reoxygenation 상황에서 발현이 증가흐}는 유전자를 cDNA RDA 방법을 이용해 스크리닝하였고 그 중 아직까지 보고가 되어있지 않은 새로운 유전자를 클로닝하고 염기배열을 밝히는 작업을 수행하였다.
- 분리된 rMeteorin 유전자의 EST로 보고된 AW144009를 기준으로 프라이머를 합성하여 rMeteorin 발현의 산소 의존성 여부를 조사하였다. Fig.
- 분리된 성상세포를 normoxia와 hypoxia와 reoxygenation 조건에서 각각 배양하여 RNA를 분리하였다. 분리한 cDNA를 primer와 linker# 사용흐}.
- 산소 농도 변화에 따른 유전자 발현 관찰 실험을 위해서는 normoxia와 hypoxia 그리고 reoxygenation에 노출시킨 SD rat 성상 세포로부터 같은 방식으로 RNA를 분리하였다. cDNA 합성에는 5 瞄의 RNA 에 200 unit 의 M-MLV reverse transcriptase(Promega) 와 500 ng의 oligo-dT를 이용하였다.
- 염기배열을 분리하기 위하:여 cDNA RACE 방법을 이용하였다. 생후 2일째의 rat의 뇌에서 분리배양한 성상세포를 normoxia와 hypoxia 그리고 reoxygenation에 노출한 성상 세포에서 각각 cDNA를 분리하였다. 이미 보고된 access No.
- 프라이 머로서는 AUAP(5'-GGCCACG-CGTCGACTAGTAC-3')와 rMeteorin 프라이 머 #2(5'-GCGCA-GACAGACGATGCTGGX 사용하였다. 얻어진 PCR product# pT7Blue 벡터에 클로닝하여 rMeteorin의 전사시작 코돈 ATG를 포함한 전체염기배열을 결정흐}여 rMeteorin의 전체클로닝을 수행하였다.
- pT7Blue-2 벡터에 옮겼다. 유전자 동정을 위한 염기 배열 결정 반응은 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit(Perkin-Elmer)를 이용하여 T7프라이머로 수행되었고 ABI 373 sequencing machine(Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였다.
- 이를 하여 태어난 후 3일째 되는 rat의 대뇌에서 세포를 분리한 다음 성상세포로 분화 유도된 세포만을 사용하였다. 분리된 성상세포를 normoxia와 hypoxia와 reoxygenation 조건에서 각각 배양하여 RNA를 분리하였다.
- 흰쥐의 대뇌반구를 분리하여 meninges를 제거한 뒤 DMEM 배지에 넣고 0.25% trypsin/EDTA를 처리하여 파쇄 하였다. 300xg 에서 10분간 원심분리 한 후에 상등액은 제거하고 세포 침전물은 10% FBSt 포함한 DMEM 배지에 풀어서 175 cn? 세포 배양昌 플라스크에 배양하였다.
대상 데이터
- SPF(specific pathogen-free) Sprague-Dawley(SD) rat과 ICR mouse는 대한 바이오링크(주)에서 구입하였다.
- 산소 농도 변화에 따른 유전자 발현 관찰 실험을 위해서는 normoxia와 hypoxia 그리고 reoxygenation에 노출시킨 SD rat 성상 세포로부터 같은 방식으로 RNA를 분리하였다. cDNA 합성에는 5 瞄의 RNA 에 200 unit 의 M-MLV reverse transcriptase(Promega) 와 500 ng의 oligo-dT를 이용하였다. PCJR] 사용된 프라이머 염기 배열은 다음과 같다.
- 사용하였다. 생후 2일 rat에서 성상세포를 분리 배양하여 cDNA를 제조하였다. cDNA에 dCTP와 TdT로 반응시켜 polymeric tail을 형성시킨 후 AAP primer(5'-GGCCACGCGTC-GACTAGTACGGGHGGGUGGGUG-3')와 rat meteorin의 EST 중의 하나인 AW144009S] 염기배열을 기반으로 제조한 rMeteorin 프라이머 #l(5-CCATCCGTTCAGCGAAGACC-3')로 primary PCR반응을 수행하였다.
- 세포 배양 - 성상세포 (primary rat astrocyte) 배양은 생후 2 일째의 Sprague-Dawley rat 또는 ICR mouse를 사용하였다. 흰쥐의 대뇌반구를 분리하여 meninges를 제거한 뒤 DMEM 배지에 넣고 0.
- 25% trypsin/EDTA를 처리하여 파쇄 하였다. 300xg 에서 10분간 원심분리 한 후에 상등액은 제거하고 세포 침전물은 10% FBSt 포함한 DMEM 배지에 풀어서 175 cn? 세포 배양昌 플라스크에 배양하였다. 7~9일간 배양 후 밤새 shaker에서 흔들어서 microglia, oligodendrocyte등을 제거하고 10'5 M의 cystosine arabinoside를 48시간 동안 처리하여 남아있는 progenitor세포와 fibroblast# 제거 하였다.
- PCR산물을 증폭시키기 위하여 nested PCR을 다시 수행하였다. 프라이 머로서는 AUAP(5'-GGCCACG-CGTCGACTAGTAC-3')와 rMeteorin 프라이 머 #2(5'-GCGCA-GACAGACGATGCTGGX 사용하였다. 얻어진 PCR product# pT7Blue 벡터에 클로닝하여 rMeteorin의 전사시작 코돈 ATG를 포함한 전체염기배열을 결정흐}여 rMeteorin의 전체클로닝을 수행하였다.
이론/모형
- rat의 성상세포에서 산소의존적인 유전자로 분리된 단편의 완전한 염기배열을 분리하기 위하:여 cDNA RACE 방법을 이용하였다. 생후 2일째의 rat의 뇌에서 분리배양한 성상세포를 normoxia와 hypoxia 그리고 reoxygenation에 노출한 성상 세포에서 각각 cDNA를 분리하였다.
- 의 염기배열을 결정하고 유전자를 얻기 위하여 5' RACE 방법 (Invitrogen)을 사용하였다. 생후 2일 rat에서 성상세포를 분리 배양하여 cDNA를 제조하였다.
성능/효과
- Fig. 1에서 보이는 바와 같이 RT-PCR로 확인한 결과 normoxia에서 발현되는 rMeteorin이 hypoxia에서는 감소한 반면 reoxygenation 조건하에서는 그 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 따라서 rMeteorine 특히 reoxygenation상태에서 증가하는 유전자임을 확인하였으므로 전체 염기서열을 결정하고 유전자를 분리하기로 하였다.
- mouse 뇌에서 성상세포를 분리하여 mMeteorin(mouse Meteorin) 유전자의 산소의존도를 RT-PCR을 이용하여 조사한 결과에서도 hypoxia에 노출한 다음 nomoxia조건에 다시 노출시킨(R) 성상세포에서 mMeteorin유전자의 발현이 증가함을 확인하였다(Fig. 5, upper).
- 2). 그 결과, 전사시작 코돈 ATG 를 포함하는 N 말단기 염기배열을 완성하였으며 Fig. 3에서와 같은 염기배열과 아미노산 배열을 결정하였다. 염기서열을 결정한 924 bp의 염기배열을 유전자뱅크인 NCBI에 Access No.
후속연구
- 특히 인접하게 존재하는 성상세포와 신경세포와 혈관세포는 긴밀한 상호작용의 가능성을 고려해 볼 때 Meteorine 뇌 초기 발생 중에서도 발현이 증가되므로 뇌세포의 발생단계에서 성상 세포뿐만 아니라 신경세포와 혈관세포의 성장분화에 관여하리라 생각된다. 또한 병리학적측면에서도 microglia 세포의 증가와 성상 세포의 활성화과정에서 Meteorin의 역할을 앞으로 규명하여야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.