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문제 정의
- 본 연구는 감자가 공산업에서 가장 중요한 원료의 안정적 생산과 공급을 위해 국내 감자 생산지의 식물기생선충에 대한병해충 관리체계 확립에 필요한 기초자료를 제공코자 국내 주요 감자재배지의 토양을 채집하여 식물기생선충의 분포를 밝히는 데 목적을 두었다.
제안 방법
- 위해 제한효소 Dra I을 사용하였다. 5-10 units의 제한효소와 각각의 reaction buffer, PCR product를 섞은 후 최종적으로 증류수를 첨가하여 20로 조절하여 37℃water bath에서 1시간 동안 처리하여 충분한 효소활성 시간을 유지시킨 후, 그 결과는 1% agarose gel electrop-horesis를 통해 확인하였다.
- 적정 PCR 조건은 95 ℃에서 denaturation(l min), 58℃에서 annealing(2 min), 72℃에서 extension(3 min)의 기본 35 cycle과 초기 95℃, denaturation(5 min), 마지막 72℃extension(10 min)을 실시하였다. PCR program은 DNA thermal cycler(Biometra, UNOII) 에서 수행되었으며, PCR products(5 ㎕)는 1% agarose gel electrophoresis를 통하여 확인하였다.
- PCR에서 증폭된 DNA 패턴이 500 bp의 당근뿌리혹선충 특성을 나타내었으므로 컬럼비 아 뿌리 혹선충과의 구분을 위해 제한효소 Dra I을 사용하였다. 5-10 units의 제한효소와 각각의 reaction buffer, PCR product를 섞은 후 최종적으로 증류수를 첨가하여 20로 조절하여 37℃water bath에서 1시간 동안 처리하여 충분한 효소활성 시간을 유지시킨 후, 그 결과는 1% agarose gel electrop-horesis를 통해 확인하였다.
- 선충을 분쇄하기 위해서 끝을 불꽃으로 동그랗게 봉합한 플라스틱 피펫팁으로 가능한 한 섬세한 입자로 갈아준 다음, 3 ㎕를 PCR tube에 옮겨 다른 PCR reagent와 섞어준 후 즉시 PCR을 시행하였다. PCR을 위해서는 PCR buffer(10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 9.0), 250 dNTP, 각각 0.05 pM primer, 1.0 U Taq DNA polymerase(TaKaRa Bio Inc. Shiga, Japan), 그리고 2 pl DNA template# 혼합한 총 50를 반응에이용하였다. 증폭하고자 하는 mitoc hondrial DNA 중 COII(Cytochrome oxygenase II) 와 Lr- RNA(Large ribosomal RNA subunit) 의 구간은 forward primer 5' -GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3'와 rev erse primer 5' - TACCTITGACCAATCACGCT-3' 를 첨가하여 증폭하였다.
- 채집하였다. 농가별로 약 IQOOcc의 토양을 채집하여 실험실로 운반한 후 4 ℃냉장고에 보관하면서 토양 내의 선충을 분리하였다. 토양 시료를 잘 혼합한 후 100 cc를 취하여 Combined sieving & centrifugation method로 선충을 분리하였으며 FG-4:1 용액으로 고정하였다.
- 뿌리 혹선충 암컷으로부터의 DNA 분리는 nuclease-free water(Promega Co., Madison, WI)에 물리적으로 선충을 갈아주어 즉시 PCR의 template로 이용하는 간단한 방법을 이용하였다(Han et al., 2004).암컷선충은 살균된 증류수로 여러 번 헹구어 표면을 깨끗하게 씻어주었다.
- , Madison, WI)로 미리 채워둔 multicell plate(Nalgen Nunc International, Rochester, NY)로 옮겼다. 선충을 분쇄하기 위해서 끝을 불꽃으로 동그랗게 봉합한 플라스틱 피펫팁으로 가능한 한 섬세한 입자로 갈아준 다음, 3 ㎕를 PCR tube에 옮겨 다른 PCR reagent와 섞어준 후 즉시 PCR을 시행하였다. PCR을 위해서는 PCR buffer(10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.
- 토양 시료를 잘 혼합한 후 100 cc를 취하여 Combined sieving & centrifugation method로 선충을 분리하였으며 FG-4:1 용액으로 고정하였다. 선충의 종류 및 밀도 조사는 해부현미경 하에서 실시하였다.
- Shiga, Japan), 그리고 2 pl DNA template# 혼합한 총 50를 반응에이용하였다. 증폭하고자 하는 mitoc hondrial DNA 중 COII(Cytochrome oxygenase II) 와 Lr- RNA(Large ribosomal RNA subunit) 의 구간은 forward primer 5' -GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3'와 rev erse primer 5' - TACCTITGACCAATCACGCT-3' 를 첨가하여 증폭하였다. 적정 PCR 조건은 95 ℃에서 denaturation(l min), 58℃에서 annealing(2 min), 72℃에서 extension(3 min)의 기본 35 cycle과 초기 95℃, denaturation(5 min), 마지막 72℃extension(10 min)을 실시하였다.
- 농가별로 약 IQOOcc의 토양을 채집하여 실험실로 운반한 후 4 ℃냉장고에 보관하면서 토양 내의 선충을 분리하였다. 토양 시료를 잘 혼합한 후 100 cc를 취하여 Combined sieving & centrifugation method로 선충을 분리하였으며 FG-4:1 용액으로 고정하였다. 선충의 종류 및 밀도 조사는 해부현미경 하에서 실시하였다.
대상 데이터
- 감자재배지에 분포하는 뿌리혹선 충류의 PCR을 이용한 정밀동정을 위해 2004년과 2005년에 채집한 토양 일부를 토마토에 접종하여 배양 후 지역별로 2-22마리의 신선한암컷을 분리하였는데 PCR동정에 사용된 5개 지역시료의 선충채집지 및 조사 시기는 각각 북제주군대 정읍 신평리('04년 11월), 대정읍 상모리('04년11월), 남제주 군 성산읍 수산리('05년6월), 밀양읍 수산리('04년11월) 및 고령군 개진읍('05년 7월)이었다.
- 국내 감자 주산지인 제주, 충남 예산, 경북 김천 및 고령, 강원도 홍천 및 평창에서 감자생육 기간 중인 2005년 5월에서 8월 사이에 감자괴경 주위의 토양을 채집하였다. 농가별로 약 IQOOcc의 토양을 채집하여 실험실로 운반한 후 4 ℃냉장고에 보관하면서 토양 내의 선충을 분리하였다.
- 나선선충류(Helichotylenchus sp.)는 제주지 역 24개 시료 중 11개 시료와 김천의 1개 시료에서 검출되었다(Table 1). 제주지역에서 평균 밀도는 토양 100 cc 당 19마리로 낮았다.
- 본 연구는 (주)오리온스넥 인터내셔널의 지원으로 수행되었으며 실험을 도와준 고령지 농업연구소 자원식물연구실원들과 최미숙 연구원에게 감사드린다.
- 뿌리 혹선충의 정밀 동정을 위해 감자 주산지인 제주, 김제, 밀양, 남원, 예산, 강릉, 홍천, 인제, 김천, 고령 지역의 감자재배지에서 2004년 11월부터 2005년 8월까지 토양을 채집하였다. 채집한 토양은 4℃냉장고에 보관하다가 뿌리혹선충 배양용 기 주식물인 토마토(Lycopersicon esc-ulentum Mill.
- 조사한 결과는 Table 1과 같다. 제주지역 24개 재배지에서는 13개 시료에서 뿌리혹선 충 유충이 검출되었다. 평균 밀도는 11.
- 채집하였다. 채집한 토양은 4℃냉장고에 보관하다가 뿌리혹선충 배양용 기 주식물인 토마토(Lycopersicon esc-ulentum Mill. cv. Sweet) 4주묘의 뿌리 주변에 접종하였다. 접종 후 15 cm 화분에 심어온실내에서 재배하다가 7-8주 후에 뿌리를 수확하였다.
성능/효과
- 1). 500 bp의 PCR 산물에 제한효소 Dra I을 처 리 한결과5개 시료에서 모두 290 bp 및 230 bp의 단편이 검출되었다(Fig. 2). 컬럼비아뿌리혹선충(M chitwoodi)의 경우 500 bp의 PCR 산물이 Dra I 제한효소 처리시 290, 130 및 100 bp의 단편으로 나누어진다(Powers and Harris, 1993).
- 감자재배에서 문제가 될 수 있는 뿌리썩이선충류(Pra-tylenchus sp.)는 제주지역에서 24개 시료 중 12개 시료에서 검출되어 빈도가 높았다(Table 1). 평균 밀도는 토양 100cc 당 14마리로 낮았으며 시료 중 밀도가 높은 경우에는 64마리인 경우도 있었다.
- 2). 감자재배지 토양에서 선충을 분리한 결과에서는 50개 시료 중 30개 시료에서 뿌리혹선충이 검출되어 60%의 검출율을 보였으나(Table 1) 선충 정밀동정을 위해 채집한 토양을 뿌리에 접종하여 뿌리혹 형성 여부를 조사한 결과는 약 12%로 낮게 나타났다(Table 2). 이러한 결과는 감자재배지의 뿌리혹선충의 밀도가 높지 않았고(Table 1) 일부 토양시료는 냉장고 내 보관 기간이 약 8개월 정도로 유충의 활력이 낮아 토양 접종에 의한 뿌리로의 침투 성공률이 낮았기 때문으로 생각된다.
- 컬럼비아뿌리혹선충(M chitwoodi)의 경우 500 bp의 PCR 산물이 Dra I 제한효소 처리시 290, 130 및 100 bp의 단편으로 나누어진다(Powers and Harris, 1993). 따라서 본조사에서 채집된 감자재배지의 뿌리혹선중은 PCR-RFLP로 동정한 결과 모두 당근뿌리혹선충 (Meloidogyne hapla)으로 확인되었다(Figs. 1, 2).
- 본 조사에서 감자재배에 문제가 될 수 있는 선충인 뿌리혹선충은 2005년에 채집한 6개 지역 모두에서 그리고 전체 50개 시료 중 30개 시료에서 검출되었는데 밀도는 대체로 낮게 나타나 실제 감자 생산에 영향을 줄 정도는 아닌 것으로 생각된다. 미국의 감자재배지에서 문제가 되고 있는 컬럼비아뿌리 혹선충(M.
- 뿌리혹선충은 적당한 온도 조건에서 약 4주 만에 한세대를 완료하여 증식이 가능하나 우리나라에서 노지 재배하는 감자는 생육기간이 약 90일 내외로 짧고 노지상태에서 선충 증식에유리한 온도 조건이 제공되지 않으므로 시설작물의 경우처럼 뿌리혹선충이 높은 밀도로 증가하기는 어려운 것으로 사료된다. 본 조사에서 나타난 것처럼 낮은 밀도일경우 실제 감자에 피해 정도도 낮은 것으로 생각되며 토양채집 시 재배 농민들과의 면담에서도 노지의 경우 뿌리혹선충의 피해는 별로 문제되지 않는 것으로 나타났다.
- 본 조사에서는 국내 주요 감자재배지에 뿌리혹선충류가 우점종으로 분포하고 있으며 정밀동 정 결과 당근뿌리혹선충(M. hapla) 1종인 것이 확인되었다. 최근 국가간 농산물 교역의 증가로 외국으로부터 각종 종자, 유묘, 묘목 등 다양한식물체가 수입되고 있으며 특히 외국의 감자생산국들에서 문제가 되고 있는 컬럼비아뿌리혹선충(M chitwoodi)과씨스트선충류(GZobodera spp.
- 비 기생성선충인 Dorylaimus 속선충은 전체 50개 시료중 22개, 부식성선충은 49개 시료에서 검출되었다. 부식성선충은 지역별 평균 밀도가 토양 lOOcc 당 73-450마리까지 다양하게 나타났다 부식성선충은 토양 내에서 분해자로서 역할을 수행하여 감자에는 영향이 없으며 대체적으로 비옥하거나 유기물이 많은 토양에서 밀도가 높게 나타난다.
- 뿌리혹선 충류의 PCR 동정에 일반적으로 이용되는 C2F3 및 1108 두 개의 primer를 사용하여 mtDNA를 증폭한결과 5개 시료에서 모두 500 bp의 결과물을 얻을 수 있었다(Fig. 1). 500 bp의 PCR 산물에 제한효소 Dra I을 처 리 한결과5개 시료에서 모두 290 bp 및 230 bp의 단편이 검출되었다(Fig.
- 전국 12개 주요 감자재배지에서 2004년 11월부터 2005년 8월 사이에 채집한 토양을 토마토에 접종하여 뿌리혹선충에 의한 뿌리혹 형성 여부를 조사한 결과 전체 108개 시료 중 13개 시료에서 뿌리혹선충의 증식이 확인되었다 (Table 2). 감자재배지 토양에서 선충을 분리한 결과에서는 50개 시료 중 30개 시료에서 뿌리혹선충이 검출되어 60%의 검출율을 보였으나(Table 1) 선충 정밀동정을 위해 채집한 토양을 뿌리에 접종하여 뿌리혹 형성 여부를 조사한 결과는 약 12%로 낮게 나타났다(Table 2).
- 제주지역에서 평균 밀도는 토양 100 cc 당 19마리로 낮았다. 줄기 구근선충류인 Ditylenchus 속선충은 제주에서 13개 시료, 예산에서 1개, 고령에서 5개, 홍천에서 1개, 평창에서 3개 시료에서 검출되었으나 밀도는 토양 100cc 당 2-48 마리 정도로 낮았다. 참선충류인 Tylenchus 속 선충은 전체 50개 시료 중 7개에서, 위축선 충류인 Tylenc-horhynchus 속선충은 4개 시료에서 검출되었으나 평균밀도가 토양 lOOcc 당 각각 7-16 마리, 11-17 마리로 낮아 감자에 피해가 나타날 정도는 아닌 것으로 생각된다.
- 줄기 구근선충류인 Ditylenchus 속선충은 제주에서 13개 시료, 예산에서 1개, 고령에서 5개, 홍천에서 1개, 평창에서 3개 시료에서 검출되었으나 밀도는 토양 100cc 당 2-48 마리 정도로 낮았다. 참선충류인 Tylenchus 속 선충은 전체 50개 시료 중 7개에서, 위축선 충류인 Tylenc-horhynchus 속선충은 4개 시료에서 검출되었으나 평균밀도가 토양 lOOcc 당 각각 7-16 마리, 11-17 마리로 낮아 감자에 피해가 나타날 정도는 아닌 것으로 생각된다.
- )는 제주지역에서 24개 시료 중 12개 시료에서 검출되어 빈도가 높았다(Table 1). 평균 밀도는 토양 100cc 당 14마리로 낮았으며 시료 중 밀도가 높은 경우에는 64마리인 경우도 있었다. 다른 지역 시료에서는 예산에서 1개, 고령에서 1개 시료에서 뿌리썩이 선충이 검출되었으나 밀도는 역시 토양 100cc 당 6-10마리로 비교적 낮았다.
후속연구
- 다른 지역 시료에서는 예산에서 1개, 고령에서 1개 시료에서 뿌리썩이 선충이 검출되었으나 밀도는 역시 토양 100cc 당 6-10마리로 비교적 낮았다. 그러나뿌리썩이 선충은 식물 뿌리 내부 기생선충이므로 토양내 밀도가 낮다고 하더라도 뿌리 내부에서는 상당한 피해를 초래할 수 있으므로 이에 대한 정밀한 조사와 방제 대책 마련이 필요한 것으로 생각된다
- hapla) 1종인 것이 확인되었다. 최근 국가간 농산물 교역의 증가로 외국으로부터 각종 종자, 유묘, 묘목 등 다양한식물체가 수입되고 있으며 특히 외국의 감자생산국들에서 문제가 되고 있는 컬럼비아뿌리혹선충(M chitwoodi)과씨스트선충류(GZobodera spp.)의 국내 발생이 우려되고 있을 뿐만 아니라 지구 온난화 및 작물별 재배작형 변화에 따라 국내의 식물기 생선충 분포상에도 변화가 나타날 것으로 예상된다 따라서 추후 지속적인 모니터링을 통해 국내 감자재배지에 분포하는 식물기생 선충류, 특히 문제가 될 수 있는 뿌리혹선 충류의 종류 및 밀도 조사가 이루어져 감자의 안정적 생산을 위한 기초자료로 제공되어야 할 것으로 생각된다.
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