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문제 정의
- glutathione peroxidase등의 항산화 효소는 톨루엔에 의해서 매개되어지는 ROS를 효율적으로 잘 제거할 수 있다(3). 유해 유기화합물에 노출되었을 때 방지 시스템과, 항산화 효소에 관련 메카니즘, 휘발성 유기 화합물에 의해서 야기되는 현상을 분석 파악하여 제거하고, 유해 유기화합물의 산화를 여러 산화 방지 효소들에 의해서 제거하는기작들을 적용해서, 이와 관련된 폭넓은 연구의 기초를 수립하고자 하는 실험을 수행하고자 한다. 산화 환원 메카니즘에 관련된 유전자를 선별하기 위해서 유용한 2-D 전기영동 방법을 사용했고, VOC를 세포내에 직접 처리하기보다, 이러한 유해 유기 화합물에 의해서, 1차적으로 발생해서, 신호 전달 매체가 되며, 유전자 조절 작용의 개시가 되는 H2O2에 의해 발현되어지는 단백질을 분석하였다.
- 최근 보고에 따르면, NDPK는 다양한 신호 전달 경로에 관련된 단백질들과 연관되어 지며 미토콘드리아 단백질인, GAPDH, DnaK, heat stress proteins들이 산화적 스트레스 조건하에서 이 단백질의 활성을 조절하는 것에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 효모 NDPK에 관한 연구는 현재까지는 보고된 바 없다는 점에 착안하여, 이러한 사실들을 토대로, NDPK의 산화적 기작에 관한 연구를 수행 하고자 하였다(13, 14).
제안 방법
- 발현의 변화를 보이는 단백질들을 mass로 elution 한 후, MALDI-TOF MS 분석으로 분석해 본 결과 양이 부족한 단백질 조각은 분석이 불가능하였으며, 그 외 6개의 효소에 대한결과와 고찰을 수행하였다. Fig. 2와 Table 1에서 보는 바와 같이 Cprlp와, Hsp의 크기는 동일하며, 이 사이즈를 1로 표시했을 때의 상대적인 크기를 비교하였다.
- 분석 한다. IEF glass tube (5 mm inner diameter, 20 cm lengths) 내에서 분석하며, IEF gel mixture는 4.5% w/v acrylamide solution, 9.5 M urea, 2% v/v NP-40, and 2.5% v/v carrier ampholytes (pH 3-10 : pH 5-8 : pH 4-6.5 = 1 : 2.5 : 3.5)로 구성 되어 진다. SDS-PAGE를 12.
- S. cerevisiae genome database (SGD, Stanford University) 로부터 YNK의 유전자 염기서열을 획득한 후, 왼쪽과 오른쪽 am 은 YNK-URA, 프라이 머를 사용하고, pVT-U 벡 터 의 URA3 프라이머를 (YNK forward primer 5'atcagggcgccattcgcc-(UR4 overhang arm)-cgtctgtcacggcagtg-3'와 reverse primer 5, -gcacgtcgcatccccgg- (URA arm)-taagcccctctggacac-3') 각각 사용하여 PCR 방법에 의하여 증폭시켜, YNK 유전자를 치환하여 W303a에 도입하였다. YNK의 앞쪽과 뒤쪽 사이트의 .
- YNK에 의해서 조절되어지는 산화적 스트레스에 대한 발현패턴이 변화될 수 있는 단백질의 유무를 알아보기 위하여, YNK 유전자가 제거된 효모 시스템을 구축하였다. knock out (KO) mutant는 정상적인 효모 균주의 YNK 위치에 URA3를 대치해 넣은 후, 검정을 위해서 Northern과 Southern bloting에 의해서, YNK가 deletion 되어졌는지 확인하였다.
- 유전자가 제거된 효모 시스템을 구축하였다. knock out (KO) mutant는 정상적인 효모 균주의 YNK 위치에 URA3를 대치해 넣은 후, 검정을 위해서 Northern과 Southern bloting에 의해서, YNK가 deletion 되어졌는지 확인하였다. YNK가 deletion 되어진 균주는 ^ynk 라 명명한다.
- 두 종류의 정상적인 효모세포와, △ynk를 가지고, 5 mM 压6을 각각 처리한 후, 2-D 전기영동을 수행하였다(Fig. 2). 최근 발표한 논문에(6) 의 하면, 5 mM의 농도의 과산화수소를 처리했을 때 구조적 변화를 가져오기 때문에 이 농도를 처리하였고, 정상 균주에 과산화수소를 처리했을 때의 단백질 발현 변화된 것과, Aynk의 결과와 비교분석하기 위해 2-D 전기영동을 수행한 결과, 10개 이상의 변화된 spot을 관찰할 수 있었다.
- 최근 발표한 논문에(6) 의 하면, 5 mM의 농도의 과산화수소를 처리했을 때 구조적 변화를 가져오기 때문에 이 농도를 처리하였고, 정상 균주에 과산화수소를 처리했을 때의 단백질 발현 변화된 것과, Aynk의 결과와 비교분석하기 위해 2-D 전기영동을 수행한 결과, 10개 이상의 변화된 spot을 관찰할 수 있었다. 발현의 변화를 보이는 단백질들을 mass로 elution 한 후, MALDI-TOF MS 분석으로 분석해 본 결과 양이 부족한 단백질 조각은 분석이 불가능하였으며, 그 외 6개의 효소에 대한결과와 고찰을 수행하였다. Fig.
- 유해 유기화합물에 노출되었을 때 방지 시스템과, 항산화 효소에 관련 메카니즘, 휘발성 유기 화합물에 의해서 야기되는 현상을 분석 파악하여 제거하고, 유해 유기화합물의 산화를 여러 산화 방지 효소들에 의해서 제거하는기작들을 적용해서, 이와 관련된 폭넓은 연구의 기초를 수립하고자 하는 실험을 수행하고자 한다. 산화 환원 메카니즘에 관련된 유전자를 선별하기 위해서 유용한 2-D 전기영동 방법을 사용했고, VOC를 세포내에 직접 처리하기보다, 이러한 유해 유기 화합물에 의해서, 1차적으로 발생해서, 신호 전달 매체가 되며, 유전자 조절 작용의 개시가 되는 H2O2에 의해 발현되어지는 단백질을 분석하였다.
- 산화 환원 신호 체제에 관여될 것으로 보는 NDPK의 역할을 좀 더 구체적으로 연구 접근하는 과정을 기초로, 보다 단순한 시스템을 통해서, 복잡한 신호 전달 매체 단백질을 탐색하고자, S. cerevisiea를 사용하였고, 효모 게놈 상에서 한 개의 NDPK 유전자를 동정하였고 YNK라 명명하였다. 우리는 정상적인 효모 균주와 NDPK가 파괴되어진 zvynk를 구축한 후에 H2O2를 처리한 후 조절되어지는 단백질 profile을 비교해보았다.
- cerevisiea를 사용하였고, 효모 게놈 상에서 한 개의 NDPK 유전자를 동정하였고 YNK라 명명하였다. 우리는 정상적인 효모 균주와 NDPK가 파괴되어진 zvynk를 구축한 후에 H2O2를 처리한 후 조절되어지는 단백질 profile을 비교해보았다. 이 연구를 통해서, 우리는 산화적 스트레스에 처한 세포 내에서 NDPK에 의해서 조절되어진다고 예상되어지는 redox 조절 단백질 몇 개를 찾을 수 있었다.
- 015 jig/ml 이 되도록 trypsin (Promega)으로 peptide를 자른다. 자른 조각으로 MALDI-TOF MS를 수행하며 펩티드 염기서열분석 후에 데이터를 분석한 결과로 도출된 스펙트라는 NCBI non-redundant database using Mascot (Matrix Science) 에 의 해 서어떤 단백질인지 검색한다.
- 데이터로 보여주진 않았지만 YNK를 KO시킨 효모는 kinase 활성이 현저히 떨어지는 것을 TLC판에서, NDPK 활성 측정 방법에 의해서 검증할 수 있었다. 재조합된 유전자적 유사성을 바탕으로 치환된 Aynk 구축 전략을 나타낸 모식도에서 (Fig. 1), URA3를 YNK가들어가 있는 자리를 대신 인식하도록 primer를 재구성시켜, URA3가 들어가 있는 균주만 자랄 수 있는 SC-URA 배지에서 선택적 선별을 수행하였다.
- 정상 균주와 Aynk는 YPD 배지에서 24시간 동안 계대 배양했으며, 지수 생장기 중간 (흡광도 600nm에서 OD값이 0.4-0.5 될 때)까지 키 운 후, 5 mM H2O2 를 처 리 한 후, 30 °C 에 서 2시 간더 배 양하였다. 4, 000 rpm에서 효모균주를 각각 원심분리 시 킨후, 멸균된 증류수로 씻어준 다음 상등액은 버리고, 효모 균주만 모아서 protein extraction buffer (200 mM Tris pH 8.
- 최근의 연구에 의하면 열이나, 산화적 스트레스에 대해서 NDPK는 구조적 인 변화를 유발하며, 효소 활성 과 구조가 oxidant 에 의해 변화된다는 보고를 근거로 하여 정상적인 효모 균주와 효모의 NDPK유전자가 파괴된 mutant에서, 산화적 스트레스에 관련된 역할을 규명하고자 2-D 전기영동 방법을 통해서, H2O2 의 처리전과 처리 후에 전사패턴이 변화된 유전자들, 즉, 산화적조절 신호체제에 연관되어졌을 것이라고 생각되어지는 몇 개의 단백질 리스트를 얻었다. 이 결과는 NDPK의 redox state의 조절에 관련된 효소의 성질을 규명함에 있어 유용한 유전자 신호 체제정보를 제공할 것으로 생각되어진다.
대상 데이터
- YNK의 앞쪽과 뒤쪽 사이트의 .프라이머를 (YNK5' upstream (+569bp)-5'tggaagctgaaacgcaaggattg3‘과 YNK3' down stream (-515bp)-5 'atagtccaagggcgatgaactac3') 사용하였다.
이론/모형
- 수행하였다. 2-D 전기영동 겔은 고정 후, 은 염색법을 수행하였다. 1시간동안 50% v/v MeOH에 담군 후 건조하고, 두장의 셀로판지사이에서 건조시킨다.
- 2-D 전기영동은 Kim(18)에 의해서 사용되어진 방법을 기초로 분석 한다. IEF glass tube (5 mm inner diameter, 20 cm lengths) 내에서 분석하며, IEF gel mixture는 4.
- Saccharomyces cerevisiae, W303-la를 사용하며 (AM7a ura3-l leu2-3, 112 his3-ll, 15 ade2-l trpl-1 canllOO) (15), 배양 배지와조건은 Sherman(16)의 연구를 따랐으며, 효모의 형 질전환 방법은 Elble의 lithium acetate 방법 (17)을 사용하였다.
성능/효과
- Hsp과 Cprlp(Fig. 3)는 정상 균주에 대해서 玦。2를 처 리 하여 ROS를 발생 시 킨 결과, 2배 에 서 3배 이 상의단백질 발현 현상을 보였으나, Aynk의 경우는 그 변화가 미비하였다. 이러한 결과를 살펴볼 때 이 두 효소는 YNK에 대해서직접적, 간접적으로 down stream 쪽에서 조절 받는 단백질일 것으로 예상되어진다.
- YNK가 deletion 되어진 균주는 ^ynk 라 명명한다. 데이터로 보여주진 않았지만 YNK를 KO시킨 효모는 kinase 활성이 현저히 떨어지는 것을 TLC판에서, NDPK 활성 측정 방법에 의해서 검증할 수 있었다. 재조합된 유전자적 유사성을 바탕으로 치환된 Aynk 구축 전략을 나타낸 모식도에서 (Fig.
- 우리는 정상적인 효모 균주와 NDPK가 파괴되어진 zvynk를 구축한 후에 H2O2를 처리한 후 조절되어지는 단백질 profile을 비교해보았다. 이 연구를 통해서, 우리는 산화적 스트레스에 처한 세포 내에서 NDPK에 의해서 조절되어진다고 예상되어지는 redox 조절 단백질 몇 개를 찾을 수 있었다.
- 2). 최근 발표한 논문에(6) 의 하면, 5 mM의 농도의 과산화수소를 처리했을 때 구조적 변화를 가져오기 때문에 이 농도를 처리하였고, 정상 균주에 과산화수소를 처리했을 때의 단백질 발현 변화된 것과, Aynk의 결과와 비교분석하기 위해 2-D 전기영동을 수행한 결과, 10개 이상의 변화된 spot을 관찰할 수 있었다. 발현의 변화를 보이는 단백질들을 mass로 elution 한 후, MALDI-TOF MS 분석으로 분석해 본 결과 양이 부족한 단백질 조각은 분석이 불가능하였으며, 그 외 6개의 효소에 대한결과와 고찰을 수행하였다.
후속연구
- 리스트를 얻었다. 이 결과는 NDPK의 redox state의 조절에 관련된 효소의 성질을 규명함에 있어 유용한 유전자 신호 체제정보를 제공할 것으로 생각되어진다.
- tdh가 있다. 이 데이터들을 종합해 보면, 세포의 조절과 산화적 스트레스에 대한 세포내의 반응을 매개하는 단백질들의 역할을 구축할 수 있는 기초적인 실험을 제공할 것으로 보인다. Hsp과 Cprlp(Fig.
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