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문제 정의
- 경제적으로 중요한 식용작물인 콩(Glycine max)의 초기형 질전환 효율증대를 위하여 연구를 수행하였다. 높은 초기형 질전환 조건 확립을 위하여 기초실험으로 Agrobacterium 감염에 순응적인 국내 콩 품종을 스크린 하였으며, 적정한 agar 농도와 선발항생제 hygromycin 농도 규명, 상처방법,explant의 치상방향, 호르몬 전처리, 액체배지 선발, 등형질 전환 초기효율에 미치는 영향을 transient GUS 분석을 통하여 알아보았다.
- 형질전환 후 효율적인 선발조건 확립을 위하여 적정 선발 항생제 농도를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 세 종류의 hygromycin 농도(30, 15, 10 ppm)의 비교 실험을 수행하였다.
- 호르몬 전처리 후 액체 진탕 배양이 형질전환체 선발에 얼마나 효과가 있는지 알아보고자 실험을 수행하였다. 100 u M acetosyringone포함된 AAM배 지와 AAM+BA 5 mg/1, AAM+BA 10 mg/1 의 배지를 준비하여 수행하였다(Table 1).
- 호르몬(BA)의 전처리가 형질전환 효율증대에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 수행하였다. 전처리를 위한 호르몬은 준비된 AAM배지에 BA 5 mg/1 와 10 mg/1 의 농도로 첨가하였다 (Table 1).
제안 방법
- 3일간 공배양 후 Agrobacterium의 제균을 위하여 멸균수로 2회 세척한 후 500 mg/1 의 cefotaxime과 0.05%의 Triton X-100O] 포함된 멸균수로 5회 세척하였다. 30 ml의 세척 용액을 넣은 50 ml tube에 떡잎을 넣었으며, mini 3D-shaker를 이용하여 매회 20분간 상하로 shaking 하였다.
- 그 후 2주 간격으로 SI-②(cefotaxime 200 mg/1, hygromycin 10 mg/1), SI-③(cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1) 로 옮겨 치상하면서 관찰하였다. Hygromycin 농도가 형질 전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험에서는 SI 배 지 에 각각 hygromycin 농도를 10, 15, 30 mg/1 씩 달리 첨가하였다. 액체배지 선발효과를 알아보고자 한 실험에서는 수 세 후 떡잎을 SI-① 액체배지에 10개씩 나누어 치상한 후 2 4℃ 배양실에서 110 rpm으로 18시간 광조건과 8시간 암조건으로 생육시켰다.
- 국내 콩 품종 스크린 결과, 종자의 발아율, 신초형성율, GUS 발현빈도, 그리고 종자의 오염도를 고려하여 4개의 품종(소백나물콩, 은하콩, 무한콩, 백운콩)을 선택하여 선발항 생제의 조건확립을 위한 실험을 수행하였다. 먼저 형질전환 후, 아그로박테리아를 제균하기 위한 두 가지의 제균제 cefo taxime 과 timentin의 제균 효능 검정하였다[5, 6, 7].
- 치상방향별 형질전환 효율을 알아보기 위한 실험에서는 향배축면(flat side)을 윗방향(up)과 아랫방향(down)으로 나눠 치상하였다. 그 후 2주 간격으로 SI-②(cefotaxime 200 mg/1, hygromycin 10 mg/1), SI-③(cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1) 로 옮겨 치상하면서 관찰하였다. Hygromycin 농도가 형질 전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험에서는 SI 배 지 에 각각 hygromycin 농도를 10, 15, 30 mg/1 씩 달리 첨가하였다.
- 고체 배지에서의 BA 전처리가 GUS 발현강도에서는 차이 를 보였지만 신초형 성과 GUS 발현율에 있어서 무처리에 비해서 차이를 나타내지 않았다. 그러나 후기 SE 배지에서 호르몬 무처리구가 BA전처리구에 비해 빠르게 고사하는 경향을 나타내 SI 배지에서의 효율적인 선발방법을 모색하기 위하여 액체 SI 배지를 이용한 초기선발실험을 수행하였다
- 경제적으로 중요한 식용작물인 콩(Glycine max)의 초기형 질전환 효율증대를 위하여 연구를 수행하였다. 높은 초기형 질전환 조건 확립을 위하여 기초실험으로 Agrobacterium 감염에 순응적인 국내 콩 품종을 스크린 하였으며, 적정한 agar 농도와 선발항생제 hygromycin 농도 규명, 상처방법,explant의 치상방향, 호르몬 전처리, 액체배지 선발, 등형질 전환 초기효율에 미치는 영향을 transient GUS 분석을 통하여 알아보았다.
- 발아한 식물체의 하배축을 떡잎 밑 약 1 cm되는 곳에서 자른 후 양 떡잎 사이로 scalpel를 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 새로 나온 본엽을 제거하였다. 떡잎 기부에서 위로 약 0.5 cm와 아래 하배축쪽으로 약 0.1 cm 이내의 부위를 scalpel과 동양침 두 가지로 나눠 7-12회 반복하여 상처를 내었다. Agrobacterium을 희석시킨 AAM 배지에 상처를 낸 떡잎을 20분간 접종시킨 후 향배축면(flat side)을 배지방향 또는 반대로 하여 치상하여 3일 간 24℃에서 암배양시켰다.
- 국내 콩 품종 스크린 결과, 종자의 발아율, 신초형성율, GUS 발현빈도, 그리고 종자의 오염도를 고려하여 4개의 품종(소백나물콩, 은하콩, 무한콩, 백운콩)을 선택하여 선발항 생제의 조건확립을 위한 실험을 수행하였다. 먼저 형질전환 후, 아그로박테리아를 제균하기 위한 두 가지의 제균제 cefo taxime 과 timentin의 제균 효능 검정하였다[5, 6, 7]. 제균 항 생제 cefotaxime과 timentin이 각각 첨가된 SI 배지 비교 실험에서는 품종 간 차이 없이 timentin 첨가배지(200 ppm)에 서 백화현상을 보였으며, cefotaxime (500 ppm)이 첨가된 배지에서는 별다른 해가 나타나지 않았다(data not shown).
- 형질전환 후 효율적인 선발조건 확립을 위하여 적정 선발 항생제 농도를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 세 종류의 hygromycin 농도(30, 15, 10 ppm)의 비교 실험을 수행하였다. 30 ppm의 농도에서는 무한콩에서만 신초 발생이 관찰되었고 15 ppm과 10 ppm 두 농도에서는 백운콩을 제외하고는 전반적으로 비슷한 비율로 신초형성을 보였다(Table 3).
- 액체선발배지인 Shoot induction 배지는 SI-①(cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1), SI-② (cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1)의 두 종류 배 지를 사용하였는데, 액체 SI 배지는 100 ml 삼각플라스크에 20 ml씩 나누어 분주하여 사용하였다. 수세 2주 후 SI-②배지 로 이식하고 신초는 SE (Shoot Elongation)배지로 이식하거나 GUS 분석하였다. 호르몬전처리 실험의 생존율은 SE배지 로 치상 후, 약 4주 후에 살아남은 신초의 수를 확인하여 계 산하였다.
- 은하콩, 대원콩, 그리고 태광콩은 발아율과 신초 형성율 모두에서 상대적으로 높은 빈도를 나타내어 형질전환 초기조건 확립실험의 재료로써 높은 가능성을 보였다. 신 초유도배지(Shoot Induction media)에서 유도된 신초는 형 질전환 약 2주 후에 적정크기로 자란 개체들에 대해 GUS 분석을 통하여 초기 transient 형질전환빈도를 측정하였다 (Table 2; Fig. 2). GUS 분석 결과 일품검정콩이 10%로 가장 높게 나타났으며, 대원콩과 은하콩이 각각 9%와 8%로 뒤를 따랐다.
- 액체배지 선발효과를 알아보고자 한 실험에서는 수 세 후 떡잎을 SI-① 액체배지에 10개씩 나누어 치상한 후 2 4℃ 배양실에서 110 rpm으로 18시간 광조건과 8시간 암조건으로 생육시켰다. 액체선발배지인 Shoot induction 배지는 SI-①(cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1), SI-② (cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1)의 두 종류 배 지를 사용하였는데, 액체 SI 배지는 100 ml 삼각플라스크에 20 ml씩 나누어 분주하여 사용하였다. 수세 2주 후 SI-②배지 로 이식하고 신초는 SE (Shoot Elongation)배지로 이식하거나 GUS 분석하였다.
- 여러 가지 시도된 처리와 조건들이 형질전환에 미치는 영향을 알아보기 위하여 형질전환 후, 약 2주된 초기신초와 캘러스를 가지고 transient GUS 분석을 하였다(Table 7). 은하 콩의 경우, scalpel 보다는 침을 사용하여 향배축을 아래로 치상하였을 때, GUS 유전자의 발현율이 높게 나타났으며, 소백 나물콩의 경우에 있어서는 0.
- 30 ml의 세척 용액을 넣은 50 ml tube에 떡잎을 넣었으며, mini 3D-shaker를 이용하여 매회 20분간 상하로 shaking 하였다. 유전자형 스크린을 위한 실험에서는 5회 세척된 떡잎은 SI (shoot in duction; B5 salt 3.16 g/1, BAP 1.67 mg/1, sucrose 3%, Agar 0.8%, cefotaxime 500 mg/1, hygromycin 30 mg/1)-① 배지 에 치상하여 24℃ 배양실에서 신초발생을 관찰하였다. 제균 항생제 선발실험에서는 같은 조건의 SI배지를 사용하였고, 제균항생제의 농도만 다른 2가지의 배지(cefotaxime 500 mg/1 또는 timentin 200 mg/l)> 사용하였다.
- 형질전환 순응형 콩 유전자형 스크린을 위해 실험에 이용된 국내 콩 품종 31개와 현재 국내의 콩 육종 프로그램에서 많이 사용되고 있는 미국산 품종 1개를 가지고 실험을 수행하였다. 이들 32개의 콩 품종에 대한 발아율과 신초형성율, 그리고 GUS 분석에 의한 초기형질전환효율을 측정하였다 (Table 2). 발아율은 품종 간에 차이를 보였고 일부품종에서는 50% 미만의 낮은 발아율을, 특히 장엽콩에서는 0%의 발아율을 나타내었다.
- Transient GUS 분석 결과 여러 가지 처리에도 불구하고 전반적으로 낮은 형질전환 효율이 관측되었다. 이러한 낮은 효율을 극복하기 위하여 형질전환과정 중에 호르몬을 처리하여 신초발생을 증대시키기 위한 전처리 실험을 수행하였다. 호르몬 전처리 실험 결과, 호르몬 전처리 후 신초의 발생 율은 처리와 무처리 간에 일정한 경향을 나타내지 않았으며 오히려 무처리에서 높은 신초형성율을 나타냈다(Table 8).
- 호르몬(BA)의 전처리가 형질전환 효율증대에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 수행하였다. 전처리를 위한 호르몬은 준비된 AAM배지에 BA 5 mg/1 와 10 mg/1 의 농도로 첨가하였다 (Table 1).
- 8%, cefotaxime 500 mg/1, hygromycin 30 mg/1)-① 배지 에 치상하여 24℃ 배양실에서 신초발생을 관찰하였다. 제균 항생제 선발실험에서는 같은 조건의 SI배지를 사용하였고, 제균항생제의 농도만 다른 2가지의 배지(cefotaxime 500 mg/1 또는 timentin 200 mg/l)> 사용하였다. 치상방향별 형질전환 효율을 알아보기 위한 실험에서는 향배축면(flat side)을 윗방향(up)과 아랫방향(down)으로 나눠 치상하였다.
- 5 cm 크기로 자 란 신초 및 캘러스는 절단하여 GUS 발색 용액을 첨가한 후, 37℃ 배양기에서 overnight 처리하였다. 처리 후 destaining solution (ethanol 2.5 ml, 10% formaldehyde 5 ml, 5% 이a- cial acetic acid 2.5 ml)을 첨가하여 4℃ 에 보관하며 GUS 발 현 여부와 정도를 관찰하였다.
- 제균 항생제 선발실험에서는 같은 조건의 SI배지를 사용하였고, 제균항생제의 농도만 다른 2가지의 배지(cefotaxime 500 mg/1 또는 timentin 200 mg/l)> 사용하였다. 치상방향별 형질전환 효율을 알아보기 위한 실험에서는 향배축면(flat side)을 윗방향(up)과 아랫방향(down)으로 나눠 치상하였다. 그 후 2주 간격으로 SI-②(cefotaxime 200 mg/1, hygromycin 10 mg/1), SI-③(cefotaxime 100 mg/1, hygromycin 10 mg/1) 로 옮겨 치상하면서 관찰하였다.
- 이 실험에서는 국내 콩 품종을 재료로 형질전환 방법을 확립하기 위하여 일품 검정콩을 포함한 32개의 한국 콩 품종 을 가지고 형질전환 실험을 수행하였다. 형질전환 방법은 콩 형질전환에 관한 성공적인 논문을 발표한 미국대학 현지방 문을 통하여 최근에 개발되어 확립된 Agrotmcterium을 이용 한 형질전환 방법을 기초하여 수행하였으며 국내 콩 품종에 보다 적합한 방법을 찾기 위하여 호르몬 전처리와 액체배지 선발 등 다양한 조건 확립실험을 수행하였다.
- 형질전환의 효율을 검정하기 위하여 GUS 발색반응을 수 행하였다. GUS 발색반응은 Jefferson (1987)의 방법을 사용하 였다.
- 수세 2주 후 SI-②배지 로 이식하고 신초는 SE (Shoot Elongation)배지로 이식하거나 GUS 분석하였다. 호르몬전처리 실험의 생존율은 SE배지 로 치상 후, 약 4주 후에 살아남은 신초의 수를 확인하여 계 산하였다.
대상 데이터
- 호르몬 전처리 후 액체 진탕 배양이 형질전환체 선발에 얼마나 효과가 있는지 알아보고자 실험을 수행하였다. 100 u M acetosyringone포함된 AAM배 지와 AAM+BA 5 mg/1, AAM+BA 10 mg/1 의 배지를 준비하여 수행하였다(Table 1).
- 국내 콩 품종 형질전환 genotype 스크린을 위한 식물재료로 검정콩 1호, 검정콩 2호, 진품종, 무한콩, 소담콩, 진품종 2호, 선흑콩, 푸른콩, 단백콩, 장엽콩, 광안콩, 황금콩, 보광콩, 만리콩, 소명콩, 장수콩, 백운콩, 대황콩, 소백나물콩, 장미콩, 금강콩, 일품검정콩, 은하콩, 일미콩, 새올콩, 큰올콩, 새알콩, 대원콩, 다원콩, 태광콩, 신팔달콩, H 416937 등 32개의 품종을 사용하였다. Hygromycin 농도가 형질전환체 선발 및 재분화에 미치는 영향에 대한 실험 식물재료로는 소백나물콩, 은하콩, 무한콩, 백운콩의 떸잎을 사용하였으며, agar 농도, 치상방향, 상처방법이 형질전환체 선발효율에 미치는 영향을 알기 위한 실험에서는 소백나물콩과 은하콩이 사용되었다. 호르몬 BA 전처리와 관련한 실험에서는 은하콩이 사용되었다.
- 공배양 배지로는 100 uM의 acetosyringone이 포함된 AAM 배지를 사용하였다. 형질전환 당일 왕성히 자란 Agrobacferinm을 50 ml tube에 .
- 국내 콩 품종 형질전환 genotype 스크린을 위한 식물재료로 검정콩 1호, 검정콩 2호, 진품종, 무한콩, 소담콩, 진품종 2호, 선흑콩, 푸른콩, 단백콩, 장엽콩, 광안콩, 황금콩, 보광콩, 만리콩, 소명콩, 장수콩, 백운콩, 대황콩, 소백나물콩, 장미콩, 금강콩, 일품검정콩, 은하콩, 일미콩, 새올콩, 큰올콩, 새알콩, 대원콩, 다원콩, 태광콩, 신팔달콩, H 416937 등 32개의 품종을 사용하였다. Hygromycin 농도가 형질전환체 선발 및 재분화에 미치는 영향에 대한 실험 식물재료로는 소백나물콩, 은하콩, 무한콩, 백운콩의 떸잎을 사용하였으며, agar 농도, 치상방향, 상처방법이 형질전환체 선발효율에 미치는 영향을 알기 위한 실험에서는 소백나물콩과 은하콩이 사용되었다.
- 이 실험에서는 국내 콩 품종을 재료로 형질전환 방법을 확립하기 위하여 일품 검정콩을 포함한 32개의 한국 콩 품종 을 가지고 형질전환 실험을 수행하였다. 형질전환 방법은 콩 형질전환에 관한 성공적인 논문을 발표한 미국대학 현지방 문을 통하여 최근에 개발되어 확립된 Agrotmcterium을 이용 한 형질전환 방법을 기초하여 수행하였으며 국내 콩 품종에 보다 적합한 방법을 찾기 위하여 호르몬 전처리와 액체배지 선발 등 다양한 조건 확립실험을 수행하였다.
- 콩의 형질전환을 위하여 이용된 은 super vector pTOK233을 가지고 있는 LBA4404를 사용하였다(Fig.1). Agrotmcterium은 형질전환 3일 전 hygromycin 50 mg/1 가 포함된 고체 YEP 배지(Table 1)에 streaking 한 후, 28℃ 배양기에서 3일간 배양하였다.
- 형질전환 순응형 콩 유전자형 스크린을 위해 실험에 이용된 국내 콩 품종 31개와 현재 국내의 콩 육종 프로그램에서 많이 사용되고 있는 미국산 품종 1개를 가지고 실험을 수행하였다. 이들 32개의 콩 품종에 대한 발아율과 신초형성율, 그리고 GUS 분석에 의한 초기형질전환효율을 측정하였다 (Table 2).
이론/모형
- 형질전환의 효율을 검정하기 위하여 GUS 발색반응을 수 행하였다. GUS 발색반응은 Jefferson (1987)의 방법을 사용하 였다. 1 ml의 GUS 발색용액을 만들기 위하여 3 mg의 5-bro- mo-4-chloro-indolyl glucuronie (X-Gluc)을 150 pl dimethyl formamide에 녹인 후, 850 pl의 solution B (1% Triton X-100, 0.
성능/효과
- 세 종류의 hygromycin 농도(30, 15, 10 ppm)의 비교 실험을 수행하였다. 30 ppm의 농도에서는 무한콩에서만 신초 발생이 관찰되었고 15 ppm과 10 ppm 두 농도에서는 백운콩을 제외하고는 전반적으로 비슷한 비율로 신초형성을 보였다(Table 3). 신초 형성과 함께 조사한 캘러스 발생율은 저농도의 hygromycin 에서 전반적으로 높았다.
- Agrobaderium 감염에 순응적인 품종을 선발하기 위하여 32개의 국내 콩 장려품종을 스크린한 결과, 일품검정콩, 은하콩, 만리콩, 대원콩 등 14개의 순응형 품종을 선발하였으며, 효율적인 제균제로는 cefotaxime이, 효율적인 선발항생제로 서는 hygromycin이 선택되었다. Hygromycin 농도는 10-15 ppm이 효율적이었고, agar 농도 0.
- 호르몬 전처리 실험 결과, 호르몬 전처리 후 신초의 발생 율은 처리와 무처리 간에 일정한 경향을 나타내지 않았으며 오히려 무처리에서 높은 신초형성율을 나타냈다(Table 8). GUS 발현율에서도 무처리가 13%가장 높게 나타났으며 BA 1 ppm이 10% 그리고 BA 5 ppm이 8.4%로 각각 나타났다. 그러나 GUS의 발현강도에 있어서 무처리구의 경우, 호르몬 처리에 비해 약하게 나타났고 후에 SE (shoot elongation)배 지에서 모두 고사하는 경향을 보였다(data not shown).
- 2). GUS 분석 결과 일품검정콩이 10%로 가장 높게 나타났으며, 대원콩과 은하콩이 각각 9%와 8%로 뒤를 따랐다. 형질전환빈도는 낮았지만 장미콩과 백운콩에서는 강한 GUS 발현을 보였다(data not shown).
- Agrobaderium 감염에 순응적인 품종을 선발하기 위하여 32개의 국내 콩 장려품종을 스크린한 결과, 일품검정콩, 은하콩, 만리콩, 대원콩 등 14개의 순응형 품종을 선발하였으며, 효율적인 제균제로는 cefotaxime이, 효율적인 선발항생제로 서는 hygromycin이 선택되었다. Hygromycin 농도는 10-15 ppm이 효율적이었고, agar 농도 0.6-0.8%, explant의 치상방 향은 향배축(adaxial side)을 down하여 치상하였을 때가 높은 GUS (β-glucuronidase)발현빈도를 나타냈고 상처방법은 scalpel보다 동양침을 사용하였을 때 .높게 나타났다.
- 선발초기에 비형질전환체를 조기제거하고 높은 빈도의 유전자 도입개체를 전개해 나갈 수 있다면 stable 한 형질전환체를 얻을 수 있는 확률을 매우 높일 수 있을 것이다. SE 배지에서의 생존개체비율을 조사한 결과 호르몬 전 처리구의 개체들이 무처리구보다 훨씬 높은 비율로 생존함 을 나타내 호르몬 전처리의 효과가 초기의 신초형성과 형질 전환율에서는 크게 차이를 보이지 않았지만 조직배양 중에 가해진 선발압력에 생존하는 데 크게 기여했음을 알 수 있었 다 (Table 10).
- 제균 항 생제 cefotaxime과 timentin이 각각 첨가된 SI 배지 비교 실험에서는 품종 간 차이 없이 timentin 첨가배지(200 ppm)에 서 백화현상을 보였으며, cefotaxime (500 ppm)이 첨가된 배지에서는 별다른 해가 나타나지 않았다(data not shown). Timentin이 첨가된 배지에서 신초의 발생율(0〜7%)이 현저히 낮았으며, cefotaxime0] 첨가된 배지에서의 신초 발생율 (6〜18%)은 상대적으로 높았다. 이 실험의 결과로 향후 모든 아그로박테리아의 제균을 위하여 cefotaxime을 제균제로 사 용하였다.
- 두 품종, 소백나물콩과 은하콩을 재료로 하여 각기 다른 세 농도의 agar 배지에 따른 신초 및 캘러스 발생은 0.4% 보다는 0.6%와 0.8% 농도의 agar 배지에서 높았다(Table 4). 신초와 캘러스의 발생은 두 품종 모두 0.
- 이는 떡잎을 아랫방향을 향하여 치상하였을 때 캘러스와 신초발생부위가 배지와 접촉이 좋아져 배지의 영양공급이 원활하게 이루어진 결과로 생각 된다. 또한 상처방법이 형질전환효율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시한 두 개의 다른 상처도구로 scalpel (#11 blade)과 가장 가는 동양침(직경 300 미크론)의 비교 실험에서, 신초 발생에서는 침을 사용한 경우가 좋았고, 캘러스 발생에서는 scalpel을 사용한 경우가 약간 높았다(Table 6). 이 결과에 대한 정확한 이유는 확실히 알 수 없으나, 두 상처방법의 차이가 목표부위에 대한 수직적 방향과 수평적 방향의 상처라는 차이와 상처부위의 크기를 감안할 때 침에 의한 수직적이며 상대적으로 미세한 상처가 목표부위를 덜 파괴시켜 신초 발생의 빈도를 높인 것이 아닌가 생각된다.
- 이들 32개의 콩 품종에 대한 발아율과 신초형성율, 그리고 GUS 분석에 의한 초기형질전환효율을 측정하였다 (Table 2). 발아율은 품종 간에 차이를 보였고 일부품종에서는 50% 미만의 낮은 발아율을, 특히 장엽콩에서는 0%의 발아율을 나타내었다. 반면에 은하콩, 소백나물콩, 새알콩, 대원콩, 태광콩 등은 발아율이 90% 이상으로 양호하였다.
- 30 ppm의 농도에서는 무한콩에서만 신초 발생이 관찰되었고 15 ppm과 10 ppm 두 농도에서는 백운콩을 제외하고는 전반적으로 비슷한 비율로 신초형성을 보였다(Table 3). 신초 형성과 함께 조사한 캘러스 발생율은 저농도의 hygromycin 에서 전반적으로 높았다. 캘러스의 유기는 형질전환 과정 중 상처부위를 중심으로 불규칙적으로 자연 발생하였으며 재분화 배지로 치상된 후에도 신초의 형성은 보이지 않아 형질 전환과정 중에 캘러스의 유기는 부정적인 요인으로 작용할 가능성을 나타내었다.
- 8% 농도의 agar 배지에서 높았다(Table 4). 신초와 캘러스의 발생은 두 품종 모두 0.8% 농도의 agar 배지가 가장 효율적이었다. 형질전환 후, 떡잎의 치상방향은 향축면(flat side)을 위방향(up)과 아랫방향(down)으로 나누어 SI 배지에 치상한 경우 향축면을 배지에 묻히도록 아랫방향으로 치상했을 때가 위로 향했을 때보다 두 품종 모두에서 신초형성과 캘러스 생성에 효율적이었다(Table 5).
- (Table 9). 실험결과 초기의 신초형성에 있어서는 고체 SI 배지실험에서와 마찬가지로 무처리구가 호르몬 처리구보다 높게 나타났으나 형성된 신초당 GUS 발현율에 있어서는 호르몬 처리구가 약 2배 높은 GUS 발현빈도를 나타내었다. 이 결과는 무처리구의 경우, 형성된 신초의 50% 이상이 유전자가 도입되지 않은 비형질전환개체(escape)이나, 호르몬 처리구들은 형성된 신초의 약 80%가 유전자가 도입된 개체들임을 나타내고 있다.
- 그러나 GUS의 발현강도에 있어서 무처리구의 경우, 호르몬 처리에 비해 약하게 나타났고 후에 SE (shoot elongation)배 지에서 모두 고사하는 경향을 보였다(data not shown). 위의 결과를 종합하여 볼 때, 선발초기의 신초형성빈도에는 호르몬 전처리가 특별한 영향을 미치지 않으나 유전자의 도입에는 효과를 미쳐 GUS 유전자의 발현과 후기의 생존에 도움이 된 것으로 보인다.
- 특히 외국품종 으로 사용된 PI416937의 경우, 2%의 매우 낮은 신초형성율을 나타내었다. 은하콩, 대원콩, 그리고 태광콩은 발아율과 신초 형성율 모두에서 상대적으로 높은 빈도를 나타내어 형질전환 초기조건 확립실험의 재료로써 높은 가능성을 보였다. 신 초유도배지(Shoot Induction media)에서 유도된 신초는 형 질전환 약 2주 후에 적정크기로 자란 개체들에 대해 GUS 분석을 통하여 초기 transient 형질전환빈도를 측정하였다 (Table 2; Fig.
- 먼저 형질전환 후, 아그로박테리아를 제균하기 위한 두 가지의 제균제 cefo taxime 과 timentin의 제균 효능 검정하였다[5, 6, 7]. 제균 항 생제 cefotaxime과 timentin이 각각 첨가된 SI 배지 비교 실험에서는 품종 간 차이 없이 timentin 첨가배지(200 ppm)에 서 백화현상을 보였으며, cefotaxime (500 ppm)이 첨가된 배지에서는 별다른 해가 나타나지 않았다(data not shown). Timentin이 첨가된 배지에서 신초의 발생율(0〜7%)이 현저히 낮았으며, cefotaxime0] 첨가된 배지에서의 신초 발생율 (6〜18%)은 상대적으로 높았다.
- 6%의 agar 농도에서 침을 가지고 향배축을 아래로 치상하였을 때 형질전환 효율이 비교적 높게 나왔으나 전반적으로 낮은 GUS 발현을 나타내었다. 캘러스에서의 GUS 유전자의 발현율은 전반적으로 낮게 나타났으며, 치상방향이 향축면이 아래를 향했을때 그리고 agar농 도가 0.6% 일 때 비교적 다른 처리구보다 높게 나타났다.
- 신초 형성과 함께 조사한 캘러스 발생율은 저농도의 hygromycin 에서 전반적으로 높았다. 캘러스의 유기는 형질전환 과정 중 상처부위를 중심으로 불규칙적으로 자연 발생하였으며 재분화 배지로 치상된 후에도 신초의 형성은 보이지 않아 형질 전환과정 중에 캘러스의 유기는 부정적인 요인으로 작용할 가능성을 나타내었다. 항생제 선발농도 실험의 결과, 초기 신초형성 과정 중, 적정 hygromycin농도는 높은 빈도의 신초 형성에 매우 중요한 요인으로 생각된다.
- 높게 나타났다. 형질전환 체계확립을 위하여 호르몬 전처리를 한 결과, BA 5 ppm 과 10 ppm을 처리하였을 때 후기 선발에서 높은 생존율을 보였고, 전처리 후에 액체배지에서 선발을 하였을 때 비형질 전환체(escape)의 빈도를 크게 낮출 수 있었다. 또한 여러 조건의 결과를 비교하여 볼 때, 국내 콩 품종 중에서 형질전환을 위한 재료로써는 은하콩이 가장 적합한 것으로 생각된다.
- 8% 농도의 agar 배지가 가장 효율적이었다. 형질전환 후, 떡잎의 치상방향은 향축면(flat side)을 위방향(up)과 아랫방향(down)으로 나누어 SI 배지에 치상한 경우 향축면을 배지에 묻히도록 아랫방향으로 치상했을 때가 위로 향했을 때보다 두 품종 모두에서 신초형성과 캘러스 생성에 효율적이었다(Table 5). 이는 떡잎을 아랫방향을 향하여 치상하였을 때 캘러스와 신초발생부위가 배지와 접촉이 좋아져 배지의 영양공급이 원활하게 이루어진 결과로 생각 된다.
- 이러한 낮은 효율을 극복하기 위하여 형질전환과정 중에 호르몬을 처리하여 신초발생을 증대시키기 위한 전처리 실험을 수행하였다. 호르몬 전처리 실험 결과, 호르몬 전처리 후 신초의 발생 율은 처리와 무처리 간에 일정한 경향을 나타내지 않았으며 오히려 무처리에서 높은 신초형성율을 나타냈다(Table 8). GUS 발현율에서도 무처리가 13%가장 높게 나타났으며 BA 1 ppm이 10% 그리고 BA 5 ppm이 8.
후속연구
- 그러나 선발효율에서 hygrom- ycin이 명확한 선발 효과를 보이는 반면 PPT를 이용한 선발은 종종 선발 중에 비형질전환체의 escape를 만드는 것으로 알려져 있다[5]. 따라서 좀 더 많은 콩 유전자형에 대한 폭넓 은 hygromycin 선발효용성을 조사할 필요가 있고 다양한 농도에 대한 검사도 필요하다고 생각된다.
- 형질전환 후의 초기선발과 조직배양에 있어서의 효율증대는 조직배양 중에 가장 큰 문제점인 공간문제와 불필요한 비용을 최소화 할 수 있다는 점에서 매우 중요한 요인이다. 선발초기에 비형질전환체를 조기제거하고 높은 빈도의 유전자 도입개체를 전개해 나갈 수 있다면 stable 한 형질전환체를 얻을 수 있는 확률을 매우 높일 수 있을 것이다. SE 배지에서의 생존개체비율을 조사한 결과 호르몬 전 처리구의 개체들이 무처리구보다 훨씬 높은 비율로 생존함 을 나타내 호르몬 전처리의 효과가 초기의 신초형성과 형질 전환율에서는 크게 차이를 보이지 않았지만 조직배양 중에 가해진 선발압력에 생존하는 데 크게 기여했음을 알 수 있었 다 (Table 10).
- Timentin이 첨가된 배지에서 신초의 발생율(0〜7%)이 현저히 낮았으며, cefotaxime0] 첨가된 배지에서의 신초 발생율 (6〜18%)은 상대적으로 높았다. 이 실험의 결과로 향후 모든 아그로박테리아의 제균을 위하여 cefotaxime을 제균제로 사 용하였다.
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