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문제 정의
- 감소효과는 비교적 강하게 나타나지 않았다. 따■라서 이들 양성 조절인자 외 다른 유전자 산물에 의한 조절 가능성이 매우 크기 때문에 길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위해 위하여 현재까지 알려진 Cdk inhibitor 중 가장 많은 연구가 이루어져있는 pl6z p21 및 p27의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 Western blotting 및 RT-PCR법으로 조사하였다.
- 본 연구에서는 길경의 암세포 증식 억제 현상과 연관된 기전 해석을 위하여 인체 폐암세포 NCI-H460의 성장에 미치는 길경 수용액 추출물[aqueous extract from the roots of P. grandiflorum (AEPG)]의 영향을 조사하였다. AEPG의 처리에 의한 암세포 증식억제가 apoptosis 유발가 연관성이 있음을 apoptotic body의 형성과 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도 증가로 확인하였다.
- 이에 저자는 길경에 대한 NCI-H460 인체 폐암 세포를 이용하여 cyclin발현 Cdks의 발현, p53 및 pRB의 발현 및 Cdk inhibitors 의 발현을 살펴보고 이에 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 비이다.
제안 방법
- 48시간까지 배양한 후, 세포를 PBS로 씻어 내고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 원심분리를 하여 세포를 모았다. 이렇게 모아진 세포에 적당량의 lysis buffer (250 mM NaClz 25 mM Tris-HCl pH 7.
- 또 One-step RT-PCR PreMix (iNtRON Biotechnology, Korea) 를 사용하여 실험하였을 경우에는 분리한 RNA에 iNtRON ONE-STEP RT-PCR PreMix, premixed primer 및 DEPC treated water# 넣고 RT-PCR을 행하였다(반응에 필요한 각각의 시약의 조성과 사용 및 RT-PCR의 조건은 Table 4 및 5 참조). PCR을 행하여 만들어진 DNA의 양을 확인하기 위하여 lx TAE buffer으로 1% agarose g인을 만들고 well에 각각의 primed] 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution (5x, QUALITY BIOLOGICAL, INC.)을섞어서 loading 한 후 100 V에서 전기영동으로 분리한 후 EtBr 염색하였다. 이를 ultra violet (UV) 하에서 학인한 후 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다36).
- Western blot analysis를 위하여 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 단백질을 분리한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keenez NH, USA) 으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함유한 PBST (0.1% Tween 20 in PBS) 용액을 이용하여 상온에서 1시간 이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고, PBS-T 용액을 이용하여 5분 간격으로 최소 3회 이상 세척하였다. 세척 후 특정 단백질에 대한 항체(PBS-T로 1:500 또는 1:1000으로 희석하여 사용)를 membrane에 적용시켜 상온에서 1시간 이상 항원 항체 반응을 일으킨 후 PBS-T로 씻어내고 3 회 이상 수세한 후, 특정 항체에 대한 이차 항체(PBS-T로 1:1500 으로 희석하여 사용)를 적용시켜 상온에서 1시간 이상 반응시켰다 다시 PBS-T로 세척 (10분간 3번, 5분간 3번)하고 enhanced ChemiLuminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp.
- 45 ㎛의 여과지를 이용하여 부유 성분을 걸러낸 후 수용성분을 동결 건조하여 사용하였다. 길경 수용액 추출물의 처리를 위하여 세포를 0.05% trypsin-EDTA를 이용하여 세포배양용 페트리 접시로부터 부유시킨 다음 새로운 세포배양용 페트리 접시에 6 X 105 개/戒 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화 시켰다. 길경 추출물을 세포에 처리하기 직전 적정 농도로 성장 배지에 첨가하여 녹인 다음, 0.
- 05% trypsin-EDTA를 이용하여 세포배양용 페트리 접시로부터 부유시킨 다음 새로운 세포배양용 페트리 접시에 6 X 105 개/戒 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화 시켰다. 길경 추출물을 세포에 처리하기 직전 적정 농도로 성장 배지에 첨가하여 녹인 다음, 0.22 ㎛의 pore size를 가진 주사기용 필터유닛을 사용하거나 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물을 걸러낸 다음, 세포의 성장배지를 갈아주면서 직접 처리하였다珂.
- 다음은 세포증식의 세포주기 조절관점과 연관된 길경 추출물의 암세포 증식억제 현상 해석을 위하여 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양한 NCL버460 폐암세포들을 대상으로 현재까지 밝혀진 cyclin들 중에서 특히 세포주기 G1 기에서 S기로의 진입 조절에 중요한 역할을 하는 cyclin들의 발현 정도를 비교 조사하였다. 이를 위하여 조사된 cycline cyclin D1 및 cyclin E로서, 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 48시간 동안 배양된 NCI-H460 폐암세포를 대상으로 RNA 및 단백질을 추출하여 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 두 유전자의 전사 및 번역 수준에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사한 결과는 Fig.
- 다음은 종양 억제유전자로서 세포의 증식과 사명에 중요한 역할을 하는 p53 및 pRB 유전자의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사하였다.
- 1의 결과에서 알 수 있듯이 길경 추출물의 처리에 의한 세포주기 G1 기 arrest 현상은 G1 기 조절에 중요한 cyclin의 급격한 발현 변화와는 상관성이 없는 것 같았다. 따■라서 cy시in파 complex# 형성함으로서 세포주기 진행에 매우 중요한 kinase 활성을 지니는 Cdks의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 G1 기의 조절에 중요한 역할을 하는 cyclin 이과 complex 를 이루는 Cdk4 및 Cdk6, 그리고 cyclin E 와의 complex를 형성하는 Cdk2의 발현 변화 여부를 RT-PCR 및 Western blot analysis로 전사 및 번역 수준에서 조사하였다.
- 5 mM dNTPz lOx buffer, DEPC water, premixed primer (GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 polymerase chain reaction (PCR)을 행하였다(반응에 필요한 각각의 시약 사용 및 PCR의 조건은 Table 2 및 3 참조). 또 One-step RT-PCR PreMix (iNtRON Biotechnology, Korea) 를 사용하여 실험하였을 경우에는 분리한 RNA에 iNtRON ONE-STEP RT-PCR PreMix, premixed primer 및 DEPC treated water# 넣고 RT-PCR을 행하였다(반응에 필요한 각각의 시약의 조성과 사용 및 RT-PCR의 조건은 Table 4 및 5 참조). PCR을 행하여 만들어진 DNA의 양을 확인하기 위하여 lx TAE buffer으로 1% agarose g인을 만들고 well에 각각의 primed] 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution (5x, QUALITY BIOLOGICAL, INC.
- 필요한 각각의 시약은 Table 1 참조). 만들어진 RT product (template cDNA) 에 2.5 mM dNTPz lOx buffer, DEPC water, premixed primer (GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 polymerase chain reaction (PCR)을 행하였다(반응에 필요한 각각의 시약 사용 및 PCR의 조건은 Table 2 및 3 참조). 또 One-step RT-PCR PreMix (iNtRON Biotechnology, Korea) 를 사용하여 실험하였을 경우에는 분리한 RNA에 iNtRON ONE-STEP RT-PCR PreMix, premixed primer 및 DEPC treated water# 넣고 RT-PCR을 행하였다(반응에 필요한 각각의 시약의 조성과 사용 및 RT-PCR의 조건은 Table 4 및 5 참조).
- 1 M phenymethylsulfonyl fluoride ; PMSF, 1 M 1/4-dithio-DL-threitoI ; DTT, protease inhibitor cocktail, DW) 를첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 13, 500 rpm으로 30분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용 방법에 따라 동량으로 맞춘 다음 동량의 Laemmli sample buffer (P-melcaptomethanol 5%, Laemmli sample buffer 95%, Bio-Rad)을 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 sample 동량을 sodium dodesyl sulfate (SDS) polyacrylamide g이 전기영동으로 분리하였다初.
- 1% Tween 20 in PBS) 용액을 이용하여 상온에서 1시간 이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고, PBS-T 용액을 이용하여 5분 간격으로 최소 3회 이상 세척하였다. 세척 후 특정 단백질에 대한 항체(PBS-T로 1:500 또는 1:1000으로 희석하여 사용)를 membrane에 적용시켜 상온에서 1시간 이상 항원 항체 반응을 일으킨 후 PBS-T로 씻어내고 3 회 이상 수세한 후, 특정 항체에 대한 이차 항체(PBS-T로 1:1500 으로 희석하여 사용)를 적용시켜 상온에서 1시간 이상 반응시켰다 다시 PBS-T로 세척 (10분간 3번, 5분간 3번)하고 enhanced ChemiLuminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights’ IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film 에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다3电8). 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 암세포의 배양을 위해서는 선행연구 방법35)에 준하여 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의우태아혈청 (fetal bovine serumz FBS), 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였으며, 성장바지의 교환은 매 48시간마다 해주었고, 세포 수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-EDTA (Gibco BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 세포배양용 페트리 접시로 옮겨 배양하였다.
- 세포배양용 패트리 접시에 6 X 如5개/戒 정도로 폐암 세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 길경 추출물을 처리하였다. 48시간까지 배양한 후, 세포를 PBS로 씻어 내고 0.
- Pellet에 PBS를 첨가하여 현탁한 다음 1,000 rpm에서 5분간 원심분리를 한 후 pellet에 RNAzol B 1皿을 첨가하여 약하게 현탁을 하고 e-tube에 옮겨서 4, C 에서 1시간 동안 세포를 용해시켰다. 여기에 chloroform 200 成를 넣고 inv으rting을 반복하여 고르게 섞은 다음 4P에서 5분 동안 방치시키고 14, 000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하여 무색의 상층액만을 400 以 취한 뒤 동량의 isopropanol 을 넣고 inverting을 반복하여 고르게 섞은 다음 4 ℃ 에서 15분 동안 방치시키고 14, 000 rpm에서 15분 동안 원심분리 (4℃)하여 얻은 pellet (RNA)에 75% ethanol (25% DEPC treated water, Nalgene) 500 成를 넣어 15,000 g에서 15분 동안 원심분리 (4℃)하고 ethanol을 완전히 날린 후에 DEPC water 50 成를 넣어서 RNA틀 용해하여 A260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 함량을 계산하였다.
- )을섞어서 loading 한 후 100 V에서 전기영동으로 분리한 후 EtBr 염색하였다. 이를 ultra violet (UV) 하에서 학인한 후 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다36). 이때 사용된 primer들의 서열은 Table 6에 나열된 바와 같으며 housekeeping 유전지은] glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였다
- 따■라서 cy시in파 complex# 형성함으로서 세포주기 진행에 매우 중요한 kinase 활성을 지니는 Cdks의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 G1 기의 조절에 중요한 역할을 하는 cyclin 이과 complex 를 이루는 Cdk4 및 Cdk6, 그리고 cyclin E 와의 complex를 형성하는 Cdk2의 발현 변화 여부를 RT-PCR 및 Western blot analysis로 전사 및 번역 수준에서 조사하였다.
- 조사하였다. 이를 위하여 조사된 cycline cyclin D1 및 cyclin E로서, 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 48시간 동안 배양된 NCI-H460 폐암세포를 대상으로 RNA 및 단백질을 추출하여 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 두 유전자의 전사 및 번역 수준에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사한 결과는 Fig. 1과 같다.
- 따■라서 이들 양성 조절인자 외 다른 유전자 산물에 의한 조절 가능성이 매우 크기 때문에 길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위해 위하여 현재까지 알려진 Cdk inhibitor 중 가장 많은 연구가 이루어져있는 pl6z p21 및 p27의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 Western blotting 및 RT-PCR법으로 조사하였다.
- 정상 및 길경 수용액 추출물이 들어있는 배지에서 48시간 동안 자란 암세포를 PBS로 씻어 내고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 1000 rpm으로 10분간 원심분리를 하여 상층 액을 버리고 세포만 모았다. 24시간 후 세포를 disposable cell lifter (Fisher scientific)로 긁어서 50 ml tube에 옮긴 후 1, 000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하였다.
대상 데이터
- , Arlington Heights’ IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film 에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다3电8). 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며 (Table 7), 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobuline Amersham Corp. (Arlington Hechts, IL, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 NCI-H460 인체 폐암세포 세포(NCI-H460 human lung carcinoma cell line) 는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서 분주 받아 사용하였다. 암세포의 배양을 위해서는 선행연구 방법35)에 준하여 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의우태아혈청 (fetal bovine serumz FBS), 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장 배지를 사용하여 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 길경은 동의대학교 한의과대학 부속 한방병원에서 공급받았으며 100 g을 1,000 ml의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 0.
- 암세포의 배양을 위해서는 선행연구 방법35)에 준하여 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의우태아혈청 (fetal bovine serumz FBS), 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였으며, 성장바지의 교환은 매 48시간마다 해주었고, 세포 수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
성능/효과
- AEPG 처리는 cyclin-dependent kinase (Cdk) ir血bitoi■인 pl6 및 p27 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현 증가를 유발하였다. AEPG가 처리된 암세포에서 특히 cyclin D1 및 Cdk6의 발현이 전사 및 번역 수준에서 선택적으로 억제되었다. 종양억제 유전자 retinoblastoma protein (pRB) 및 p53 단백 질의발현에는 AEPG가 큰 영향을 미치지 못하였다.
- grandiflorum (AEPG)]의 영향을 조사하였다. AEPG의 처리에 의한 암세포 증식억제가 apoptosis 유발가 연관성이 있음을 apoptotic body의 형성과 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도 증가로 확인하였다. AEPG 처리는 cyclin-dependent kinase (Cdk) ir血bitoi■인 pl6 및 p27 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현 증가를 유발하였다.
- Fig. 1의 결과에서 알 수 있듯이 길경 추출물의 처리에 의한 세포주기 G1 기 arrest 현상은 G1 기 조절에 중요한 cyclin의 급격한 발현 변화와는 상관성이 없는 것 같았다. 따■라서 cy시in파 complex# 형성함으로서 세포주기 진행에 매우 중요한 kinase 활성을 지니는 Cdks의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사하였다.
- Fig. 2A의 결과에서 알 수 있듯이 RT-PCR에 의한 결과에서길경 추출물의 처리에 따라 Cdk6 mRNA의 발현은 처리 농도 의존적으로 감소되었으나, Cdk2 및 Cdk4 발현에 길경 추출물은 큰 영향을 미치지 못하였다, Western blot analysis에 의한 Cdks 의 단백질 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사한 결과, Cdk6의 경우 전사 수준에서의 경우와 유사하게 길경 추출물 처리 농도 증가에 따■라 단백질의 발현도 매우 감소되었으나, Cdk4 단백질은 아무런 변화가 없었으며, Cdk2는 최고 농도인 5.0 mg/ml 처리군에서만 발현이 억제되었다(Fig. 2B).
- Fig. 4A의 결과에서 알 수 있듯이 RT-PCR에 의하여 조사된 3가지 Cdk inhibitor의 전사 수준에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사해 본 결과 pl6 및 p21의 발현은 큰 변화가 없었으나, p27 의 발현은 길경 추출물 처리 농도가 증가될수록 점차 증가되었다. 그러나 Fig.
- 4B의 Western blot analysis의 결과에서 pl6의 단백질 발현은 길경 추출물의 처리 농도가 증가될수록 점차 발현의 양이 증가되어 전사 조절 단계에서 단백질의 축적이 증가된 것으로 추정된다. 그리고 p21 단백질의 발현은 길경 추출물의 처리에 의하여 큰 변화가 없었으나, p27 단백질은 길경 추출물 처리 농도가 증가할수록 점차 발현의 양이 증가되었음을 알 수 있었다. 따라서 길경 추출물 처리에 의한 NCI-H460 폐암세포의 증식억제는 p21 보다는 pl6이나 p27의 발현 증가와 연관성이 있는 것으로 생각되어지며, 이로 인한 cyclin/Cdk complex의 형성을 방해하여 그들의 kinase 활성 자체를 감소시켰을 것으로 추정되어진다.
- 3에 나타낸 바와 같이 길경 추출물이 처리된 암세포에서 p53 단백질의 발현이 다소 증가하는 경향성을 보여주었으나 전사 수준에서는 큰 차이가 없었다. 그리고 세포주기 G1 기 진입에 중요한 역할을 하는 pRB 단백질의 발현은 본 실험조건에서 검출이 잘 되지는 않았으며, 인산화의 변화 여부도 뚜렷하게 구분되지 않았다. 따라서 길경 추출물 처리에 의한 암세포의 증식억제에 p53 및 pRB 유전자는 크게 관여하지 않는 것으로추정되어진다.
- 이상의 결가로 미루어 길경 추출물 처리에 의한 NCI-H460 인체 폐암세포의 증식억제에는 Cdks의 전사 및 번역 발현 수준에서는 Cdk6의 변화가 가장 심하게 억제되었음을 알 수 있었다. 그러나 A549 폐암세포에서 Cdk2 및 Cdk4는 길경 추출물의 농도 증가에 따라 단백질 수준에서의 발현이 다소 감소되었으나 Cdk6의 경우는 대조군에 비하여 유의적인 변화가 없었다꽤.
- 이상의 결과에서 길경 추출물 처리에 의한 NCI-H460 인체폐암 세포의 성장억제 효과에 Cdk의 활성을 조절하는 cyclins의발현 감소효과는 비교적 강하게 나타나지 않았다. 따■라서 이들 양성 조절인자 외 다른 유전자 산물에 의한 조절 가능성이 매우 크기 때문에 길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하였다.
- 전술한 바와 같이 동일 조건에서 배瀝 암세포를 대상으로 조사한 결과, Fig. 3에 나타낸 바와 같이 길경 추출물이 처리된 암세포에서 p53 단백질의 발현이 다소 증가하는 경향성을 보여주었으나 전사 수준에서는 큰 차이가 없었다. 그리고 세포주기 G1 기 진입에 중요한 역할을 하는 pRB 단백질의 발현은 본 실험조건에서 검출이 잘 되지는 않았으며, 인산화의 변화 여부도 뚜렷하게 구분되지 않았다.
후속연구
- 따라서 길경 추출물 처리에 의한 암세포의 증식억제에 p53 및 pRB 유전자는 크게 관여하지 않는 것으로추정되어진다. 그러나 pRB와 선택적인 결합을 통하여 세포주기 조절에 중요한 역할을 하는 전사조절인자 E2F family의 발현이나 pRB와의 상관성은 아직 조사하지 못한 단계이므로 이에 때한 길경 추출물의 영향과 pRB family에 속하는 단백질들과의 complex 형성 가능성들에 관하여서는 추후 더 연구되어야할 것이다.
- 개발 가능성이 매우 높음을 시사하여 준다. 따■라서 이에 관한 지속적인 연구의 필요성이 있을 것으로 생각되며 유전자의 기능적 분석에 관한 더 많은 연구도 필요할 것으로 생각된다.
- 따라서 동일 길경 추출물 처리에 의한 암세포의 증식 억제 효과라 하더라도 세포주의 종류에 .따라 세포주기 교란의 차이가 나는 것은 충분히 가능한 현상이므로 다양한 세포주들에 의한 효과를 더 검증해야할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 그러나 A549 폐암세포에서 Cdk2 및 Cdk4는 길경 추출물의 농도 증가에 따라 단백질 수준에서의 발현이 다소 감소되었으나 Cdk6의 경우는 대조군에 비하여 유의적인 변화가 없었다꽤. 따라서 주요 Cdks의 kinase 활성 비교를 통한 두 세포주 사이의 차이점에 관한 보다 구체적인 추가 연구가 수행되어야 할 것이다.
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