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문제 정의
- 이에 이 연구는 제모한 마우스 배부에 UVB를 조사하여 피부 조직의 형태학적 변화와 함께 유해산소 생성계와 해독계 효소 활성 변동을 관찰함으로써 자외선에 의한 피부 손상 정도를 알아보았다.
제안 방법
- 따라 측정하였다. Glutathione 기질과 조효소인 NADPH를 시료와 함께 25℃에서 5분간 반응 시켜 340nm에서 NADPH의 산화로 인한 흡광도감소율을 측정하였다. 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 1mg이 1분 동안 산화시킨 NADPH의 양을 nmole로 표시하였다.
- 그리고 이 효소에 의해 생성된 superoxide anion radical이 조직병변의 직접적 인원인으로 알려져 있다(McCord and Fridovich, 1978). UVB 조사 시 피부조직의 손상이 유해산소에 기인하는지를 알아보기 위해 유해산소의 생성계인 XO 활성을 측정하였다.
- (1974)5] 방법 에 따라 측정하였다. l-chloro-2, 4-dinitrobenzene과 gluta- thione을 기질로 하여 25℃에서 10분간 반응하여 생성된 2, 4-dinitrobenzene-glutathione conjugate 양을 340nm에서 측정하였다. 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 1 mg 이 1분 동안 반응하여 생성한 conjugate의 양을 nmole로 나타내었다.
- 각종 원인에 의해 생성된 유해산소는 SOD에 의해 hydrogen peroxide (H2O2)로 전환되며 hydrogen peroxide는 다시 CAT 및 GPX에 의해서 물로 전환되어 해독화되고 GST도 유해산소해독에 관여하는 것으로 알려져 있어 유해산소 해독계 효소인 SOD, CAT, GPX와 GST를 측정하였다. 이 연구에서 SOD 활성은 UVB 조사군에서 96시간까지는 정상군보다 유의하게 낮게 나타났으며 144시간에는 정상군과 유의한 차이가 없었다.
- 이 연구에서 400 mJ/cn? 광량의 UVB 자외선을 정상 마우스의 제모한 배부에 1회 조사하고 각각 자외선 조사 24, 48, 96 및 144시간 후에 피부조직을 광학현미경과 투과전자현미경으로 비교 관찰하였다. 광학현미경으로 표피의 화농상태와 진피의 염증 상태를 관찰한 결과, 자외선 조사 후 96시간 경에 진피에서의 염증 정도와 표피에서의 화농 정도가 가장 심하게 나타났으며 144시간 경에는 표피와 진피가 거의 정상적인 상태로 치유된 것을 관찰할 수 있었다.
- 광학현미경적관찰을 위해 적출한 피부조직을 10% 중성 포르말린 용액에 고정하고 계열 에 탄올로탈수한 후침투과정을 거쳐 파라핀에 포매한 다음 4 pim의 박절편을 만들어 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 실험동물은 아무런 처치를 하지 않은 정상군, 자외선을 1회 조사한 후 일정 기간(24, 48, 96 및 144 시간) 경과한 조사군으로 나누었다. 자외선을 조사하기 하루 전에 제모기를 사용하여 마우스 배부의 털을 제거하였다.
- 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 실험동물을 자체 고안하여 제작한 자외선 조사용 cage에 가둔 후, 제모한 배부피부에 400mJ/cm2의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 자외선 광량은 UV-radiome- ter로 측정하였다.
- 실험동물의 처치는 각 군별로 (자외선 조사 후 24, 48, 96 및 144시간 군) ether 마취 하에 경추 탈구사 시킨 후 표피와 진피를 모두 포함한 피부조직을 적출하여 이 중 일부는 10% 포르말린 용액 및 2.5% glutaraldehyde 용액에 고정시켜 조직학적 검사에 사용하였고, 나머지는 마쇄균 질화시켜 원심분리한 후효소활성도 측정에 사용하였다.
- 25 M sucrose 용액을 넣고 glass teflon homogenizer를 이용하여 20% (w/v) 마쇄균 질액을 만들었다. 이 균질액을 600xg에서 10분간 원심분리한 후 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상층액을 취하여 10, 000 xg에서 20분간 원심분리한 후 효소 활성도 측정에 사용하였다.
- 일정량의 피부조직에 4배량의 0.25 M sucrose 용액을 넣고 glass teflon homogenizer를 이용하여 20% (w/v) 마쇄균 질액을 만들었다. 이 균질액을 600xg에서 10분간 원심분리한 후 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상층액을 취하여 10, 000 xg에서 20분간 원심분리한 후 효소 활성도 측정에 사용하였다.
- 경과한 조사군으로 나누었다. 자외선을 조사하기 하루 전에 제모기를 사용하여 마우스 배부의 털을 제거하였다.
- 측정하였다. 조직 마쇄균 질액 일정량에 4% sulfosalicylic acid 0.5 mL 넣고 원심분리한 후, 상층액 일정량을 0.1 rrmM 5, 5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) 함유 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) 에 넣고 반응시켜 생성된 p-nitrophenol을 측정하였다. 환원형 GSH 함량은 단백질 mg당 pnwle로표시하였다.
- 투과 전자현미경적 관찰을 위해 적출한 피부조직을 1 mm3 크기로 세절하여 2.5% glutaraldehyde 용액 (0.1 M 인산완충액, pH 7.4, 1 〜 4℃)에 2시간 전 고정하고 0.1 M 인산 완충액으로 세척한 후 1% osmium tetroxide용액에 2시간 후 고정을 실시하고 같은 완충액으로 세척하여 계열 에탄올로 탈수하고, propylene oxide로 치환한 후 Luft(1961) 방법에의 한 Epon 혼합물로 포매하여 37℃에 12시간, 45℃ 에 12시간, 60℃에 48시간 동안 방치하여 열중합을 시켰다. 포매된 조직을 유리칼을 사용하여 Ipim로박절하고 toluidine blue 염색을 실시한 후 광학현미경 상에서 관찰 부위를 선택한 다음 RMC MT-XL 형 초박절기로 Dupont 다이아몬드칼을 부착하여 회백색 (40〜60nm)의 간접색을 나타내는 초박절편을 얻어 grid에 부착시킨 뒤 Watson (1958)과 Reynolds (1963) 방법에 의한 uranyl acetate와 lead citrate로 이중전자염색을 실시하여 투과전자현미경으로 가속전압 75kV로 관찰하였다.
- 1 M 인산 완충액으로 세척한 후 1% osmium tetroxide용액에 2시간 후 고정을 실시하고 같은 완충액으로 세척하여 계열 에탄올로 탈수하고, propylene oxide로 치환한 후 Luft(1961) 방법에의 한 Epon 혼합물로 포매하여 37℃에 12시간, 45℃ 에 12시간, 60℃에 48시간 동안 방치하여 열중합을 시켰다. 포매된 조직을 유리칼을 사용하여 Ipim로박절하고 toluidine blue 염색을 실시한 후 광학현미경 상에서 관찰 부위를 선택한 다음 RMC MT-XL 형 초박절기로 Dupont 다이아몬드칼을 부착하여 회백색 (40〜60nm)의 간접색을 나타내는 초박절편을 얻어 grid에 부착시킨 뒤 Watson (1958)과 Reynolds (1963) 방법에 의한 uranyl acetate와 lead citrate로 이중전자염색을 실시하여 투과전자현미경으로 가속전압 75kV로 관찰하였다.
- (1979)^ 방법에 따라 측정하였다. 효소시료 속의 과산화지질을 산성 조건 하에서 2-thiobarbituric acid 용액과 가열 반응 시켜 생긴 TBARS의 흡광도를 532nm에서 측정하였다. TBARS 함량은 단백질 mg 당 nmole로 표시하였다.
대상 데이터
- Hydrogen peroxide는 Junsei 사(Japan)의 제품을, Folin & ciocalteu's phenol reagent, hematoxylin, bovine serum albumin, p-NADPH 등은 Sigma 사 (USA)의 제품을 사용하였으며, 그 외 일반 시약들은 특급품을 사용하였다.
- 실험기기로는 UV spectrophotometer (Shimazu, UV-1601, Japan), incubator (Adventec, TC-1, Japan), refrigerated centrifuge (Herolab, Hicen21, Japan), glass teflon homogenizer (Ultra Turrax, T25 basic, Japan), UVB sunlamp (UVL-26, UVP Co., USA), UV-radiometer (UVB LP9021, Italy), light microscope (Olympus DP50, Japan), transmission electron microscope (Hitachi H-7100, Japan) 및 실험실에서 사용하는 일반 기기를 사용하였다.
- 실험동물은 생후 6주령된 외견상 건강한 웅성 ICR 마우스를 (주)대한 바이오링크(Korea)로부터구입한 다음 1주일간 사육실(온도는 22土 1℃, 습도는 50土5%)에서 적응시킨 후 사용하였다. 전 실험 기간 동안물과 사료의 양은 제한 없이 공급하였다
- 자외선 조사 장치의 광원은 302 nm 파장의 UVB 를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 실험동물을 자체 고안하여 제작한 자외선 조사용 cage에 가둔 후, 제모한 배부피부에 400mJ/cm2의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 자외선 광량은 UV-radiome- ter로 측정하였다.
데이터처리
- SPSS(V 10.0) 통계 프로그램을 이용하여 정상군과 조사군 간의 '각각의 생화학적 분석자료의 평균 비교를 위하여/-test를 실시하였다. 유의수준은 0.
이론/모형
- 피부조직 중 단백질 함량은 Lowry et a/. (1951)의 방법에 따라 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하여 측정하였다.
- GST의 활성도는 Habig et a/. (1974)5] 방법 에 따라 측정하였다. l-chloro-2, 4-dinitrobenzene과 gluta- thione을 기질로 하여 25℃에서 10분간 반응하여 생성된 2, 4-dinitrobenzene-glutathione conjugate 양을 340nm에서 측정하였다.
- CAT 활성도는 hydrogen peroxide# 기질로 하여 환원되는 정도를 파장 240nm에서 그 흡광도를 읽고 분자흡광계수 (E=0.04mMT cm-1)를 이용하여 활성을 산출하는 Aebi(1974)의 방법에 준하였다. 활성도 단위는 피부조직 중에 함유된 단백질 1mg이 1분 동안 반응하여 감소되는 hydrogen peroxide 양을 nmole 로 표시하였다.
- GPX의 활성도는 Paglia and Valentine (1967)의 방법에 따라 측정하였다. Glutathione 기질과 조효소인 NADPH를 시료와 함께 25℃에서 5분간 반응 시켜 340nm에서 NADPH의 산화로 인한 흡광도감소율을 측정하였다.
- SOD의 활성도는 hematoxylin 자동산화의 억제 정도를 관찰하는 Martin ”0.(1987)의 방법에 따라 O.lmMEDTA가 함유된 50 mM 인산 완충액 (pH 7.5)에 10 piM hematoxylin 및 효소액을 가해 25℃에서 반응시켜 생성된 hematein을 560nm에서 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다. 활성도 단위는 효소액을 넣지 않은 반응액 중의 hematoxylin 자동산화를 50% 억제하는 정도를 1 unit로 하여 단백질 Img이 1분 동안 반응한 unit로 표시하였다.
- TBARS 함량은 Ohkawa et al. (1979)^ 방법에 따라 측정하였다. 효소시료 속의 과산화지질을 산성 조건 하에서 2-thiobarbituric acid 용액과 가열 반응 시켜 생긴 TBARS의 흡광도를 532nm에서 측정하였다.
- XO의 활성도는 Stripe and Della (1969)의 방법 에준하여 측정하였다. 활성도 단위는 효소액 중에 함유된 단백질 Img이 1분 동안 반응하여 기질인 xanthine으로부터 생성된 uric acid의 양을 n mole로 표시하였다.
- 환원형 GSH 함량은 Ellman(1959)의 방법에 따라 측정하였다. 조직 마쇄균 질액 일정량에 4% sulfosalicylic acid 0.
성능/효과
- 48 및 96시간에 조사군의 TBARS 함량은 정상군보다 각각 약 72% 및 69% 유의하게 (p<0.01) 낮았으며 144시간에는 정상군과 유의한 차이가 없었다.
- 이와 같은 결과를 볼 때 UVB 조사에 의해 생성된 유해산소는 SOD에 의해 hydrogen peroxide (H2O2)로 전환되고, 이 때 생성된 hydrogen peroxide의 해독에는 GPX 보다 CAT가 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각된다. GST 활성은 조사군에서 UVB 조사 후 24시간을 제외하고 96시간까지는 정상군보다 유의하게 낮게 나타났으며, 144시간에는 정상군과 유의한 차이가 없었다. 유해산소의 생성계와 해독계의 불균형이 조직 손상을 야기시키는 원인으로 작용한다는 여러 선행연구보고 (Deneke and Fanburg 1980; Leiboritz and Siegel, 1980)는 이 연구에서 UVB 조사 후 정상군과 유해산소의 생성계와 해독계 효소 활성도와 유의한 차이를 초래함으로써 , 조직 손상을 일으키는 원인으로 작용할 것이라고 해석할 수 있는 과학적인 근거를 제공해주고 있다.
- UVB 조사 후 24, 48 및 96시간에 조사군의 CAT 활성도는 정상군보다 각각 약 49% (p< 0.05), 66% (p<0.01) 및 68%(p<0.01) 유의하게 낮았다. 144 시간에는 조사군과 정상군 사이에는 유의한 차이가 없었다.
- UVB 조사 후 24, 48 및 96시간에 조사군의 SOD 활성 도는 정상군보다 각각 약 24% (p<0.05), 42% (p<0.001) 및 33%(p<0.01) 유의하게 낮았다. 144 시간에는 조사군과 정상군 사이에 유의한 차이가 없었다.
- 것으로 관찰되었다. UVB 조사군에서는 유해산소를 생성하는 XO 활성이 정상군보다 전반적으로 유의하게 높게 나타난 반면어), 해독에 관여하는 효소들은 정상군보다 유의하게 감소하였다가 시간이 흐름에 따라 서서히 정상적인 수준으로 회복되는 경향을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 결과는 생체피부에 UVB를 조사하면 유해산소 생성계효소와 해독계 효소 간의 불균형이 초래됨으로써, 즉 XO 활성의 증가로 인한 유해산소의 과다 생성과 이들 유해산소를 제거하기 위한 생체 방어기전으로서 유해산소 해독계 효소들이 활성이 저하되고 산화적 손상이 일어나며 일정량 이하의 UVB 노출 시에는 시간이 경과함에 따라 이들 효소 계간의 불균형이 정상 수준으로 회복되어 조직손상은 치유됨을 가늠케 해준다는 것을 보여주었다.
- 광학현미경으로 표피의 화농상태와 진피의 염증 상태를 관찰한 결과, 자외선 조사 후 96시간 경에 진피에서의 염증 정도와 표피에서의 화농 정도가 가장 심하게 나타났으며 144시간 경에는 표피와 진피가 거의 정상적인 상태로 치유된 것을 관찰할 수 있었다. 자외선을 조사한 후 24시간에 전자 현미경적인 관찰에서, 세포질 내 tonofilament 의 응집과 함께 keratinocytes 배열의 붕괴, 세포막의 손상과 핵의 손상으로 인한 부분적인 apoptosis 가 나타났다(투고 준비 중).
- 이 실험에서 XO의 활성은 UVB 조사군의 경우 자외선 조사 후 144시간까지 정상군보다 유의하게 높게 나타나 UVB 조사에 의한 피부조직 손상은 XO 의 활성 증가에 따른 유해산소 생성량의 증가가 직접적인 원인으로 작용한 것으로 생각된다.
- 이 실험에서 과산화지질(TBARS) 함량을 측정한 결과, UVB 조사군에서 48시간과 96시간에는 정상군보다 유의하게 (p<0.01) 낮게 나타났고, 144시간에는 정상치로 회복되었다. 이와 같은 결과는 UVB 조사 후과산화지질 함량이 유의하게 감소하였다는 Lee et al.
- CAT, GPX와 GST를 측정하였다. 이 연구에서 SOD 활성은 UVB 조사군에서 96시간까지는 정상군보다 유의하게 낮게 나타났으며 144시간에는 정상군과 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 UVB 조사가 피부조직의 SOD 활성을 저하시킨다는 기존의 연구보고(Miyachi efc”.
- Connor and Wheeler (1987)는 UVB나 UVA를 조사하면 피부의 GSH 함량이 현저히 떨어진다고 보고하였다. 이 연구에서 자외선을 조사한 대조군은 24시간에서 유의하게 감소되었다가 그 이후에는 정상적인 수준으로 회복되었다. 이는 자외선 조사 시 생성된 유해산소를 제거하기 위해서 GSH가 단기간에 많이 소모된 것으로 해석된다.
- 이상의 실험 결과를 통해 제모한 마우스배부에 400 mJ/cm2 광량의 UVB 자외선을 조사한 결과 피부 각질 세포의 손상과 함께 진피조직에 급성 염증반응이 초래되고 조사 후 6일에는 염증반응이 회복되는 것으로 관찰되었다. UVB 조사군에서는 유해산소를 생성하는 XO 활성이 정상군보다 전반적으로 유의하게 높게 나타난 반면어), 해독에 관여하는 효소들은 정상군보다 유의하게 감소하였다가 시간이 흐름에 따라 서서히 정상적인 수준으로 회복되는 경향을 관찰할 수 있었다.
- UVB 조사군에서는 유해산소를 생성하는 XO 활성이 정상군보다 전반적으로 유의하게 높게 나타난 반면어), 해독에 관여하는 효소들은 정상군보다 유의하게 감소하였다가 시간이 흐름에 따라 서서히 정상적인 수준으로 회복되는 경향을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 결과는 생체피부에 UVB를 조사하면 유해산소 생성계효소와 해독계 효소 간의 불균형이 초래됨으로써, 즉 XO 활성의 증가로 인한 유해산소의 과다 생성과 이들 유해산소를 제거하기 위한 생체 방어기전으로서 유해산소 해독계 효소들이 활성이 저하되고 산화적 손상이 일어나며 일정량 이하의 UVB 노출 시에는 시간이 경과함에 따라 이들 효소 계간의 불균형이 정상 수준으로 회복되어 조직손상은 치유됨을 가늠케 해준다는 것을 보여주었다.
- 광학현미경으로 표피의 화농상태와 진피의 염증 상태를 관찰한 결과, 자외선 조사 후 96시간 경에 진피에서의 염증 정도와 표피에서의 화농 정도가 가장 심하게 나타났으며 144시간 경에는 표피와 진피가 거의 정상적인 상태로 치유된 것을 관찰할 수 있었다. 자외선을 조사한 후 24시간에 전자 현미경적인 관찰에서, 세포질 내 tonofilament 의 응집과 함께 keratinocytes 배열의 붕괴, 세포막의 손상과 핵의 손상으로 인한 부분적인 apoptosis 가 나타났다(투고 준비 중).
- 조사 후 144시간까지 조사군의 GPX 활성도는 정상군과 유의한 차이가 없었다.
- 조사군의 GST 활성도는 24시간을 제외하고는 96시간까지는 정상군보다 유의하게 낮게 나타났으며 144시간에는 유의한 차이가 없었다. 48 및 96시간에서 조사군은 정상군보다 각각 약 70% (p< 0.
- 조사군의 XO 활성도는 24, 48, 96 및 144시간에서 정상군보다 각각 약 45%, 41%, 34% 및 45% 유의하게 (p<0.05) 높았다.
후속연구
- (2000)의 보고와 부합된다. 한편 염증성 반응이 지질과 산화의 산화적 손상으로부터 피부조직을 보호한다는 연구보고 (Lee et al., 2000)를고려해 볼 때, 자외선 조사 시 염증반응 초래와 과산화지질 함량의 감소, 그리고 피부 표피에서 kera- tinocyte의 세포막 손상 (intercellular junction의 배열 불규칙적)과의 관련성 규명을 위해서는 추후 면밀한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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