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문제 정의
- 본 연구는 Streptococcus mutans의 치태 형성에 사용되는 자당의 대사에 과일 등을 통해 많이 섭취되고 있는 과당의 영 향을 보고자 시행하였다.
- 생성하고 세포외 다당류를 만든다. 본 연구에서는 Streptococcus mutans^ 자당 대사에 미치는 과당의 영향을 규명하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
- 13) Anthrone 시 약을 사용한 수용성 폴리머 성분시험 결과, 수용성 폴리머의 구성 물질은 포도당으로(Fig. 14) 수용성 폴리머는 수용성 글루캔이 었다.
제안 방법
- 여기에 1 X 107 Streptococcus mufans를 접종하여 37, 0 배양기에서 24시간 배양한후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심하여 상청 액을 얻었다. 10배로 희석한 상청액을 0.4% 자당, 0.4% 포도당, 0.4% 과당과 함께 실리카젤에서 1.5 问씩 loading 하였다. 85% acetonitrile 용액에서 전개하고 0.
- 5, 10. 15, 20, 30분에 각각의 시험관을 얼음 속으로 옮겨 2분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 실온에 15분간 방치한 후, 분광광도계 620 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 mm 스테인레스스틸 재질의 교정용 wire(Remomium, Dentarum, Germany)를 50 mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 37°C 배양기에서 30 rpm 속도로 회전시키면서 8시간, 24시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공치태의 무게를 평균하였다.
- M17 액체배지에 0.4% 자당과 0.4% 과당을 단독 또는 병합하여 첨가하였다. 여기에 실험실에서 추출한 ]% 읺ucosyltransferase를 첨가하여 37*0.
- M17 액체배지에 0.4% 자당을 첨가하고 glucosyl- transfbrase를 첨 가하여 배 양하면 (Right tube) 0.4% 자당과 0.4% 과당을 병합 첨가한 경우(Left tube) 와 비교하여 비수용성 폴리머가 생겨 혼탁하였다.(Fig.
- Tryptone yeast extract 액체배지 (1.7% tryptone, 0.3% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 0.25% potassium phosphate, 0.2% 읺ucose)에 여 러 농도의 자당 또는 과당(1%, 2%. 4%. 8%)을 첨가하였다. 배지 10 ml에 0.
- 5 ml를 첨가하여 섞었다. 대조군으로 1.11 mM 자당, 1.11 mM 포도당, Lil mM 과당, Lil mM 포도당과 1.11 mM 과당을 합친 것을 각각 시험관 8개에 50 a 1씩 분주하고 1.5 ml anthrone 시약을 첨가하여 섞었다. 실온에 10-15분간 방치한 다음, 60°C 수조에 옮겨 0, 2.
- 5 X 107 Streptococcus mutans를 접 종하여 37笆 배양기에서 2, 4, 6, 8, 24시간 배양하였다. 배양액의 흡광도 (optical density) 를 분광광도계 (speo trophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan) 660 nm 파장에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다. Yeast extract(0.
- 8%)을 첨가하였다. 배지 10 ml에 0.5 X 107 Streptococcus mutans를 접 종하여 37笆 배양기에서 2, 4, 6, 8, 24시간 배양하였다. 배양액의 흡광도 (optical density) 를 분광광도계 (speo trophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan) 660 nm 파장에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다.
- 1M MOPS buffer# 가하고 pH는 7이 되도록 조정하였다. 배지 10 ml에 3% 자당과 2%, 4%의 과당을 병합하여 첨가하였다. 여기에 0.
- 1M MOPS bufifei를 가하고 pH는 7이 되도록 조정하였다. 배지 20 ml에 3% 자당과 2%, 4%의 과당을 병합하여 첨가하였다. 여기에 1 X 107 Streptococcus mufans를 접종하여 37, 0 배양기에서 24시간 배양한후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심하여 상청 액을 얻었다.
- 1M MOPS bufi况를 가하고 pH는 7이 되도록 조정하였다. 배지 20 ml에 3% 자당과 4% 과당을 단독 또는 병합하여 첨가하였다. 여기에 1 X 107 Strept ococcus mutans^: 접종하여 37t! 배양기에서 24시간 배 양한 후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심 하여 비수용성 인 침전물과 수용성 인 상청 액을 얻었다.
- 1M 이 되도록 하였고 pH는 7이 되도록 조정하였다. 배지 40 ml에 3% 자당과 2%, 4%의 과당을 병 합하여 첨가하였다. 여기에 2 X 107 Streptococcus mutans 를 접종하고 0.
- 같은 조작을, 2번 반복하고 원심하여 남은 침전물을 80 °C 오븐에서 4시간 건조하였다. 비수용성인 침전물과 수용성인 침전물을 1 M HC1 용액을 가하여 121P 오븐에서 20분간 방치한 1.5 风씩을 0.4% 포도당, 0.4% 과당과 함께 실리카젤에 loading하였다. 85% acetonitrile 용액에서 전개하고 0.
- 여기에 1 X 107 Streptococcus mufans를 접종하여 37, 0 배양기에서 24시간 배양한후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심하여 상청 액을 얻었다. 10배로 희석한 상청액을 0.4% 자당, 0.4% 포도당, 0.4% 과당과 함께 실리카젤에서 1.5 问씩 loading 하였다. 85% acetonitrile 용액에서 전개하고 0.
- 배지 10 ml에 3% 자당과 2%, 4%의 과당을 병합하여 첨가하였다. 여기에 0.5 X 107 Streptococcus mutans를 접종하여 37°C 배양기에서 24시간 배양한 다음, 세균배양액을 희석하여 M17 고체배지(Diho, Detroit, MI, USA)에 접종하고 37t 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- 배지 40 ml에 3% 자당과 2%, 4%의 과당을 병 합하여 첨가하였다. 여기에 2 X 107 Streptococcus mutans 를 접종하고 0.5 mm 스테인레스스틸 재질의 교정용 wire(Remomium, Dentarum, Germany)를 50 mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 37°C 배양기에서 30 rpm 속도로 회전시키면서 8시간, 24시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공치태의 무게를 평균하였다.
데이터처리
- 각군의 인공치태 무게 차이는 Mann-Whitney test를 이용하여 비교하였으며 통계학적인 유의성은 p value가 0.05 이하인 경우로 하였다.
성능/효과
- 1- 자당(3%)이 첨가된 배지에서 Streptococcus mutant를 8시간 배양시 와이어상에 형성된 인공치태 무게는 1243土3.0 mg인데 반해, 과당(4%) 을병합 첨가하면 20.7±10.2mg으로 감소하였다.(P<O.
- (Fig. 11) Anthrone 시 약을 사용한 비수용성 폴리머 성분시험 결과, 비수용성 폴리머의 구성 물질은 포도당으로(Fig. 12) 비수 용성 폴리머는 비수용성 글루캔이었다.
- 11) Anthrone 시 약을 사용한 비수용성 폴리머 성분시험 결과, 비수용성 폴리머의 구성 물질은 포도당으로(Fig. 12) 비수 용성 폴리머는 비수용성 글루캔이었다. M17 액체배지 에 glucosyltransferase를 가하여 72시 간 배 양한 상청액을 비교할 때, 배지에 0.
- (Fig. 13) Anthrone 시 약을 사용한 수용성 폴리머 성분시험 결과, 수용성 폴리머의 구성 물질은 포도당으로(Fig. 14) 수용성 폴리머는 수용성 글루캔이 었다.
- 2. 포도당이 든 대조군에 자당을 병합 첨가하여 Streptococcus mu场ms를 24시간 배양하면 배양액의 흡광도는 대조군에 비교하여 증가하지 않았으나, 과당 병합 첨가시는 증가하였다.
- 3. 자당과 과당이 병합 첨가된 배지에 Streptococcus mu场ns를 8시간 배양하면 자당만 첨가될 때보다 생균 수가 증가하였다.
- 4. 자당과 과당이 병합 첨가된 배지에서의 Strept ococcus mutans 배양액에는 자당만 첨가될 때보다 남아있는 자당양이 증가하였고 생성된 비수용성 글루캔양은 감소하였다.
- 5. 자당과 과당이 병합 첨가된 배지에 glucosyl- tiansf国ase를 가하면 자당만 첨가될 때보다 남아있는 자당과 생성된 수용성 글루캔양이 증가하였으나, 생성된 비수용성 글루캔양은 감소하였다. 이 상의 결과는 Streptococcus mutans의 자당 대사시 과당을 병합 첨가하면 자당의 대사와 비수용성 글루캔의 생성이 억제됨을 보여 주었다.
- 자당과 과당을 병합 점가한 배지에서의 Streptococcus mutam 배양 침전물에 존재하는 비수용성 폴리머양은 자당만 첨가한 경우보다 감소하였으나, 배양 상청액에 존재하는 수용성 폴리머양은 증가하였다. Anthrone 반응 결과이 때 생성된 비수용성 폴리머나 수용성 폴리머가 모두 포도당으로 구성된 글루캔인 것으로 보아 자당에 작용하는 glucosyltran眺rase의 GBD에 과당이 영향을 미친 것으로 사료된다.
- 이 는 Streptococcus mutans 배 양시 인공치 태 형 성 에이용되는 자당의 사용이 과당에 의해 감소된 것으로추정 할 수 있다. 배지 에 Streptococcus mutans를 접종하여 24시간 배양한 후 배양액을 thin layer chro- matographyS- 검사하여 보면 배지에 자당만 가한 경우보다 자당과 과당을 병합 첨가한 경우 대사되지 않은 자당양이 증가한 것으로 보아 첨가된 과당에 의해서 자당의 이용이 억제된 것으로 보인다. 이때 배양 침전물과 상청액의 성분을 분석하여 보면 자당만 첨가할 때와 비교하여 자당과 과당을 병합 첨가할 때 침전물에 생성된 비수용성 글루캔의 양은 감소하고 배양 상청액에 생성된 수용성 글루캔 양은 비슷하였다.
- 본 연구에서 자당을 가한 배지에서 Streptococcus mutans를 배양할 때 과당을 병합 첨가하면 Streptococcus mutans 배양액의 생균수는 과당을 첨가하지 않을 때와 비교하여 배양 8시간 후 많은 증가가 있었으나, 배양 24시간 후는 비슷하였다. 이는 과당이 쉽게 대사에 이용되기 때문에 세균이 빠르게 증가하여 배양 24시간이 되면 세균은 성장곡선중 사멸기(death phase)에 있게 되어 배양 8시간에 비하여 생균수도 적어진다.
- 자당과 과당이 병합 첨가된 배지에 glucosyl- tiansf国ase를 가하면 자당만 첨가될 때보다 남아있는 자당과 생성된 수용성 글루캔양이 증가하였으나, 생성된 비수용성 글루캔양은 감소하였다. 이 상의 결과는 Streptococcus mutans의 자당 대사시 과당을 병합 첨가하면 자당의 대사와 비수용성 글루캔의 생성이 억제됨을 보여 주었다.
- 이 상의 결과로 볼 때 , Streptococcus mutans^} 자당 대사시 과당을 병합 첨가하면 과당이 glucosyl- transf国'ase에 작용함으로써 비수용성 글루캔 생성이 억제되어 인공치태 형성이 감소됨을 보여 주었다. 구강내 치태 형성에 대한 영양물질의 병합 효과를 더 알기 위해서는 탄수화물과 기타 물질에 작용하는 효소에 대한 연구가 더 필요한 것으로 사료된다.
- 자당 3%을 첨가한 액체배지에 Streptococcus mu tans를 접종하여 8시간 배양시 생균수가 ml 당 3.7±0.7 X IO, 인데 반해, 자당에 2% 과당을 병합 첨가할 때의 생균수는 ml당 14.3±4.9 X 107, 4% 과당을 병합 첨가할 때의 생균수는 ml당 49.5± 21.9 X 1CK으로 증가하였다. 자당 3%을 첨가한 액체배지 에 Streptococcus mutam를 접종하여 24시간 배양시 생균수는 ml당 0.
- 배지에 glu cosyltransferase# 가하고 72시간 배양할 때 배지에 자당만 첨가한 경우에 비교하여 자당과 과당을 병합 점가한 경우 thin layer chromatography 상 분해되지 않은 자당양은 증가하였다. 자당과 과당을 병합 점가한 배지에서의 Streptococcus mutam 배양 침전물에 존재하는 비수용성 폴리머양은 자당만 첨가한 경우보다 감소하였으나, 배양 상청액에 존재하는 수용성 폴리머양은 증가하였다. Anthrone 반응 결과이 때 생성된 비수용성 폴리머나 수용성 폴리머가 모두 포도당으로 구성된 글루캔인 것으로 보아 자당에 작용하는 glucosyltran眺rase의 GBD에 과당이 영향을 미친 것으로 사료된다.
후속연구
- 주었다. 구강내 치태 형성에 대한 영양물질의 병합 효과를 더 알기 위해서는 탄수화물과 기타 물질에 작용하는 효소에 대한 연구가 더 필요한 것으로 사료된다.
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