Lovastatin을 생산하는 식용버섯 선발과 HMG-CoA reductase 저해 효과 Screening of Edible Mushrooms for the Production of Lovastatin and its HMG-CoA Reductase Inhibitory Activity원문보기
국내에서 식용버섯으로 이용되고 있는 8종 균주의 자실체와 균사체로부터 콜레스테롤 합성을 저해하는 lovastatin 생산과 고지혈증 억제활성을 탐색하였다. TLC 분석으로 lovastatin생산 유무를 검색한 결과 자실체와 균사체의 추출물에 대해 Rf값이 표준물질콰 같은 약 0.46에서 뚜렷한 밴드가 형성됨을 확인하였다. 자실체로부터 lovastatin 추출을 위한 용매로는 water/acetonitrile/methanol (5:2.5:2.5)을 사용하였을 매 가장 효과적인 lovastatin 생산량을 보였다. Lovastatin 생산량은 자실체 중에서는 Pleurotus ostreatus가 0.98 mg/g (dry biomass)으로 가장 높은 생산량을 나타냈고 균사체 배양액 추출물에 대해서도 P. ostreatus가 21.90 mg/L로 높은 생산량을 나타냈다. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase 저해활성에서는 자실체에서 P ostreatus가 67.8%, 균사체에서 P. ostreatus와Laetiporus sulphureus가 각각 37.2%, 29.1%의 저해활성을 보였다. L. sulphureus는 lovastatin 생산량에 비해 높은 저해활성을 나타내서 lovastatin 이외의 다른 고지혈증 억제물질을 GC/MS로 분석한 결과 대사산물로 분비되는 식물성 sterol 물질인 campesterol과 gamma-sitosterol이 검출되었다.
국내에서 식용버섯으로 이용되고 있는 8종 균주의 자실체와 균사체로부터 콜레스테롤 합성을 저해하는 lovastatin 생산과 고지혈증 억제활성을 탐색하였다. TLC 분석으로 lovastatin생산 유무를 검색한 결과 자실체와 균사체의 추출물에 대해 Rf값이 표준물질콰 같은 약 0.46에서 뚜렷한 밴드가 형성됨을 확인하였다. 자실체로부터 lovastatin 추출을 위한 용매로는 water/acetonitrile/methanol (5:2.5:2.5)을 사용하였을 매 가장 효과적인 lovastatin 생산량을 보였다. Lovastatin 생산량은 자실체 중에서는 Pleurotus ostreatus가 0.98 mg/g (dry biomass)으로 가장 높은 생산량을 나타냈고 균사체 배양액 추출물에 대해서도 P. ostreatus가 21.90 mg/L로 높은 생산량을 나타냈다. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase 저해활성에서는 자실체에서 P ostreatus가 67.8%, 균사체에서 P. ostreatus와Laetiporus sulphureus가 각각 37.2%, 29.1%의 저해활성을 보였다. L. sulphureus는 lovastatin 생산량에 비해 높은 저해활성을 나타내서 lovastatin 이외의 다른 고지혈증 억제물질을 GC/MS로 분석한 결과 대사산물로 분비되는 식물성 sterol 물질인 campesterol과 gamma-sitosterol이 검출되었다.
This research was performed to determine the production of lovastatin and its HMG-CoA reductase activity produced by fruit bodies and mycelial liquid cultures of domestic edible mushrooms (8 fungal strains). By deter-mining TLC analysis for the confirmation of the presence of lovastatin, all the ext...
This research was performed to determine the production of lovastatin and its HMG-CoA reductase activity produced by fruit bodies and mycelial liquid cultures of domestic edible mushrooms (8 fungal strains). By deter-mining TLC analysis for the confirmation of the presence of lovastatin, all the extracts from fruit bodies and mycelial liquid culture showed same Rf value (0.46), whick was identical to that of the standard lovastatin. In order to extract lovastatin from fruit body, the mixture of water/acetonitrile/methanol was chosen as the most effective solvent. Extracts from fruit body and mycelial liquid culture of pleurotus ostreatus produced the high-est lovastatin 0.98 mg/g based on dry biomass, and 21.90 mg/L, respectively. In the inhibition rate of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase, the highest was obtained in P. ostreatus as 67.8% among fruit bodies, and the rates of mycelial liquid culture extracts from P. ostreatus and Laetiporus sulphureus were 37.2% and 29.1%, respectively. Unusually L. sulphureus showed high inhibition rate with low content of lovastatin due to the contribution of campesterol and gamma-sitosterol with hypocholesterolemic activity as metabolites.
This research was performed to determine the production of lovastatin and its HMG-CoA reductase activity produced by fruit bodies and mycelial liquid cultures of domestic edible mushrooms (8 fungal strains). By deter-mining TLC analysis for the confirmation of the presence of lovastatin, all the extracts from fruit bodies and mycelial liquid culture showed same Rf value (0.46), whick was identical to that of the standard lovastatin. In order to extract lovastatin from fruit body, the mixture of water/acetonitrile/methanol was chosen as the most effective solvent. Extracts from fruit body and mycelial liquid culture of pleurotus ostreatus produced the high-est lovastatin 0.98 mg/g based on dry biomass, and 21.90 mg/L, respectively. In the inhibition rate of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase, the highest was obtained in P. ostreatus as 67.8% among fruit bodies, and the rates of mycelial liquid culture extracts from P. ostreatus and Laetiporus sulphureus were 37.2% and 29.1%, respectively. Unusually L. sulphureus showed high inhibition rate with low content of lovastatin due to the contribution of campesterol and gamma-sitosterol with hypocholesterolemic activity as metabolites.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 국내에서 식용으로 사용되는 버섯의 균사체 및 자실체를 대상으로 하여 함유하고 있는 lovastatin과 고지혈증 억제관련 물질을 탐색하고 함유량을 평가하여 식용버섯의 기능성 및 고부가가치를 제시하고자 하였다.
따라서 콜레스테롤 생합성에 관여하는 효소의 억제 활성을 자실체와 균사배양액 추출물에 대해 측정하였다.
제안 방법
4종의 식용버섯 1 kg을 액체질소를 이용하여 분쇄한 후 추출 용매 methanol:water (1:1, v/v, M/W), water:acetonitrile:methanol (525:2.5, v/v, M/A/M)을 사용하여 각각 추출하였다. 각각의 식용버섯에 2종류의 추출용매를 적용하였으며 30℃에서 150 rpm 으로 교반하면서 2일 동안 추출하였다.
주입구 온도는 250℃로 splitless 모드로 사용하였고 검출부 온도는 300℃ 였으며 오븐 온도는 7VC에서 10분간 유지한 후 lOP/min의 속도로 310℃까지 상승시킨 후 3KTC에서 10분간 유지하면서 분석을 수행하였다. GC 컬럼은 mass selective detector에 직접 연결되었으며 물질 분석은 EI 모드에서 70 eV, 50-400 amu로 2초간 scanning하여 내장된 library (Wiley Registry of Mass Spectra Data, 7th ed.)와 비교하였다(4).
5, v/v, M/A/M)을 사용하여 각각 추출하였다. 각각의 식용버섯에 2종류의 추출용매를 적용하였으며 30℃에서 150 rpm 으로 교반하면서 2일 동안 추출하였다. 추출액을 20배 농축하여 동량의 ethanol을 첨가하여 혼합한 후 -20℃에서 24시간 방치하여 당을 침전시켰다.
공시균주는 Potato Dextrose Agar (PDA)배지에서 보관하여 사용하였으며, 6종의 식용버섯 균사체 배양을 위해서 lovastatin 생산용 배지인 rapeseed meal medium (RPM) 100 ml에 접종하여 30℃, 150 rpm으로 7일 동안 진탕 배양하여 배양액으로부터 lovastatin 생산을 확인하였다. RPM 배지조성은 lactose 4%, rapeseed meal 0.
균사체 배양액 추출물을 이용하여 HMG-CoA reductase 억제 활성을 조사한 결과 P. ostreatus 다음으로 L. sulphureiis의 억제 활성이 높게 나타나 L. sulphureus의 배양액에서 lovastatin 이외의 고지혈증 저해물질을 탐색하기 위해서 추출물에 대해 GC/MS 분석으로 대사산물을 조사하였다. Lovastatin 이외의 다른 대사산물에 의해 생성되는 유효 활성물질을 확인하기 위하여 GC/MS로 분석한 결과는 Fig.
45 pn PVDF syringe filter!- 이용하여 불순물을 제거하여 사용하였다. 시료 분리 및 lovastatin 정량은 Microsolv Clg (particle size 5 |im, length 25 cm) 컬럼이 장착된 HPLC (Spectrasystem P2000, Thermo separation products, USAX 사용하였으며, 이동 용매로 초기에는 5% acetonitrile과 95% water로 시작하였으며 최종적으로 1% water와 99% acetonitrile0] 되도록 30분 동안 gradient를 주어 물질을 분리하였다. 시료주입 량은 10㎕였으며 280 nm에서 signaK 검색하였고 flow rate는 0.
25 μmx30 m)를 사용하였다. 주입구 온도는 250℃로 splitless 모드로 사용하였고 검출부 온도는 300℃ 였으며 오븐 온도는 7VC에서 10분간 유지한 후 lOP/min의 속도로 310℃까지 상승시킨 후 3KTC에서 10분간 유지하면서 분석을 수행하였다. GC 컬럼은 mass selective detector에 직접 연결되었으며 물질 분석은 EI 모드에서 70 eV, 50-400 amu로 2초간 scanning하여 내장된 library (Wiley Registry of Mass Spectra Data, 7th ed.
추출액을 20배 농축하여 동량의 ethanol을 첨가하여 혼합한 후 -20℃에서 24시간 방치하여 당을 침전시켰다. 침전된 당은 원심분리기 (WMega 17R, Hanil, Korea)를 이용하여 6, 720xg 에서 20분 동안 원심분리 하여 제거한 후 상등액을 감압 농축, 건조한 후 2 ml의 메탄올을 첨가하여 TLC 및 HPLC 시료로 사용하였다.
대상 데이터
HMG-CoA reductase 억제활성을 즉정하기 위해 효소원 제조에 yeast인 Saccharomyces cerevisiae ATCC 96519를 사용하였다. S.
효소원 제조에 사용되는 Saccharomyces cerevisiae ATCC 96519는 한국미생물 보존센터로부터 분양받아 사용하였다. Lovastatin 표준물질과 효소저해 활성 측정에 사용되는 HMG-CoA, NADP, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, dithiothreitol 등은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
HMG-CoA reductase 억제활성을 즉정하기 위해 효소원 제조에 yeast인 Saccharomyces cerevisiae ATCC 96519를 사용하였다. S. cerevisiaee: 1% glucose, 0.5% polypeptone, 1% yeast extract를 포함하고 있는 배지에서 24, C에서 24시간 전배양하였다. & cerevisiae 배양액의 1%를 취해서 3% 이ucose, 0.
균사 배양액으로부터 대사산물을 분석하기 위해 gas chromato graphy (HP 4890, USA) - mass selective detector (HP 5792, US A)를 사용하였다. Carrier gas는 He, 유속은 1.
건조된 TLC plate는 254 nm에서 UV light를 이용하여 lovastatin 생산유무를 확인한 후 발색용액 50% H2SO4 및 iodine vaporf- 이용하여 재확인하였다. 비교시료로는 1 mM lovastatin을 사용하였다 (6).
시중에서 판매되는 국내산 식용 버섯 Pleurotus ostreatus (느타리버섯), Agaricus bisporus (양송이버섯), Lentinus edodes (표고버섯), Flammulina velutipes (팽이 버섯)을 구입하여 자실체를 사용하였으며, 균사체 배양에 사용되는 Laetiporus sulphureus (붉은덕다리버섯), Pholiota lubrica (꽈리비늘버섯), Hericium erinaceus (노루궁뎅이버섯), Pleurotus eryngii (새송이버섯), Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes는 서울대학교 농업생명과학대학 산림과학부 목재화학실에서 보유하고 있는 식용버섯 균주를 사용하였다. 효소원 제조에 사용되는 Saccharomyces cerevisiae ATCC 96519는 한국미생물 보존센터로부터 분양받아 사용하였다.
사용하였다. 효소원 제조에 사용되는 Saccharomyces cerevisiae ATCC 96519는 한국미생물 보존센터로부터 분양받아 사용하였다. Lovastatin 표준물질과 효소저해 활성 측정에 사용되는 HMG-CoA, NADP, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, dithiothreitol 등은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
HMG-CoA reducatse 활성은 Hulcher 등의 방법(12)에 따라 즉정하였다. Microsomal protein 1 mg, HMG-CoA 150 nM, NADP 2 μM, glucose-6-phosphate 3 μM, glucose-6-phosphate dehydrogenase 2 units, 시 료 100 pl를 혼합하여 37C에 서 30분 반응 시켰다.
효소원의 단백질량은 Bradford assay(2)에 의해 정량하였고 표준물질은 bovine serum albumin을 사용하였다.
성능/효과
1차적으로 lovastatin 생산유무를 TLC상으로 확인한 결과 자실체 4종, 균사체 6종에서 모두 lovastatin 생산을 확인할 수 있었다. 표준시료로 lovastatin을 사용하여 HryLC분석을 한 결과 retention time 약 23분대에서 peak를 관찰할 수 있었고, 자실체 4종과 균사체 6종에서 모두 같은 retention time에서 peak를 나타냈다.
A. lerrei/s부터 생산되는 lovastatin 생산량이 탄소원과 질소원에 따라 생산량에 영향을 미치는 것으로(11) 보고된 연구결과를 바탕으로 본 연구에서 사용된 6종의 식용버섯 균사체 배양액으로부터의 lovastatin 생산은 배지의 탄소원, 질소원 및 배양조건인 pH, rpm에 의해 영향을 받을 것으로 사료된다. 본 연구에서는 기존에 알려진 A.
3과 같다. L. sulphureust RPM배지에서 7 일 배양한 후 ethyl acetate로 추출하여 농축한 후 분석한 결과 L. sulphureus 대사산물로 retention time 35.82분에서 분자량 400.68인 campesterol, retention time 36.65분에서 분자량 414.71 인 gamma-sitosterol이 검줄되었다. Campesterol과 gamma-sitosterol 에 대한 mass spectrume Fig.
국내 식용버섯 자실체로부터 고지혈증 억제물질인 lovastatin이 생성됨을 확인하였으며 균사체 배양액으로부터도 lovastatin이 생성됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 균사체 배양액의 배지조성원인 탄소원, 복합 질소원, pH 등의 변이에 따라lovastatin 생산량이 차이가 나타날 것으로 예상되며, lovastatin 생산 최적 조건을 구명함으로써 자실체로부터 lovastatin 생산 증가를 가능하게 할 것으로 판단된다.
8%로 가장 높은 억제활성을 나타냈다. 균사배양액 주출물에서도 P. ostreatiis가 37.2%로 가장 높은 억제활성을 나타냈으나 자실체 보다는 낮았다.
72 mg/1 로 가장 낮은 값을 보였다. 균사체 배양액에서도 모두 lovastatin 생산을 보여주었지만 P. ostreatus 이외의 균사체에서는 매우 낮았다.
본 연구에서 사용한 TLC 조건으로 균사체 배양에 사용된 6종류의 배양 추출액에 대하여 lovastatin을 분리한 결과 여러 균에서 생산되는 다른 이차대사산물들과 확연히 구분됨을 알 수 있었다. Lovastatin의 경우 표준물질과 비교하여 Rf 값이 약 0.
5)을 추출용매로 사용하여 얻은 추출액을 HPLC로 분석한 결과이며 각 균주들의 lovastatin 생산량은 Table 1, 2에서 나타냈다. 자실체에서는 P. ostreatus가 lovastatin 생산량이 가장 높았으며 추출용매로는 acetonitle이 첨가된 용매에서 가장 높게 검출되었다. Water/acetonitle/methanol 주출물이 ethanol을 첨가하여 당을 제거한 것 보다 높은 생산량을 보였다.
자실체에서는 W/A/M용매에 의한 추출물에 대한 억제활성이 다른 추출용매에서보다 높은 값을 나타냈고 표준물질 1 mM lovastatin 에 대한 억제활성이 87.5%이며, P. ostreatus7\ 67.8%로 가장 높은 억제활성을 나타냈다. 균사배양액 주출물에서도 P.
표준시료로 lovastatin을 사용하여 HryLC분석을 한 결과 retention time 약 23분대에서 peak를 관찰할 수 있었고, 자실체 4종과 균사체 6종에서 모두 같은 retention time에서 peak를 나타냈다. Fig.
후속연구
이러한 결과를 바탕으로 균사체 배양액의 배지조성원인 탄소원, 복합 질소원, pH 등의 변이에 따라lovastatin 생산량이 차이가 나타날 것으로 예상되며, lovastatin 생산 최적 조건을 구명함으로써 자실체로부터 lovastatin 생산 증가를 가능하게 할 것으로 판단된다. 균사체 배양액으로부터 camesterol, gamma-sitosterol등의 식물성 sterol물질이 검줄되어고지혈증 억제물질로 lovastatin 뿐만 아니라 다양한 유효 활성 물질이 생산될 것이라 생각되며 균사체 유효활성성분 증가를 위한 방법에 대한 연구가 요구된다.
본 연구로 부터 얻어진 결과는 식용버섯에 함유되어 있는 고지혈증 저해물질 함유량 증가 방안에 대한 연구의 기초자료를 제공할 것이며 식용버섯 기능성화에 기여할 것으로 기대된다.
lerrei/s부터 생산되는 lovastatin 생산량이 탄소원과 질소원에 따라 생산량에 영향을 미치는 것으로(11) 보고된 연구결과를 바탕으로 본 연구에서 사용된 6종의 식용버섯 균사체 배양액으로부터의 lovastatin 생산은 배지의 탄소원, 질소원 및 배양조건인 pH, rpm에 의해 영향을 받을 것으로 사료된다. 본 연구에서는 기존에 알려진 A. ferreus로부터 lovastatin 생산을 위한 최적조건 배지인 RPM배지(16)를 사용하였지만 보다 높은 lovastatin 생산량을 위해서는 식용버섯 균사체에 적합한 최적 배지조건 탐색이 더욱 필요하다.
확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 균사체 배양액의 배지조성원인 탄소원, 복합 질소원, pH 등의 변이에 따라lovastatin 생산량이 차이가 나타날 것으로 예상되며, lovastatin 생산 최적 조건을 구명함으로써 자실체로부터 lovastatin 생산 증가를 가능하게 할 것으로 판단된다. 균사체 배양액으로부터 camesterol, gamma-sitosterol등의 식물성 sterol물질이 검줄되어고지혈증 억제물질로 lovastatin 뿐만 아니라 다양한 유효 활성 물질이 생산될 것이라 생각되며 균사체 유효활성성분 증가를 위한 방법에 대한 연구가 요구된다.
참고문헌 (18)
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