Pig6 DNA probe를 기반으로 하는 Prevotella intermedia ATCC 49046 균주-특이 PCR primer 개발 Development of prevotella intermedia ATCC 49046 Strain-Specific PCR Primer Based on a Pig6 DNA Probe원문보기
본 연구는 치주질환병인론 연구에 빈번히 사용되는 Prevotellaintermedia ATCC 49046 균주를 특이적으로 검출 및 동정할 수 있는 PCR primer를 개발하기 위하여 시행하였다. P. intermedia ATCC 49046 유전체 DNA를 추출하고, Hind III 제한효소를 이용하여 무작위 클로닝법으로 유전체 DNA 절편을 얻었다. Southern blot 분석법을 이용하여 DNA 절편의 특이성을 조사하였고, chain termination 법을 이용하여 핵산염기서열을 결정하였다. 이를 바탕으로 PCR primer를 설계하고, P. intermedia ATCC 49046에 대한 균주 특이성 및 검출 한계(민감도)를 조사하였다. Southern blot 분석 결과 Pig6 DNA probe는 서양인에서 분리 동정된 P. intermedia 균주와만 hybridization하였고, 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia균주들과는 반응이 없었다. Pig6 DNA probe는 813 bp의 핵산염기로 구성되어 있었으며, 이를 바탕으로 설계된 Pig6-F3와 Pig6-R3 primer 쌍에 의해서는 서양 균주에 특이적인 PCR산물이 증폭되었다. Pig6-60F와 Pig6-770R primer 쌍에 의해서는 P. intermedia ATCC 49046 유전체 DNA에서만 특이적인 PCR 산물이 증폭되었다. 두 가지 primer 쌍들 각각에 대한 P. intermedia 유전체 DNA량의 검출 한계를 알아보기 위한 민감도실험 결과 두가지 primer 쌍들 모두 4 pg (약2000마리)까지 검출 가능하였다. 이상의 연구결과를 종합하면, Pig6-60F와 Pig6-770R primer쌍은 P. intermedia ATCC 49046을 균주 특이적으로 동정할 수 있어, 이 균주의 보존적 측면에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 치주질환 병인론 연구에 빈번히 사용되는 Prevotella intermedia ATCC 49046 균주를 특이적으로 검출 및 동정할 수 있는 PCR primer를 개발하기 위하여 시행하였다. P. intermedia ATCC 49046 유전체 DNA를 추출하고, Hind III 제한효소를 이용하여 무작위 클로닝법으로 유전체 DNA 절편을 얻었다. Southern blot 분석법을 이용하여 DNA 절편의 특이성을 조사하였고, chain termination 법을 이용하여 핵산염기서열을 결정하였다. 이를 바탕으로 PCR primer를 설계하고, P. intermedia ATCC 49046에 대한 균주 특이성 및 검출 한계(민감도)를 조사하였다. Southern blot 분석 결과 Pig6 DNA probe는 서양인에서 분리 동정된 P. intermedia 균주와만 hybridization하였고, 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia균주들과는 반응이 없었다. Pig6 DNA probe는 813 bp의 핵산염기로 구성되어 있었으며, 이를 바탕으로 설계된 Pig6-F3와 Pig6-R3 primer 쌍에 의해서는 서양 균주에 특이적인 PCR산물이 증폭되었다. Pig6-60F와 Pig6-770R primer 쌍에 의해서는 P. intermedia ATCC 49046 유전체 DNA에서만 특이적인 PCR 산물이 증폭되었다. 두 가지 primer 쌍들 각각에 대한 P. intermedia 유전체 DNA량의 검출 한계를 알아보기 위한 민감도실험 결과 두가지 primer 쌍들 모두 4 pg (약2000마리)까지 검출 가능하였다. 이상의 연구결과를 종합하면, Pig6-60F와 Pig6-770R primer쌍은 P. intermedia ATCC 49046을 균주 특이적으로 동정할 수 있어, 이 균주의 보존적 측면에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
The purpose of this study is to develop the strain-specific PCR primers for the identification of prevotella inter-media ATCC 49046 which is frequently used in the pathogenesis studies of periodontitis. The Hind III-digested genomic DNA of P. intermedia ATCC 49046 were cloned by random cloning metho...
The purpose of this study is to develop the strain-specific PCR primers for the identification of prevotella inter-media ATCC 49046 which is frequently used in the pathogenesis studies of periodontitis. The Hind III-digested genomic DNA of P. intermedia ATCC 49046 were cloned by random cloning method. The specificity of cloned DNA fragments were determined by Southern blot analysis. The nucleotide sequence of cloned DNA probes was determined by chain termination method. The PCR primers were designed based on the nucleotide sequence of cloned DNA fragment. The data showed that Pig6 DNA probe were hybridized with the genomic DNA from P. intermedia strains (ATCC $25611^T$ and 49046) isolated from the Westerns, not the strains isolated from Koreans. The Pig6 DNA probe were consisted of 813 bp. Pig6-F3 and Pig6-R3 primers, designed base on the nucleotide Sequences Of Pig6 DNA Probe, were 3150 specific to the only both P. intermedia ATCC $25611^T$ and P. intermedia ATCC 49046. In the other hand, Pig6-60F and Pig6-770R primers were specific to the only P. intermedia ATCC 49046. The two PCR primer sets could detect as little as 4 pg of chromosomal DNA of P. intermedia. These results indicate that Pig6-60F and Pig6-770R primers have proven useful for the identification of P. intermedia ATCC 49046, especially with regard to the maintenance of the strain.
The purpose of this study is to develop the strain-specific PCR primers for the identification of prevotella inter-media ATCC 49046 which is frequently used in the pathogenesis studies of periodontitis. The Hind III-digested genomic DNA of P. intermedia ATCC 49046 were cloned by random cloning method. The specificity of cloned DNA fragments were determined by Southern blot analysis. The nucleotide sequence of cloned DNA probes was determined by chain termination method. The PCR primers were designed based on the nucleotide sequence of cloned DNA fragment. The data showed that Pig6 DNA probe were hybridized with the genomic DNA from P. intermedia strains (ATCC $25611^T$ and 49046) isolated from the Westerns, not the strains isolated from Koreans. The Pig6 DNA probe were consisted of 813 bp. Pig6-F3 and Pig6-R3 primers, designed base on the nucleotide Sequences Of Pig6 DNA Probe, were 3150 specific to the only both P. intermedia ATCC $25611^T$ and P. intermedia ATCC 49046. In the other hand, Pig6-60F and Pig6-770R primers were specific to the only P. intermedia ATCC 49046. The two PCR primer sets could detect as little as 4 pg of chromosomal DNA of P. intermedia. These results indicate that Pig6-60F and Pig6-770R primers have proven useful for the identification of P. intermedia ATCC 49046, especially with regard to the maintenance of the strain.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
intermedia ATCC 49046 유전체 DNA와만 반응하는 Pig6라고 명명된 DNA probe를 클로닝 하였다(미발표 자료). 본 연구는 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia 균주들과 서양인에서 분리 동정된 균주들(/ intermedia ATCC 2561#과 P. intermedia ATCC 49046)의 유전체 DNA를 이용하여 Pig6 DNA probe의 P. intermedia 5* 대한 종특이성 여부를 검증하고, 종-특이 PCR primer 쌍을 개발하고자 시행하였다.
intermedia 균주들의 상동성이 있는 유전자와 상동성이 차이가 있어서 미약한 반응 띠가 생겼다는 것이 가장 타당하리라 생각된다. 이러한 가설을 검증하기 위해서, 다음 연구에서는 low stringency 조건과 hybridization 온도를 낮주어서 Southern blot hybridization을 시행하고자 한다.
제안 방법
이때 PCR 조건은 다음과 같았다. 초기 변성은 94℃에서 5 분간 시행하였고, 변성(94。(2, 3분), 결합(5(TC 또는 55℃, 30초) 및 중합(721, 30초)의 세 과정을 32회 반복하고, 추가적인 중합 (72℃, 30초)을 10분간 시행하였다.
DNA probe는 DIG-High Prime (Roche Diagnostics, Germany) 을 이용하여 표지하였다. 표지 과정은 1 #의 DNA에 최종 부피가 16 #1 가 되도록 증류수를 넣고 끊는 물에서 10분간 가열하여 DNA를 변성시킨 후 재빨리 얼음에 넣어 식혔다.
DNA probe의 정제는 QIAEX II#(QIAGEN, USA)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 정제하였다.
PCRe AccuPowere PCR PreMix (Bioneer, Korea)와 Peltier thermal cycler (Model PTC-200 DNA engineTM, MJ Research, USA)를 이용하여 시행하였다. AccuPower# PCR PreMix에는 5 nmole씩의 4가지 deoxynucleoside triphosphate, 0.
Pig6 DNA probe의 핵산염기서열을 바탕으로 PrimerSelect 프로그램(DNASTAR)을 이용하여 PCR primer를 설계하였다(Table 1). 이때 설계된 primer 쌍은 Bioneer (Korea)에 의뢰하여 제작하였다.
Pig6 DNA 핵산염기서열을 바탕으로 두 가지의 PCR primer 쌍(Pig6-F3 와 Pig6-R3 primer 쌍 및 Pig6-60F와 Pig6-770R primer 쌍)들을 설계하였다. 이들을 이용하여 PCR을 시행한 결과 Pig6-F3와 Pig6-R3 primer 쌍은 Southern blot hybridization과 같이 P.
Southern blot을 시행하기 위해 각 세균에서 추출한 5 #의 genomic DNA를 0.8% agarose gel에 전기영동하고 Vacuum Blotter (Model 785, Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여 통상의 vacuum transfer 법으로 Nylon membrane (Roche Diagnostics)에 옮기고, 120℃ 진공오븐에서 30분 동안 가열하여 DNA를 membrane에 고정시켰다. Hybridizatione 통법으로 시행하였다.
intermedia ATCC 49046 유전체 DNA량의 검출 한계를 알아보기 위한 민감도 실험을 실시하였다. 그 결과 두 가지 primer 쌍들 모두 4 pg (약 2000마리) 까지 검출 가능하였다(Fig.
nigrescens 임상분리 균주 유전체 DNA 4 #1를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 또한 각각의 PCR 쌍의 민감도 (sensitivity)를 즉정하기 위하여 유전체 DNA 4 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석하여 PCR 주형으로 사용하였다.
nigrescens ChDC B270 등은 한국인의 치은연하 치면세균막에서 분리 및 동정하였다. 본 연구에 사용된 모든 균주들은 TSB (trypticase soy broth)에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HC1-H2O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 gg/ml vitamin #이 첨가된 배지에 접종하여 85% N2, 10% CO2, 5% %가 공급되는 37℃ 혐기성 세균배양기에서 1-2일간 배양하여 다음 실험에 사용하였다.
세균의 유전체 DNA는 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 세균 유전체 DNA를 주줄하였다.
intermedia ATCC 49046 동정을 위한 primer 쌍의 종-특이성을 알아보기 위하여, 15종의 Prevotella spp.에 대한 표준균주와 9 균주의 P. intermedia 임상분리 균주 및 5 균주의 P. nigrescens 임상분리 균주 유전체 DNA 4 #1를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 또한 각각의 PCR 쌍의 민감도 (sensitivity)를 즉정하기 위하여 유전체 DNA 4 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석하여 PCR 주형으로 사용하였다.
03 M의 MgCl2 그리고, 1 unit의 Taq DNA polymerase가 들어있다. 여기에 2 ng의 세균 유전체 DNA와 20 pM의 각각의 프리이머 쌍을 넣고 PCR을 시행하였다. 이때 PCR 조건은 다음과 같았다.
증폭물은 ethidium bromideS. 염색하여 UV transillurrdnator로 발색시켜 크기를 확인하였다.
최근 본 연구팀은 IDBH 검색법을 이용하여 P. intermedia ATCC 2561#과 P. intermedia ATCC 49046 유전체 DNA와만 반응하는 Pig6라고 명명된 DNA probe를 클로닝 하였다(미발표 자료). 본 연구는 한국인에서 분리 동정된 P.
핵산염기서열 결정은 Bioneer (Korea)에 의뢰하여 결정하였다. 이때 사용되는 primer는 ChDC-GEM-F (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AA-3, )와 ChDC-GEM-R (5'-GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA AC-3, )을 이용하였으며, 그 결과는 SeqMan 프로그램 (Version 5.
대상 데이터
dentalis ATCC 49556, R pallens ATCC 700821T 및 R enoeca ATCC 51261t 등이다. 이들 균주들은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한, 임상에서 분리 동정 된 Prevotella spp.
데이터처리
결정하였다. 이때 사용되는 primer는 ChDC-GEM-F (5'-TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AA-3, )와 ChDC-GEM-R (5'-GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA AC-3, )을 이용하였으며, 그 결과는 SeqMan 프로그램 (Version 5.00; DNASTAR, USA)을 이용하여 분석하였다. 핵산염기서열 결정 후 염기서열의 상동성 검색은 미국 국립보건원에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하였다.
이론/모형
8% agarose gel에 전기영동하고 Vacuum Blotter (Model 785, Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여 통상의 vacuum transfer 법으로 Nylon membrane (Roche Diagnostics)에 옮기고, 120℃ 진공오븐에서 30분 동안 가열하여 DNA를 membrane에 고정시켰다. Hybridizatione 통법으로 시행하였다.
표지된 DNA probe가 membrane 상의 표적 DNA 가닥과 hybridization됨을 알아보기 위한 검출 과정은 Roche Diagnostics 사의 chemiluminescent detection kit를 사용하였으며, 제조회사의 지시대로 시행하였다.
00; DNASTAR, USA)을 이용하여 분석하였다. 핵산염기서열 결정 후 염기서열의 상동성 검색은 미국 국립보건원에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하였다.
성능/효과
2). P. intermedia 17 균주의 전체 유전체 DNA의 핵산염 기서 열이 The Institute of Genomic Research (TIGR)에 의해 밝혀져 있고, 이 연구소에서 제공하는 BLASTN 프로그램으로 상동성 검색을 한 결과, 2개의 아직 기능이 밝혀지지 않은 hypothetical 단백질과 핵산염기서열 수준에서 하나는 72%, 다른 하나는 61% 상동성을 보였다. Pig6 DNA probe의 핵산 염기서열을 미국립보건원에서 제공해주는 BLASTX 프로그램을 이용하여 아미노산 수준에서 상동성이 있는 단백질을 검색한 결과 아직 기능이 밝혀져 있지 않는 hypothetic protein, pyoverdine chromo-phore precursor synthetase, phospholipase D와 같은 단백질과 가장 유사성이 있는 것으로 조사되었다(Table 2).
intermedia 17 균주의 전체 유전체 DNA의 핵산염 기서 열이 The Institute of Genomic Research (TIGR)에 의해 밝혀져 있고, 이 연구소에서 제공하는 BLASTN 프로그램으로 상동성 검색을 한 결과, 2개의 아직 기능이 밝혀지지 않은 hypothetical 단백질과 핵산염기서열 수준에서 하나는 72%, 다른 하나는 61% 상동성을 보였다. Pig6 DNA probe의 핵산 염기서열을 미국립보건원에서 제공해주는 BLASTX 프로그램을 이용하여 아미노산 수준에서 상동성이 있는 단백질을 검색한 결과 아직 기능이 밝혀져 있지 않는 hypothetic protein, pyoverdine chromo-phore precursor synthetase, phospholipase D와 같은 단백질과 가장 유사성이 있는 것으로 조사되었다(Table 2).
Pig6 DNA probe의 핵산염기서열을 미국립보건원에서 제공하는 BLASTN 프로그램을 이용하여 핵산염기서열 수준에서의 상동성을 검색한 결과 현재의 GenBank 데이터베이스에서는 상동성을 갖는 유전자가 존재하지 않았다. 그래서 BLASTX 프로그램을 이용하여 단백질 수준에서의 상동성 검색을 실시한 결과, 아직 기능이 밝혀져 있지 않는 단백질, Pseudomonas syringae pv.
그래서 BLASTX 프로그램을 이용하여 단백질 수준에서의 상동성 검색을 실시한 결과, 아직 기능이 밝혀져 있지 않는 단백질, Pseudomonas syringae pv. phaseolica 1448A 균주의 pyoverdine chromophore 전구체합성 효소, Saccharomyces cerevisiae의 phospholipase D 등과 19- 29% 범주에서 상동성을 보였다.
실험을 실시하였다. 그 결과 두 가지 primer 쌍들 모두 4 pg (약 2000마리) 까지 검출 가능하였다(Fig. 4).
3B). 또한 이들 두 가지 PCR primer 쌍들은 모두 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia 또는 P. nigrescens 균주의 유전체 DNA들을 주형으로 하는 PCR 결과에서 모두 음성 반응을 보였다.
본 연구 결과 Pig6 DNA probe가 P. intermedia ATCC 25611# 와 P. intermedia ATCC 49046 균주를 제한효소 절편길이다양성(restriction fragment length polymorphism; RFLP)에 의해 두 균주를 동정하는데 이용될 수 있음을 알았다(Fig. 1). 최근 Shin 등(13)은 P.
본 연구 결과 Pig6 DNA probe는 서양인에서 분리 동정된 P. intermedia ATCC 256111와 P. intermedia ATCC 49046 균주들의 유전체 DNA들과 강한 hybridization 반응 띠가 형성되었지만, 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia 균주들과는 거의 반응을 하지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과의 원인을 현재의 연구만으로는 알 수 없지만, Pig6 DNA probe의 핵산염기서열에 코딩된 단백질이 서양인과 한국인 또는 동양인 숙주에 따라 존재 여부가 틀리거나, 유전자가 있지만 핵산염기서열의 상동성에 차이가 많이 나기 때문에 생긴 결과라 생각된다.
본 연구결과를 종합하면 Pig6 DNA probe는 서양인에서 분리 동정 된 균주들의 유전체 DNA와만 hybridization하였고, Pig6 DNA 염기서열을 결정하여 PCR primer 쌍을 설계한 결과, P. intermedia ATCC 2561#과 P. intermedia ATCC 49046 두 균주에 특이한 PCR primer 쌍과 P. intermedia ATCC 49046 균주에 특이한 PCR primer 쌍이 개발되었다. 이러한 결과는 Pig6 DNA probe와 이를 바탕으로 개발된 PCR primer 쌍들이 인종간의 P.
이러한 결과의 원인을 현재의 연구만으로는 알 수 없지만, Pig6 DNA probe의 핵산염기서열에 코딩된 단백질이 서양인과 한국인 또는 동양인 숙주에 따라 존재 여부가 틀리거나, 유전자가 있지만 핵산염기서열의 상동성에 차이가 많이 나기 때문에 생긴 결과라 생각된다. 이러한 가설들 중에서 Pig6 DNA probe의 핵산염기서열이 한국인에서 분리 동정된 P. intermedia 균주들의 상동성이 있는 유전자와 상동성이 차이가 있어서 미약한 반응 띠가 생겼다는 것이 가장 타당하리라 생각된다. 이러한 가설을 검증하기 위해서, 다음 연구에서는 low stringency 조건과 hybridization 온도를 낮주어서 Southern blot hybridization을 시행하고자 한다.
intermedia ATCC 49046 균주에 특이한 PCR primer 쌍이 개발되었다. 이러한 결과는 Pig6 DNA probe와 이를 바탕으로 개발된 PCR primer 쌍들이 인종간의 P. inEnedia의 유전학적 차이에 대한 연구 및 P. intermedia ATCC 2561#과 R intermedia ATCC 49046 균주들의 동정에 유용하게 사용될 수 있음을 간접 적으로 시사하는 것으로 사료된다.
참고문헌 (16)
Dorn, B.R., K.L. Leung, and A. Progulske-Fox. 1998. Invasion of human oral epithelial cells by Prevotella intermedia. Infect. Immun. 66, 6054-6057
Dzink, J.L., S.S. Socransky, and A.D. Haffajee. 1988. The predominant cultivable microbiota of active and inactive lesions of destructive periodontal diseases. J. Clin. Periodontol. 15, 316-323
Kim, H.S., S.K. Song, S.Y. Yoo, D.C. Jin, H.S. Shin, C.K. Lim, M.S. Kim, J.S. Kim, S.J. Choe, and J.K. Kook. 2005. Develop-ment of strain-specific PCR primers based on a DNA probe Fu12 for the identification of Fusobacterium nucleatum subsp. nuclea-tum ATCC $25586^{T}$ . J. Microbiol. 43, 331-336. Erratum in: J. Microbiol. 2005. 43, 473
Kim, S.J., M.S. Ha, E.Y. Choi, J.I. Choi, and I.S. Choi. 2004. Prevotella intermedia lipopolysaccharide stimulates release of nitric oxide by inducing expression of inducible nitric oxide synthase. J. Periodontal Res. 39, 424-431
Kook, J.K., T. akamoto, K. Nishi, M.K. Kim, J.H. Seong, Y.N. Son, and D.K. Kim. 2005. Detection of Tannerella forsythia and/ or Prevotella intermedia might be useful for microbial predictive markers for the outcome of initial periodontal treatment in Koreans. Microbiol. Immunol. 49, 9-16. Erratum in: Microbiol. Immunol. 2005. 49, 295
Kook, J.K., J.J. Han, H.S. Kim, J.H. Seong, D.K. Kim, D.H. Baek, and S.J. Choe. 2003. Cloning of a potentially strain-specific DNA probe of Prevotella intermedia ATCC 25611 by inverted dot blot hybridization screening method. J. Microbiol. Biotechnol. 13, 282-286
Krieg, N.R. 2001. Identification of Procaryotes, p. 33-38. In G. Garrity (ed.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2th ed. Springer Verlag, New York, U.S.A
Milsom, S.E., S.V. Sprague, D. Dymock, A.J. Weightman, and W.G. Wade. 1996. Rapid differentiation of Prevotella intermedia and P. nigrescens by 16S rDNA PCR-RFLP. J. Med. Microbiol. 44, 41-43
Okamoto, M., N. Maeda, K. Kondo, and K.P. Leung. 1999. Hemolytic and hemagglutinating activities of Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens. FEMS Microbiol. Lett. 178, 299- 304
Papapanou, P.N., A.M. Neiderud, A. Papadimitriou, J. Sandros, and G. Dahlen. 2000. 'Checkerboard' assessments of periodontal microbiota and serum antibody responses: a case-control study. J. Periodontol. 71, 885-897
Saito, K., N. Takahashi, H. Horiuchi, and T. Yamada. 2001. Effects of glucose on formation of cytotoxic end-products and proteolytic activity of Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens and Porphyromonas gingivalis. J. Periodontal Res. 36, 355-360
Shin, Y.K., S.U. Jeong, S.Y. Yoo, M.K. Kim, H.S. Kim, B.O. Kim, D.K. Kim, H.K. Hwang, and J.K. Kook. 2004. Pi30 DNA probe may be useful for the identification of Prevotella intermedia at the species or strain level. Microbiol. Immunol. 48, 931-936
Slots, J., L. Bragd, M. Wikstrom, and G. Dahlen. 1986. The occurrence of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides gingivalis and Bacteroides intermedius in destructive periodontal disease in adults. J. Clin. Periodontol. 13, 570-577
Slots, J. and M.A. Listgarten. 1988. Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius and Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal diseases. J. Clin. Periodontol. 15, 85- 93
Socransky, S.S., A.D. Haffajee, J.L. Dzink, and J.D. Hillman. 1988. Associations between microbial species in subgingival plaque samples. Oral Microbiol. Immunol. 3, 1-7
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.