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문제 정의
- 본 실험은 항산화, 항암작용 등 여러 작용 가능성을 가지고 있는 것으로 알려진 녹차 추출성분 중 특히 주요 활성 물질인 EGCG를 이용하여 정상 면역세포와 종양 세포주에 대하여 EGCG의 처리가 세포성장에 어떤 영향을 미치는지 관찰하고 방사선조사와 병행하여 EGCG를 처리하였을 때 암세포 사멸효과가 어떻게 나타나는 지를 조사하였다.
제안 방법
- 2회 정도 반복하여 세척한 후 상층액을 버리고 침전세포에 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액을 넣어 세포수를 5×104/100 μl정도로 세포수를 조절하였다. 15ml 원심분리관에 4개 조절된 세포를 5ml씩 각각 넣고 대조세포(control cell)를 제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3 Gy(300 rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다. 조사된 세포를 96 well plate의 각 well 에 100 씩분주한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다.
- 세포주를 15 ml 원심분리 관에 넣고 Penicillin-streptomycin과 Fungizone 및 10% FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어서 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 2회 정도 반복하여 세포주에 있는 DMSO를 세척하여 제거시킨 후 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액에 세포 수를 2 × 104ml 정도로 조정한 후 culture flask에 넣어서 섭씨 37℃, 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 배양하였다. 세포수가 지나치게 많아지면 세포를 원심분리하여 배양액을 교환하고 3~4일에 한 번씩 숫자를 줄여서 계대 배양하였다.
- FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어 800 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 2회 정도 세척을 반복한 후 상층 액을 버리고 침전세포에 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액으로 세포수를 5×104/100 μl로 조정한 후 조정된 세포를 15 ml 원심분리관 4개에 각각 3ml씩 분주하고 여기에 EGCG 희석액(40 μg/ml, 50 μg/ml, 60μg/ml, 농도별로 희석한 EGCG 용액)을 각 농도별로 3ml씩 분주하여 가볍게 흔들어 잘 혼합한 후에 37℃, 100% 습도를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 6시간 배양하였다. 6시간 배양된 세포주를 비교 세포(control cell)를제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3Gy(300rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다.
- 2회 정도 세척을 반복한 후 상층 액을 버리고 침전세포에 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액으로 세포수를 5×104/100 μl로 조정한 후 조정된 세포를 15 ml 원심분리관 4개에 각각 3ml씩 분주하고 여기에 EGCG 희석액(40 μg/ml, 50 μg/ml, 60μg/ml, 농도별로 희석한 EGCG 용액)을 각 농도별로 3ml씩 분주하여 가볍게 흔들어 잘 혼합한 후에 37℃, 100% 습도를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 6시간 배양하였다. 6시간 배양된 세포주를 비교 세포(control cell)를제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3Gy(300rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다. 조사된 세포를 96 well plate의 각 well에 100 μl씩 분주한 다음 370에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다.
- 1, 2). 따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다. 서로 다른 농도의 녹차 EGCG를 투여 후 48시간째에 3 Gy의 방사선을 조사한 집단의 세포 생존율은 EGCG 무 처리 군이 0.
- 방사선조사와 녹차 EGCG 처리는 개별적으로 혈구암세포의 사멸을 유도하였다(Fig. 1, 2). 따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다.
- 가볍게 혼합한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 또는 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 XTT kit(Roche, Swiss)를 이용하여 각각의 생존율을 측정하였다. 대조군에는 약물대신 50μl의 배양액을 넣었다.
- 즉 3 Gy는 18초, 5 Gy 는 30초이고 7 Gy는 42초를 조사하였다. 배양된 세포는 XTT kit를 이용하여 각각의 생존율을 측정하였다.
- 조사된 세포를 96 well plate의 각 well 에 100 씩분주한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다. 배양된 혈구암세포를 XTT kit를 이용하여 생존율을 측정하였다.
- 혈구암세포인 HL-60세포의 생존율을 측정하기 위하여 cell proliferation kit(Boehrinrer-Mannheim, Germany)는 정량 kit인 XTT kit를 사용하였다. 배양하던 세포를 hemocytometer를 이용하여 96 well plate로 100μl 배양액 안에 5×104/well이 되게 분주한 다음 CO2 incubator 안에 넣고 48시간, 72시간 각각 배양된 96 well에 XTT assay kit(Boehrinrer Mannheim, Germany)를 이용하였다. 각각 배양된 96 well에 XTT 반응액 50μl을 넣어 섭씨 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양시킨 후 490 nm 파장에서 ELISA 판독기(EMAX, Molecular Device, U.
- 혈구암세포인 HL-60세포의 생존율을 측정하기 위하여 cell proliferation kit(Boehrinrer-Mannheim, Germany)는 정량 kit인 XTT kit를 사용하였다. 배양하던 세포를 hemocytometer를 이용하여 96 well plate로 100μl 배양액 안에 5×104/well이 되게 분주한 다음 CO2 incubator 안에 넣고 48시간, 72시간 각각 배양된 96 well에 XTT assay kit(Boehrinrer Mannheim, Germany)를 이용하였다.
- 혈액 조사장치에서의 암세포 조사는 아래 수식에 의하여 각각 1 Gy/6 sec씩 조사하였다. 즉 3 Gy는 18초, 5 Gy 는 30초이고 7 Gy는 42초를 조사하였다.
- 혈액암세포인 HL-60 세포주에 EGCG를 처리하여 농도별로 세포생존율을 비교하였다. HL-60 세포주의 EGCG 처리 후 48시간 배양에서는 대조군에 비해 농도가 높아질수록 점차적으로 완만하게 세포사멸이 증가시키는 경향을 보였다.
대상 데이터
- 세포수가 지나치게 많아지면 세포를 원심분리하여 배양액을 교환하고 3~4일에 한 번씩 숫자를 줄여서 계대 배양하였다. 본 실험에서는 8~10대 사이의 계대배양 중인 대수기의 증식력이 왕성한 세포를 이용하였다.
- 세포 계대배양에 사용되는 CO2 배양기(Model Qwj- 300T, U.S.A)를 사용하였고, 세포독성 측정을 위한 생존율 검사시 사용되는 위상차 현미경(Olympus IMT-2-21) 및 XTT즉정을 위한 microplate reader(ELISA reader ; EMAX, Molecular Device, U.S.A)를 사용하였으며, 세포 방사선 선량별 조사에 사용한 blood irradiator는 전남대학교병원 임상연구소에 있는 Nodion사의 Gammacell 3000 Elan system. (Canada, 선원 : 60Co gamma ray)을 사용하였다.
- 실험에 사용된 암세포주는 인체기원 암세포주로 전골 수성 백혈병 세포주, HL-60(Human leukemia, acute promyelocyte)과 정상면역세포주, NC-37(Human B cell : B lymphoblast)를 이용하였다. 세포주를 15 ml 원심분리 관에 넣고 Penicillin-streptomycin과 Fungizone 및 10% FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어서 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.
- 실험에 사용한 녹차 추출물인 EGCG는 (95~98% poly-phenols(>80% catechin(EGCG>45%), < 3% caffeine)Sigma(USA) 에서 구입하였다. 정제된 녹차 추출물인 EGCG 0.
성능/효과
- 조사에서 뚜렷하게 관찰된다. 7 Gy와 5 Gy에서 10% 미만의 상승효과를 보이던 EGCG 처리효과는 3 Gy에서 35%까지 증가한다. 방사선조사는 일반적으로 많은 정상 세포의 손실을 초래하는데 저선량 방사선과 녹차 처리로써 암세포를 효과적으로 제거할 수 있을 것이라는 가능성을 보여준다.
- 세포생존율을 비교하였다. HL-60 세포주의 EGCG 처리 후 48시간 배양에서는 대조군에 비해 농도가 높아질수록 점차적으로 완만하게 세포사멸이 증가시키는 경향을 보였다. EGCG는30μg/ml까지는 90%의 생존율을 유지하다가, 40μg/ml에서는 80%, 80μg/ml에서는 약 70%까지 생존율이 감소하였다.
- Guo 등10)은 green tea polyphenol (GTPP) 성분인 EGCG, ECG, EGC(-) epigallocatechin, EC (epicacatechin) 등이 synaptosome에서 iron-induced lipid peroxidation 억제 효과를 관찰하였는데, EGCG>ECG>EGC>EC 등의 순으로 lipid peroxidation 생성을 억제시키고, hydroxyradical (HO) 배기 능력은 ECG> EC> EGOG> EGC 순으로 감소시킴을 관찰하였다 Otsuka 등 11)은 사람과 생쥐 leukemic cell line인 K562, KG1, THP-1, U397, NFS60 세포주를 이용여 0μM, 10μM, 50μM, 100μM, 10000μM 등 각각의 EGCG 농도에 따른 세포주의 생장률을 36시간 경과 후 MTT 분석을 통해서 관찰하였고, colony 형성은 14 일 경과 후 관찰하였다. colony 형성의 경우 모두 100 zzM 농도 이상의 경우에서만 암세포주 생장억제 및 colony 형성을 억제시킴을 관찰할 수 있었는데, 특히, 생쥐 세포주인 NFS60 세포주의 경우는 사람과는 달리 20μM에서 암세포 생장률을 억제함이 관찰되었다.
- 녹차 EGCG의 처리시간을 72시간으로 늘렸을 때도 암세포사멸 상승효과는 48시간 처리 군과 유사한 형태를 나타내었다(Table 3). 가장 큰 사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 3 Gy의 방사선을 처리하여 얻을 수 있었으며 이때 처리 상승효과는 약 35%까지 증가하였다.
- 73으로 3 Gy의 방사선을 조사한 집단보다 약간 더 사멸하였다. 그런데 EGCG 를 각각 40, 50, 60 μg/ml 농도로 처 리한 세포에 동일한선량으로 방사선조사를 하면 EGCG만 단독처리한 세포군에 비교하여 예상값보다 각각 3.1%, 26.2%, 23.3% 더 사멸하는 상승효과가 나타났다(Table 2, Fig. 3). 방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다.
- 2). 그리고 72시간 배양에서 대조군과 비교하여 볼 때 3 Gy에서는 약 40%의 세포 감소율을 보였으며 5 Gy에서는 46%, 7 Gy에서는 약 75%의 세포 감소율을 보임으로서 방사선 선량이 높을수록 그리고 배양 시간이 경과할수록 세포수의 감소가 더 크게 관찰되었다. 시간이 경과하여도 세포수 증가가 관찰되지 않는 것은 방사선 조사가 세포분열을 억제하는 결과를 유도하였음을 의미한다.
- 녹차의 EGCG는 단독처리 했을 때 혈구암세포 사멸유도 효과를 나타내며 방사선조사와 병행처리 하였을 때는 방사선의 사멸효과를 증진시키는 결과를 보였다. 이와 같은 결과는 기존의 연구와 일치한다.
- 본 연구에서는 40~60㎛의 미량의 EGCG를 처리하여 암세포에 대한 사멸촉진 상승효과를 확인할 수 있었다. 또한, 방사선조사 전, 후 EGCG 첨가 유무에 따른 혈구암 세포주 성장률을 비교한 결과 방사선 단독처리 세포에서보다 현저한 암세포 억제가 있는 것을 확인하였으며, 고선량보다 저선량에서 상승효과가 높게 나타난 사실을 관찰할 수 있었다. 특히, 녹차 EGCG의 처리가 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않았는데 이 사실은 녹차 EGCG처리에 의해 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 것이라는 점을 시사한다.
- NC-37세포는 분열 속도가 느릴 뿐만 아니라 EGOG에 의해서 세포 사멸이유도 되지도 않았다. 반대로 낮은 농도의 EGCG처리(10μg/ml)시에 오히려 세포분열이 10% 정도 증가하는 결과를 나타내었다.
- 3). 방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다. 암세포사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 가장 높게 나타났다(Fig.
- 정상 세포를 보호하는 기능을 나타낸다. 본 실험결과를 보면(Table 1, Fig. 1) EGCG가 암세포에 대해서는 강력한 사멸유도 효과를 보이지만(100μg/ml에서 50% 정도사멸), 동일한 농도에서 정상세포는 거의 사멸되지 않는다. 이런 결과는 안정된 분열조절체계를 지닌 정상 세포가, 불안정한 분열 조절체계를 지닌 암세포에 비해서 독성작용을 덜 받기 때문인 것 같다.
- 본 연구에서 녹차 처리와 방사선조사를 병행하였을 때 세포사멸은 상승적으로 증가하는데 특히 그 효과는 저선량 조사에서 뚜렷하게 관찰된다. 7 Gy와 5 Gy에서 10% 미만의 상승효과를 보이던 EGCG 처리효과는 3 Gy에서 35%까지 증가한다.
- 방사선조사는 일반적으로 많은 정상 세포의 손실을 초래하는데 저선량 방사선과 녹차 처리로써 암세포를 효과적으로 제거할 수 있을 것이라는 가능성을 보여준다. 본 연구에서는 40~60㎛의 미량의 EGCG를 처리하여 암세포에 대한 사멸촉진 상승효과를 확인할 수 있었다. 또한, 방사선조사 전, 후 EGCG 첨가 유무에 따른 혈구암 세포주 성장률을 비교한 결과 방사선 단독처리 세포에서보다 현저한 암세포 억제가 있는 것을 확인하였으며, 고선량보다 저선량에서 상승효과가 높게 나타난 사실을 관찰할 수 있었다.
- 따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다. 서로 다른 농도의 녹차 EGCG를 투여 후 48시간째에 3 Gy의 방사선을 조사한 집단의 세포 생존율은 EGCG 무 처리 군이 0.98로 세포사멸이 거의 나타나지 않았다(Table2, Fig. 3). EGCG 만을 40, 50, 60 μg/ml 농도로 처리한 세포에서는 생존율이 0.
- 방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다. 암세포사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 가장 높게 나타났다(Fig. 3). 녹차 EGCG의 처리시간을 72시간으로 늘렸을 때도 암세포사멸 상승효과는 48시간 처리 군과 유사한 형태를 나타내었다(Table 3).
후속연구
- 이상의 결과로 미루어 혈액암의 방사선 치료시 녹차 EGCG를 병행 처리하면 저선량의 방사선조사로도 정상세포의 손상을 최소화하면서 효과적으로 암세포를 사멸을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 방사선과 녹차 EGCG의 병행 처리효과가 다른 암세포에 대해서도 In vivo 처리에서도 동일한 효과를 나타내는지에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 특히, 녹차 EGCG의 처리가 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않았는데 이 사실은 녹차 EGCG처리에 의해 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 것이라는 점을 시사한다. 이상의 결과로 미루어 혈액암의 방사선 치료시 녹차 EGCG를 병행 처리하면 저선량의 방사선조사로도 정상세포의 손상을 최소화하면서 효과적으로 암세포를 사멸을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 방사선과 녹차 EGCG의 병행 처리효과가 다른 암세포에 대해서도 In vivo 처리에서도 동일한 효과를 나타내는지에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
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