Normally, environmental toxicants are classified as endocrine disruptors if they interfere with regulation of cellular function by endogeneous steroids through inhibition of receptor binding and/or transcriptional activation. So, many studies have been performed about agonist/antagonist of hormone r...
Normally, environmental toxicants are classified as endocrine disruptors if they interfere with regulation of cellular function by endogeneous steroids through inhibition of receptor binding and/or transcriptional activation. So, many studies have been performed about agonist/antagonist of hormone receptor to study mechanisms of endocrine disruptors. If toxicants affect steroid biosynthesis and/or degradation and alter hormone homeostasis, these also are classified as endocrine disruptors. But there are not many studies of the mechanisms of endocrine disruptors on the basis of alteration of steroid biosynthesis and/or degradation. Isolation and culture of Leydig cells from testis is one of methods for the steroidogenesis screening assays to evaluate a substance for altering steroidogenesis. Leydig cells were harvested using the method described by Klinefelter with modifications. Leydig cells were purified by perfusion of testis and incubation ($34^{\circ}C$, 80cycles/minute, 20 minutes) with collagenase (0.25 mg/kg), centrifugal elutriation, percoll gradient centrifugation and BSA multidensity gradient centrifugation. To confirm if this method is one of appropriate tools to evaluate a substance for altering steroidogenesis, ketoconazole, positive control was administered to purified Leydig cells. Ketoconazole ($10^{-8}M$ and above) significantly reduced testosterone production in purified Leydig cells. From above results, we suggest that this method for steroidogenesis screening assay appears to be a appropriate tool to detect suspected compounds for altering steroidogenesis.
Normally, environmental toxicants are classified as endocrine disruptors if they interfere with regulation of cellular function by endogeneous steroids through inhibition of receptor binding and/or transcriptional activation. So, many studies have been performed about agonist/antagonist of hormone receptor to study mechanisms of endocrine disruptors. If toxicants affect steroid biosynthesis and/or degradation and alter hormone homeostasis, these also are classified as endocrine disruptors. But there are not many studies of the mechanisms of endocrine disruptors on the basis of alteration of steroid biosynthesis and/or degradation. Isolation and culture of Leydig cells from testis is one of methods for the steroidogenesis screening assays to evaluate a substance for altering steroidogenesis. Leydig cells were harvested using the method described by Klinefelter with modifications. Leydig cells were purified by perfusion of testis and incubation ($34^{\circ}C$, 80cycles/minute, 20 minutes) with collagenase (0.25 mg/kg), centrifugal elutriation, percoll gradient centrifugation and BSA multidensity gradient centrifugation. To confirm if this method is one of appropriate tools to evaluate a substance for altering steroidogenesis, ketoconazole, positive control was administered to purified Leydig cells. Ketoconazole ($10^{-8}M$ and above) significantly reduced testosterone production in purified Leydig cells. From above results, we suggest that this method for steroidogenesis screening assay appears to be a appropriate tool to detect suspected compounds for altering steroidogenesis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
현재 미국 환경보호청(EPA)과 OECD (국제경제협력 개발 기구>에서 고환조직을 이용한 스테로이드 합성에 미치는 영향에 대한 검색 시험법이 연구되어 지고 있지만 이 시험법에 서는 고환조직을 구성하는 다양한 세포 (Leydig cell, sertoli cell, 정자, 적혈구, 마크로 파지 등)의 영향이 상존하고 있어 시험물질이 스테로이드 합성 세포에서 스테로이드 합성 및 대사에 미치는 영향을 직접적으로 관찰하기가 어려우며, 특히 배양 시 교반 하여 배양해야 하는 어려움이 있어서 기존의 안정적인 세포주의 배양시스템을 적용하기 힘든 문제점을 안고 있다. 따라서 본 연구에서는 고환조직에서 스테로이드 합성이 이루어지는 라이디히 세포 (Leydig cell)만을 순수분리 내분비계 장애 물질이 스테로이드 합성에 미치는 영향을 명확히 관찰하고 배양 시에도 기존의 세포주 배양 시스템을 적용하여 더욱 용이하게 관찰할 수 있는 시험법을 확립하여 기존의 에스트로겐, 안드로겐 수용체를 이용한 시험법, 고환조직을 이용한 스테로이드 합성에 미치는 영향에 대한 검색 시 험법 및 동물을 이용한 시험법을 보완하고자 하였다.
따라서 스테로이드 합성 및 저해를 교란함으로 나타나는 호르몬의 항상성 파괴에 영향을 주는 내분비계 장애 물질을 검색하는 시험법에 관한 연구는 많이 부족한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 스테로이드 합성을 저해함으로 호르몬의 항상성을 파괴하는 내분비계 장애물 질 검색을 위한 라이디히 세포의 분리 및 배양조건을 확립하고자 하였다.
제안 방법
10% 층에서 Leydig cell만을 수확하였다. 분리한 Leydig celle 0.4mM etiocholan-3/%ol-17-one을 기질로 사용하여 3"4iydroxysteroid dehydrogenase (3/?HSD)의 조직화학적 염색을 통해 순도를 측정하였다. Testosterone 합성능력을 보기 위해 Leydig cell을 1 x 105 세포의 농도로 34℃, 3시간 배양하여 원심분리 후 상등액을 모아 테스토스테론 농도를 측정하였다.
분리한 라이디히 세포가 내분비계 장애 물질 검색을 위해 유용한 지를 측정하기 위해 양성대조물질로 케토코나졸 (Ketoconazole)을 사용하였다. Ketoconazole (Sigma, St. Louis, MO, USA)은 10^12M, lOeM, lOeM, 10-3Me 농도로 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO 최종농도는 0.1 %를 넘지 않도록 시험하였다. 시험물질에 의한 라이디히 세포의 스테로이드 합성능력을 관찰하기 위하여 testosterone production assay를 실시하였다.
4mM etiocholan-3/%ol-17-one을 기질로 사용하여 3"4iydroxysteroid dehydrogenase (3/?HSD)의 조직화학적 염색을 통해 순도를 측정하였다. Testosterone 합성능력을 보기 위해 Leydig cell을 1 x 105 세포의 농도로 34℃, 3시간 배양하여 원심분리 후 상등액을 모아 테스토스테론 농도를 측정하였다.
배양 후 separation bufierS. seminferous tables를 분리한 후 원심분리 (800 xg, 20분)하여 pellet (Leydig cell, sperm, 적혈구 등)을 얻었으며, 이것은 55% pH 7.4 SIP (stock isotonic Percoll)를 사용하여 percoll (Sigma, St. Louis, MO, USA) 밀도구배 원심분리법을 수행하고, Bovine serum albumin (BSA) 다 구배 원심분리법 (1%, 2.5%, 5%, 10% BSA) 수행하였다. 10% 층에서 Leydig cell만을 수확하였다.
또한, luteinizing hormone (LH) 도 라이디히 세포의 테스토스테론 합성능력에 크게 영향을 준다 (Saez, 1994). 따라서 LH의 농도에 따른 라이디히 세포의 테스토스테론 합성능력을 관찰하였다. LH는 0.
랫드 고환에서 라이디히 세포를 분리배양 후 테스토스테론 합성능력을 평가할 때에는 호르몬 측정을 radioimmuno assay kit (DPC) 를 이용하였다. Total testosterone Ab- coated tube에 혈청 50μ1와 1ml 125I total testosterone을 넣어 혼합한 후 37℃, 3시간 동안 항온수조에서 반응하였다.
분리 배양한 라이디히 세포를 내분비계 장애 물질 검색에 활용할 수 있는지를 확인하기 위해 imidazole 계 살균제이며, 스테로이드 합성을 저해하여 전립선암 등의 치료제로 연구되어 온 케토코나졸을 시험물질로 사용하여 검증흐}였다. 케토코나졸은 분리한 라이디히 세포에서 1Km 이상부터 유의적인 테스토스테론 합성을 감소시켰다.
성숙한 90일령 랫드의 고환에서 분리한 라이디히 세포를 이용하여 내분비계 장애물 질의 스테로이드 호르몬 합성 능력을 저해하는 정도를 평가할 수 있는지를 알아보고자 스테로이드 합성을 저해하는 것으로 알려져 있는 케토코나졸을 양성 대 조 물질로 사용하여 평가하였다. 케토코나졸을 라이디 히 세포에 처리하여 배양한 후 배양액에서 테스토스테론양 을 측정한 결과, 10-8M 이상부터 용량 의존적으로 유의하게 감소되었다 (Fig.
성숙한 Sprague-Dawley 랫드 (90일령)에서 고환을 분리하여 Leydig cell를 klinefelter 방법을 변형하여 분리하였다. Collagenase 처리 시간에 따라 세포 수는 증가하였으나 (Data not shown) 라이디히 세포의 호르몬 합성능력은 감소하는 것으로 나타났다.
성숙한 랫드 (90일령)을 에테르 (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 마취시킨 후 고환을 분리하여 라이디히 세포를 분리하여 testosterone 생산능력을 관찰하였다. 라이디히 세포 분리는 Klinefelter 등의 방법으로 수행하였다 (Klinefelter et al.
1 %를 넘지 않도록 시험하였다. 시험물질에 의한 라이디히 세포의 스테로이드 합성능력을 관찰하기 위하여 testosterone production assay를 실시하였다. 시험물질 처리가 끝난 세포를 다시 수 확하여 1 X 10。cells/ml로 조정한 후 1.
따라서 여러 가지 과정이 필요하다. 우리는 Klinefelter 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. Collagenase (0.
Total testosterone Ab- coated tube에 혈청 50μ1와 1ml 125I total testosterone을 넣어 혼합한 후 37℃, 3시간 동안 항온수조에서 반응하였다. 이후 aspirator를 이용흐} 여 tube에 남은 용액을 제거한 후 gamma counter (PACKARD Co., COBRA II)로 혈청 내의 total 테스토스테론 농도를 측정하였다.
25mg/ml)는 34℃, 80cycles/min, 20분 배양하고 LH 농도는 1IUS. 하며, 스테로이드 합성을 교란하는 내분비계 장애 물질 검색을 위해 라이디히 세포을 9시간 배양한 후 시험물질 처리하여 다음 실험을 진행하였다.
대상 데이터
(주)샘 타코 (대전, 대한민국)에서 생산된 4주령, 7주령의 Sprague-Dawley 계열의 수컷 흰쥐를 분양받아 사용하였으며, 사육은 온도 23 + 0.5℃, 습도 55±5% 및 12시간 주기로 명암이 자동 조절되는 미국 실험동물관리 인증협회 (Association for Assessm ent and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)가 인증한'식품의약품안전청 국립 독성연구원 청정 사육시설 내에서 1주일간 순화하였다. 모든 시험 동물의 체중은 평균 체중 ±10%의 동물만을 선별하여 사용하였으며, 한 군당 10마리씩 총 50마리를 사용하였다.
5℃, 습도 55±5% 및 12시간 주기로 명암이 자동 조절되는 미국 실험동물관리 인증협회 (Association for Assessm ent and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)가 인증한'식품의약품안전청 국립 독성연구원 청정 사육시설 내에서 1주일간 순화하였다. 모든 시험 동물의 체중은 평균 체중 ±10%의 동물만을 선별하여 사용하였으며, 한 군당 10마리씩 총 50마리를 사용하였다.
분리한 라이디히 세포가 내분비계 장애 물질 검색을 위해 유용한 지를 측정하기 위해 양성대조물질로 케토코나졸 (Ketoconazole)을 사용하였다. Ketoconazole (Sigma, St.
데이터처리
얻어진 모든 실험 결과는 평균 土 표준편차로 표기하였고, MS-Excel (Ver. Office 2000)을 이용하여 one way analysis of variance (ANOVA) 검정을 실시하여 유의성이 인정된 경우, Dunnetfs test로 대조군과 각 투여 군간 다중비교를 실시하였다. P<0.
이론/모형
Louis, MO, USA)로 마취시킨 후 고환을 분리하여 라이디히 세포를 분리하여 testosterone 생산능력을 관찰하였다. 라이디히 세포 분리는 Klinefelter 등의 방법으로 수행하였다 (Klinefelter et al., 1993). 간략히 요약하면, 랫드에서 정소를 분리한 후 1 mg/ml collagenase를 함유한 dissociation buffer를 사'§하여 정소의 동맥을 관류하여 혈액을 제거하였다.
성능/효과
우리는 Klinefelter 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. Collagenase (0.25 mg/ml) 처리 시간에 따라 테스토스테론 합성능력과 라이디히 세포 수확율을 관찰한 결과 처리 시간이 길면 길수록 라이디히 세포 수는 증가하였지만 (Data not shown) 테스토스테론 합성능력은 떨어졌다. Collagenase 처리 시간을 30분으로 하는 것보다는 20분, 20분보다는 5분 할 때 테스토스테론 합성능력이 좋았다.
성숙한 Sprague-Dawley 랫드 (90일령)에서 고환을 분리하여 Leydig cell를 klinefelter 방법을 변형하여 분리하였다. Collagenase 처리 시간에 따라 세포 수는 증가하였으나 (Data not shown) 라이디히 세포의 호르몬 합성능력은 감소하는 것으로 나타났다. Collagenase 처리 시간을 20분과 30분으로 다르게 한 후 분리한 라이디히 세포의 배양액에서 테스토스테론을 측정한 결과, 30분 처리한 경우 20분 처리한 것에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig.
Collagenase 처리 시간에 따라 세포 수는 증가하였으나 (Data not shown) 라이디히 세포의 호르몬 합성능력은 감소하는 것으로 나타났다. Collagenase 처리 시간을 20분과 30분으로 다르게 한 후 분리한 라이디히 세포의 배양액에서 테스토스테론을 측정한 결과, 30분 처리한 경우 20분 처리한 것에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig. 1). 또한, 테스토스테론 합성능력을 평가한 결과에서도 20분, 30분 처리한 것은 5분 처리한 것에 비해 라이디히 세포의 테스토스테론 합성능력이 유의적으로 감소하였다 (Fig.
25 mg/ml) 처리 시간에 따라 테스토스테론 합성능력과 라이디히 세포 수확율을 관찰한 결과 처리 시간이 길면 길수록 라이디히 세포 수는 증가하였지만 (Data not shown) 테스토스테론 합성능력은 떨어졌다. Collagenase 처리 시간을 30분으로 하는 것보다는 20분, 20분보다는 5분 할 때 테스토스테론 합성능력이 좋았다. 그러나 5분 처리의 경우라 이디히 세포 수확율이 너무 낮아 다음 실험을 진행하기가 어려웠다.
따라서 LH의 농도에 따른 라이디히 세포의 테스토스테론 합성능력을 관찰하였다. LH는 0.5IU 이상부터 유의적으로 라이디히 세포의 테스토스테론 합성을 증가시켰으며 1IU에서 가장 높은 합성능력을 보이다가 그 이상부터는 점점 감소하는 경향을 보였다. 이것은 Bilinska 등이 Percoll을 사용하여 분리한 라이디히 세포에서 hCG 1IU가 테스토스테론 합성능력이 가장 높게 나타났다는 보고와 일치하였다 (Bilinska et al.
고환에서 여러 단계의 효소 처리 및 percoll 밀도구배 원심 분리를 거쳐 최종 BSA 다 구배 원심분리하여 얻은 라이디히 세포를 3兴HSD 염색을 실시한 결과 그림에서와같이 90% 이상의 라이디히 세포만을 얻었다 (Fig. 4).
라이디히 세포는 LH의 촉진에 의해 스테로이드 합성이 개시된다. 따라서 분리한 라이디히 세포의 최적의 테스토스테론 합성 조건을 확립하기 위해 LH를 농도별로 처리한 결과, 1IU에서 최고의 테스토스테론 합성을 보였으며, 그 이상에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 3).
케토코나졸은 분리한 라이디히 세포에서 1Km 이상부터 유의적인 테스토스테론 합성을 감소시켰다. 또한 테스토스테론 힙 성 능력 시험 (testosterone production assay)에서도 IO-8 M 이상부터 테스토스테론 합성능력이 감소하는 경향을 보였으며, 유의적인 감소는 IOTm에서 나타났다. 이것은 강태석 등이 고환조직을 이용하여 케토코나졸의 스테로이드 합성능력을 평가한 결과, 10-7M 이상부터 테스토스테론 합성이 유 의적으로 저해되었다는 보고와 일치하였다 (강태석 등, 1999).
1). 또한, 테스토스테론 합성능력을 평가한 결과에서도 20분, 30분 처리한 것은 5분 처리한 것에 비해 라이디히 세포의 테스토스테론 합성능력이 유의적으로 감소하였다 (Fig. 2).
5 mg/ml))에서 배양하였다. 시간에 따른 배양상태를 검토한 결과, 3시간이 후부터 monolayer 형태로 성장하였으며 시간이 지나갈수록 뻗는 정도와 세포 수가 증가하였다 (Fig. 5).
이상의 결과로부터 내분비계 장애물질 검색을 위한 라이디히 세포 분리 및 배양법을 확립하였으며, 이 방법은 내분비계 장애물질 검색에 유용한 방법임을 확인하였다.
이것은 테스토스테론 합성능력 시험에 서도 비슷한 결과를 보였다. 케토코나졸로 처리한 라이디히 세포를 배양한 후 다시 수확하여 테스토스테론 합성능력 시험을 한 결과, 10-8M에서부터 감소하였지만 유의성은 10® M에서만 나타났다 (Fig. 7).
성숙한 90일령 랫드의 고환에서 분리한 라이디히 세포를 이용하여 내분비계 장애물 질의 스테로이드 호르몬 합성 능력을 저해하는 정도를 평가할 수 있는지를 알아보고자 스테로이드 합성을 저해하는 것으로 알려져 있는 케토코나졸을 양성 대 조 물질로 사용하여 평가하였다. 케토코나졸을 라이디 히 세포에 처리하여 배양한 후 배양액에서 테스토스테론양 을 측정한 결과, 10-8M 이상부터 용량 의존적으로 유의하게 감소되었다 (Fig. 6). 이것은 테스토스테론 합성능력 시험에 서도 비슷한 결과를 보였다.
참고문헌 (12)
Kavlock, R.J., Daston, G.P., DeRosa, D., Fenner-Crisp, P., Gray, L.E., Kaattari, S., Lucier, G. and Luster, M. (1996). Research need for the risk assessment of health and envi-ronmental effects of endocrine disruptors : a report of the U.S. EPA-sponsered workshop. Environ. Health Perspect. 104[Suppl. 4] : 715- 740
EDSTAC Final Report. (1998). Endocrine Disrupter Screening and Testing Advisory Committee Final Report. U.S. Environmental Protection Agency. Internet access at URL : http: // www.epa.gov/oscpmont/history/finalrpt. htm
Klinefelter, G.R., Kelce, W.R. and Hardy, M.P. (1993). Isolation and culture of Leydig cells from adult rats, Methods Toxicol. 3A, 166-181
강태석, 장인석, 황진희, 채갑용, 김용규, 신동환, 황대연, 김철규, 이도영, 윤영원, 조정식 (1999). 내분비계장애물질 검색 및 시 험법 확립 Ⅵ. 내분비계장애물질 연구보고서 1(1), 245-262
Klinefelter, G.R., Hall, P.F. and Ewing, L.L. (1987). Effect of luteinizing hormone deprivation in situ on steroidogenesis of rat Leydig cells purified by a multistep procedure. Biol Reprod., 36(3), 769-83
Bilinska, B., Genissel, C. and Carreau, S. (1997). Paracrine effect of seminiferous tubule factors on rat Leydig cell testosterone production: role of cytoskeleton. Biol Cell., 89(7), 435-42
Carreau, S., Papadopoulos, V. and Drosdowsky, M.A. (1988). Stimulation of adult rat Leydig cell aromatase activity by a Sertoli cell factor. Endocrinology., 122(3), 1103-9
Papadopoulos, V., Carreau, S. and Drosdowsky, M.A. (1986). Effects of seminiferous tubule secreted factor(s) on Leydig cell cyclic AMP production in mature rat. FEBS Lett., 202(1), 74-8
Boujrad, N, Hochereau-de Reviers, M.T. and Carreau, S. (1995). Evidence for germ cell control of Sertoli cell function in three models of germ cell depletion in adult rat. Biol Reprod., 53(6), 1345-52
Carreau, S., Papadopoulos, V. and Drosdowsky, M.A. (1988). Stimulation of adult rat Leydig cell aromatase activity by a Sertoli cell factor. Endocrinology., 122(3), 1103-9
Chang, C.L. and Fung, H.P. (2002). Effects of ketoconazole on progesterone and cAMP production in MA-10 mouse Leydig tumor cells. Biol Pharm Bull., 25(6), 794-7
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.