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문제 정의
- 본 연구에서는 독성 실험에 사용할 생물의 유효체장을 결정하기 위하여 실험생물의 체장 변화를 관찰하였다. 실험생물의 체장은 알에서 부화한 유생단계로부터 성체로 성장하기까지 일정 시간 마다 일부 개체를 채집하여 계측하였다.
- 본 연구에서는 생물학적 평가방법 즉, 해양으로 배출되는 모든 물질에 대한 해양생태 독성평가를 위한 실험생물로 서 해양에서 1차 소비자 또는 2차 생산자의 역할을 담당하는 동물플랑크톤 중 연안지역에서 흔히 채집할 수 있는 T. japonicus를 선정하여 해양생태독성평가 생물 및 현장시료에 대한 적용 가능성을 구명하고자 하였다. 국내에서 해양의 1차 소비자로서 현재 일부 사용하거나 개발 중인 해양생태 독성평가용 표준시험종은 해산 윤충류인 Brachionus plicatilisQung, et al.
- 염분 및 pH 내성 실험은 독성 실험을 수행하기 위한 유효농도 범위를 설정하기 위하여 수행하였다. 실험은 6 well culture plate(6 well cell culture cluster, Costar, USA)에 실험용액lOmL를 넣고 실시하였다.
- 이에 따라 본 연구에서는 저서 성 요각류인 T. japonicus 유생(nauplius)에 대한 해양생태독성 실험용 표준시험생물로서의 가능성을 구명하기 위하여 실험생물에 대한 염분 및 pH 내성 실험, 표준독성물질에 대한 민감도 및 현장시료에 대한 적용 가능성 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 요각류T. japonicuse 체장변화는 알에서 부화한 후 4시간이 경과한 개체를 이용하여 총 240시간 동안 관찰하였다. 요각류의 체장은 부화 후 72시간 이내에 100-200 |em 범위였으며, 유생단계 (N1 ~N6)로 구분되었고, 개체 간의 편차는 크지 않았다.
- 농도별 표준용액은 용출한 시료를 최고 농도(100%)로 설정한 후 이를 순차적으로 희석하여 대조구(0%)를 포함한 6개 농도(6.3,12.5, 25.0, 50.0, 100.0%)를 제조하였다. 실험은 48시간 동안 실시하였으며, 각각의 폐수 농도별 사망개체 수를 관찰하여 사망률로 환산한 후 48시간 LG。값으로 나타내었다.
- , Japan)을 여과해 수에 용해하여 제조하였다. 농도별 표준용액은 최고 농도의 표준용액을 제조한 후 이를 순차적으로 희석하여 대조구(0 ppm)와 5개 농도(0.6, 1.3, 2.5, 5.0, 10.0 ppm)를 제조하였다. 실험은 황산구리의 경우 5회, 카드뮴은 3회 실시하였으며, 각각 3개의 반복구를 두고 실험하였다.
- 표준독성물질 및 현장시료에 대한 독성평가와 관련된 실험환경 및 변수들은 Table 2에 수록하였다. 또한 모든 실험은 생물의 대사활동으로 인한 결과의 오류를 최소화시키기 위하여 먹이를 공급하지 않은 상태로 수행하였다.
- 이러한 이유 때문에 실험생물은 독성물질에 대한 민감도를 고려하여 성체보다 유생단계 생물을 선정하였다. 또한 배양시간에 따른 체장 변화 관계를 고려하여 해부 현미경 상에서 생존 및 사망한 개체를 쉽게 판단할 수 있는 체장 범위를 결정하였다.
- )를 대상으로 한 시험법을 참조하였다. 또한 실험은 성장실험을 통해 얻어진 결과를 근거로 하여 해당 크기의 T. japonicus 유생을 각 실험구마다 20개체씩 넣고 수행하였다.
- 0 psu 범위였으며, 광주기는 16시간(L):8시간(D)로 조절하였다. 먹이는 해산 녹조류suecia, 4.0~6.010%eU/mL)와 착편모조류(Isochrysis galbana, 7.0~9.0xl05cell/mL)> 2:1 비율로 혼합하여 1일 2회 30 mL씩 공급하였다 (Table 1).
- 배양해수의 염분은 26.0~29.0 psu 범위였으며, 광주기는 16시간(L):8시간(D)로 조절하였다. 먹이는 해산 녹조류suecia, 4.
- 01 mm까지 계측하였다. 본 연구에서 성체의 경우, 체장은 포란한 암컷 개체만을 동정하여 계측하였다. 실험기간 중 실험 환경 은 배양조건과 동일하였으며, 먹이 생물은 1회당 2 mL씩 공급하였다.
- 실험생물의 체장은 알에서 부화한 유생단계로부터 성체로 성장하기까지 일정 시간 마다 일부 개체를 채집하여 계측하였다. 부화용 알은 암컷 30개체를 피펫으로 분류하여 여과해 수 10 m L가 담긴 바닥이 투명하고 넓은 용기로 옮긴 후 10.0% 중성 포르말린 1 mL를 주입하여 성체와 알주머니를 분리한 후 1분 이내에 피펫으로 골라내었다. 알주머니는 분리 즉시 해수에 넣고 3회 이상 흔들어 주어 알주머니 표면의 포르말린 성분을 제거하였다.
- 생물의 체장은 일정 시간 마다 각각의 flask에서 5~7개체를 임의로 채집하여 해부 현미경(Olympus, SZX-ILLB200, Japan) 하에서 0.01 mm까지 계측하였다. 본 연구에서 성체의 경우, 체장은 포란한 암컷 개체만을 동정하여 계측하였다.
- 수소이온 농도(pH)에 대한 내성실험은 여과해 수에 0.1N HC1 과 0.1N NaOH를 넣어pH를 4.1~9.1의 범위로 설정하였으며, 각각 3개의 반복구를 만들어 3회 실험하였다. 실험기간 중 수온은 21.
- 본 연구에서 성체의 경우, 체장은 포란한 암컷 개체만을 동정하여 계측하였다. 실험기간 중 실험 환경 은 배양조건과 동일하였으며, 먹이 생물은 1회당 2 mL씩 공급하였다.
- 본 연구에서는 독성 실험에 사용할 생물의 유효체장을 결정하기 위하여 실험생물의 체장 변화를 관찰하였다. 실험생물의 체장은 알에서 부화한 유생단계로부터 성체로 성장하기까지 일정 시간 마다 일부 개체를 채집하여 계측하였다. 부화용 알은 암컷 30개체를 피펫으로 분류하여 여과해 수 10 m L가 담긴 바닥이 투명하고 넓은 용기로 옮긴 후 10.
- 0 ppm)를 제조하였다. 실험은 황산구리의 경우 5회, 카드뮴은 3회 실시하였으며, 각각 3개의 반복구를 두고 실험하였다. 측정값은 각각의 농도별 사망한 개체를 계수하여 사망률로 환산한 후 48시간 LCs。값으로 나타내었다.
- 염분 및 pH 내성 실험은 48시간 동안 실시하였으며, 측정값(end point)은 각각의 농도별로 사망한 개체를 계수한 후 48시간 생존율로 환산하였다.
- 염분조절을 위한 희석수는 역삼투 방식을 이용한 초순수(담수)를 이용하였다. 염분은 0~35.0psu 범위를 설정하였으며 , 최고 농도인 35.0 psu를 해수에 인공염(Sea salt, Tropic marine, Germany)을 추가하여 제조한 후 초순 수를 섞어 5.0 psu 간격으로 30.0, 25.0, 20.0, 15.0, 10.0, 5.0 psu로 조절하였다. Opsu는 희석수로 사용된 초순수를 사용하였다.
- 현장 시료에 대한 적용 가능성을 구명하기 위하여 3종류의 산업폐수오니(피혁, 염색 및 염료제조공장 오니) 추출물에 대한 농도-반응 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 동물플랑크톤을 이용한 모든 실험은 ASTM([1996])에 수록된 윤충류(Brachicmus sp.)를 대상으로 한 시험법을 참조하였다. 또한 실험은 성장실험을 통해 얻어진 결과를 근거로 하여 해당 크기의 T.
- 산업폐수 오니는 직접 독성 실험용 시료로 사용할 수 없기 때문에 실험에 사용한 용액은 오니와 여과해 수(26.2~28.0psu)의 비율을 1:10으로 혼합하여, shaker(Reipro shaker, JEIO TECH, Korea)로 12시간 동안 잘 흔든 후 용출된 폐수는 GF/C 필터(0.45 um, Whatman, USA)로 여과하여 실험에 사용하였다.
- 실험생물로 사용된 저서성요각류 Tigriopus japonicuse: 2004년 2월 강릉대학교 먹이생물연구실에서 분양받은 후 실험실로 옮겨 항 온실에서 단일종으로 배양하였다. 급작스런 수온 및 염분 변화에 따른 생리스트레스의 영향을 최소화시키기 위하여 배양수조의 수온은 21.
- 본 실험생물은 연구자마다 실험한 생물의 발달 단계가 다르기 때문에 우선적으로 시험생물의 발달 단계를 명확하게 규정해야 할 필요가 있다. 이러한 이유 때문에 실험생물은 독성물질에 대한 민감도를 고려하여 성체보다 유생단계 생물을 선정하였다. 또한 배양시간에 따른 체장 변화 관계를 고려하여 해부 현미경 상에서 생존 및 사망한 개체를 쉽게 판단할 수 있는 체장 범위를 결정하였다.
- 표준독성물질은 횡산구리 (C11SO4, minimum 99%, Sigma-Aldrich, USA)와 카드뮴(Cadmium standard solution, Junsei Chemical Co., Japan)을 여과해 수에 용해하여 제조하였다. 농도별 표준용액은 최고 농도의 표준용액을 제조한 후 이를 순차적으로 희석하여 대조구(0 ppm)와 5개 농도(0.
데이터처리
- 각각의 염분 및 pH에 따른 사망률의 유의성 검증을 위하여 SPSS 프로그램 (SPSS 10, SPSS Inc., USA)을 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 각각의 표준독성물질 및 현장시료에 대한 LG。, NOEC (no observed effective concentration) 및 LOEC(lowest observed effective concentration) 값은 USEPA[2002]에서 제시한 통계처 리 과정을 따라 Toxcal 5.0(Toxicalc 5.0, Tidepool Scientific Software, USA) 프로그램을 이용하여 Dunnett's test와 maximum likelihood probit analysis 과정을 거쳐 산출하였다.
이론/모형
- 실험은 6 well culture plate(6 well cell culture cluster, Costar, USA)에 실험용액lOmL를 넣고 실시하였다. 염분조절을 위한 희석수는 역삼투 방식을 이용한 초순수(담수)를 이용하였다. 염분은 0~35.
성능/효과
- 0% 이상 유지되었으며, l.Opsu까지 90.0% 이상 생존하여 타 실험구와 유의한 차이를 보이지 않았으나 1.0 psu 이하 농도에서는 생존율이 0%로 급격히 감소하였다. 이는 T.
- T. japonicus 유생은 5.0~35.0 psu의 염분 범위에서 90.0% 이상 생존하였으며, 생존율에는 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.05). 그러나 0 psu 염분에서는 모든 개체가 사망하였다.
- 또한 48시간 동안 독성 실험을 수행한 결과,T. japonicus 유생은 황산구리보다 카드뮴에 노출되었을 때 더 민감한 반응을 보이는 것으로 나타나 두 실험물질에 대한 민감도의 차이를 명확히 구분할 수 있었는데, 이러한 결과는 본 실험생물이 해양생태 독성평가 시 다양한 독성물질에 대한 민감도를 비교할 수 있는 종으로서의 가능성이 있음을 제시할 수 있다.
- 본 연구에서 요각류T. japonicus의 체장은 부화 후 72시간이 내에 100~200 μm 범위로써 유생단계인 것을 쉽게 확인할 수 있었으며, 미성숙 개체나 성체에 비해 개체 간의 체장 편차는 크지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 독성평가시 T.
- 결론적으로 저서 성 요각류T. japonicus 유생은 독성물질에 대한 영향을 평가함에 있어 유용한 생물이며, 차후 해양생태 독성평가를 위한 지침서가 확립된다면 소형 갑각류를 포함한 해양의 1차 소비자 단계에 대한 해양생태 독성평가 표준 시험 종으로서 충분한 가치가 있는 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 독성물질에 대한 민감도는 실험시간의 차이 때문에 타 실험 결과와의 명확한 비교는 할 수 없었다. 그러나 황산구리 및 카드뮴의 농도에 따른 T. japonicus 유생의 사망률은 뚜렷한 선형 관계를 보였다. 또한 48시간 동안 독성 실험을 수행한 결과,T.
- 유생단계를 거친 미성숙 개체의 경우, 체장 성장 속도는 빠르게 증가하였으며, 체장은 부화 후 96시간부터 240시간까지 200nm에서 760 |im까지 성장하였다. 또한 개체의 크기가 증가할수록 개체 간의 체장 편차는 큰 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 94 범위로 두 실험물질 모두 농도와 독성물질에 대한 반응 사이에선형관계가 뚜렷하였다. 또한 독성물질에 대한 민감도 차원에서 T. japonicus 유생은 카드뮴에 대한 민감도가 황산 구리보다 약 2배가량 높은 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 이와 같은 결과들을 종합해보면, 황산구리와 카드뮴에 대한 독성은 실험시간이나 실험종에 따라 다소 차이를 보이는 것으로 나타났다. 또한 독성물질에 대한 생물의 민감도 차이는 실험생물이 저서 성(benthic)인지 아니면 부유성(pelagic)인지 즉, 정착성 종인지 아니면 해류나 조류에 의해 이동이 자유로운 종인지에 따라 큰 차이가 나는 것을 알 수 있었는데, 이는 실험생물의 지리적 위치, 서식환경(현장 또는 실험실 배양) 및 실험시간의 차이에 기인한 결과로 판단된다. 따라서 각각의 실험 결과에 대한 상이성을 해결하기 위해서는 독성물질에 민감하게 반응하며 주변에서 쉽게 채집하고 배양할 수 있는 실험종의 선정 및 실험시간의 단일화 작업이 선행되어야 할 것으로 판단된다.
- japonicus 유생을 실험생물로 이용할 경우, 유생은 100~200 μm 사이의 망목을 이용하면 쉽게 분리할 수 있는 것으로 판단된다. 또한 본 연구 결과 T. japoincus는 부화 후 96시간이 되면 미성숙 개체로 성장하게 되는데, 이때 실험시간이 96시간을 넘게 되면 해당 생활사단계에서는 실험할 수 없게 된다. 이러한 이유 때문에 T.
- 6%로 나타났다(Table 3).본 실험 결과, 피혁과 염색오 니 추출액은 농도-사망률 사이에 상관계수가 각각 0.88-0.92, 0.96-0.99범위로 선형 관계가 뚜렷하여 오니의 독성 영향을 평가할 수 있었으나 염료폐수 오니의 경우에는 농도 증가에 따른 독성의 영향이 관찰되지 않았다 (Fig. 5).
- 본 연구에서 실험생물의 pH에 대한 최소 내성 한계는 5.2로 조사되었으며, 생존율 90.0%를 실험 성공조건으로 결정할 경우, 최적 생존 pH 범위는 6.3~8.2 구간인 것으로 나타났다. 해양생태 독 성평가를 수행함에 있어 pH는 생물의 생존율을 결정하는 중요한 환경요인이다.
- 그러나 대부분의 연구는 성체에 국한되어 있었으며, 유생을 이용한 연구는 드문 편이다. 본 연구에서 제시하였듯이 T. japonicus 유생은 pH 및 염분 내성 범위가 넓으며, 독성물질 및 현장 시료에 적용할 수 있는 장점이 있다.
- 본 연구자료를 probit analysis를 통해 분석한 결과, 싱 관계수(r)는 황산구리의 경우 0.92~0.98, 카드뮴은 0.85-0.94 범위로 두 실험물질 모두 농도와 독성물질에 대한 반응 사이에선형관계가 뚜렷하였다. 또한 독성물질에 대한 민감도 차원에서 T.
- 실험생물에 대한 pH 내 성 범위를 구명하기 위하여 48시간 동안 pH 4.1-9.1 범위까지 생존율을 관찰한 결과, T. japonicus 유생은 염분농도와 상관없이 pH 6.2~8.2 범위 내에서 90.0% 이상 생존하였으며, 농도 간의 유의한 차(1)는 없었다(p > 0.05). 그러나 유생의 생존율은 pH 5.
- 그러나 0 psu 염분에서는 모든 개체가 사망하였다. 염분에 대한 생존율의 하한치를 구명하기 위하여 0~5.0 psu 범위에서 1.0 psu 간격으로 농도를 낮추면서 실험생물에 노출시킨 결과, 1.0 psu 보다 높은 농도에서는 유생생존율이 90%를 넘었으며, 타 실험구와 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.05). 그러나 0 psu에서는 모두 사망하여 T.
- japonicuse 체장변화는 알에서 부화한 후 4시간이 경과한 개체를 이용하여 총 240시간 동안 관찰하였다. 요각류의 체장은 부화 후 72시간 이내에 100-200 |em 범위였으며, 유생단계 (N1 ~N6)로 구분되었고, 개체 간의 편차는 크지 않았다. 이 시기는 유생단계로서 단계의 생물인 것으로 분류되었다.
- japonicus의 체장은 부화 후 72시간이 내에 100~200 μm 범위로써 유생단계인 것을 쉽게 확인할 수 있었으며, 미성숙 개체나 성체에 비해 개체 간의 체장 편차는 크지 않았다. 이러한 결과로 볼 때, 독성평가시 T. japonicus 유생을 실험생물로 이용할 경우, 유생은 100~200 μm 사이의 망목을 이용하면 쉽게 분리할 수 있는 것으로 판단된다. 또한 본 연구 결과 T.
- japoincus는 부화 후 96시간이 되면 미성숙 개체로 성장하게 되는데, 이때 실험시간이 96시간을 넘게 되면 해당 생활사단계에서는 실험할 수 없게 된다. 이러한 이유 때문에 T. japonicus 유생을 이용한 독성평가는 생물의 성장시간을 고려하여 최대 48시간을 경과하지 않는 범위 내에서 수행하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
- 이와 같은 결과들을 종합해보면, 황산구리와 카드뮴에 대한 독성은 실험시간이나 실험종에 따라 다소 차이를 보이는 것으로 나타났다. 또한 독성물질에 대한 생물의 민감도 차이는 실험생물이 저서 성(benthic)인지 아니면 부유성(pelagic)인지 즉, 정착성 종인지 아니면 해류나 조류에 의해 이동이 자유로운 종인지에 따라 큰 차이가 나는 것을 알 수 있었는데, 이는 실험생물의 지리적 위치, 서식환경(현장 또는 실험실 배양) 및 실험시간의 차이에 기인한 결과로 판단된다.
- 표준독성물질에 대한 T. japonicus 유생의 민감도 실험 결과, T. japonicus 유생의 황산구리 및 카드뮴에 대한 독성 반응은 뚜렷하게 관찰되었으며, 각각의 반복 실험구 내의 분산은 10.0% 이내로 크지 않았다. 황산구리에 대한 유생의 48시간 LG。은 2.
- 피혁 및 염색 오니 추출액에 대한 LOEC와 NOEC 값은 피혁오니가 각각 12.5%, 25.0%이었으며, 염색 오니의 경우, 각각 6.3%와 10.4±3.6%로 나타났다(Table 3).본 실험 결과, 피혁과 염색오 니 추출액은 농도-사망률 사이에 상관계수가 각각 0.
- 실험은 48시간 동안 실시하였으며, 각각의 폐수 농도별 사망개체 수를 관찰하여 사망률로 환산한 후 48시간 LG。값으로 나타내었다. 해수에서 용출된 폐수 오니 추출액의 pH는 피혁, 염료 오니의 경우 7.8-8.1 범위였으나 염색폐수오니의 경우, pH는 6.9~7.9의 범위로 폐수 오니의 함량이 높을수록 낮았다(Table 2).
- 현장 시료에 대한 독성실험 결과, T. japonicus 유생의 경우, 피혁과 염색 오니 추출액은 농도-사망률 사이에선형관계가 뚜렷하여 독성의 영향을 평가할 수 있었으며, 현장 시료에 대한 독성평가용 생물로서의 가능성을 시사하였다. 피혁, 염색 및 염료 오니에서 용출되는 폐수는 보통 난 분해성 폐수로 분류한다.
후속연구
- 결론적으로 저서 성 요각류T. japonicus 유생은 독성물질에 대한 영향을 평가함에 있어 유용한 생물이며, 차후 해양생태 독성평가를 위한 지침서가 확립된다면 소형 갑각류를 포함한 해양의 1차 소비자 단계에 대한 해양생태 독성평가 표준 시험 종으로서 충분한 가치가 있는 것으로 판단된다.
- 이와 같이 분해자 이외의 타 분류군에 대한 독성평가가 미흡한 원인은 실험생물 및 시험방법이 표준화되어져 있지 않기 때문이며, 적용분야 또한 매우 제한적이기 때문이다. 그러므로 타 분류군에 대한 해양생태 독성시험법은 필연적으로 확립되어야 하며, 이를 위해서는 표준실험생물 선정을 위한 기초연구가 선행되어야 할 것으로 판단된다.
- 또한 독성물질에 대한 생물의 민감도 차이는 실험생물이 저서 성(benthic)인지 아니면 부유성(pelagic)인지 즉, 정착성 종인지 아니면 해류나 조류에 의해 이동이 자유로운 종인지에 따라 큰 차이가 나는 것을 알 수 있었는데, 이는 실험생물의 지리적 위치, 서식환경(현장 또는 실험실 배양) 및 실험시간의 차이에 기인한 결과로 판단된다. 따라서 각각의 실험 결과에 대한 상이성을 해결하기 위해서는 독성물질에 민감하게 반응하며 주변에서 쉽게 채집하고 배양할 수 있는 실험종의 선정 및 실험시간의 단일화 작업이 선행되어야 할 것으로 판단된다.
- 본 실험생물은 연구자마다 실험한 생물의 발달 단계가 다르기 때문에 우선적으로 시험생물의 발달 단계를 명확하게 규정해야 할 필요가 있다. 이러한 이유 때문에 실험생물은 독성물질에 대한 민감도를 고려하여 성체보다 유생단계 생물을 선정하였다.
- [2000]). 특히 본종은 해양에서 소형 갑각류를 대별할 수 있기 때문에 염분이나 pH에 대한 내성한 계, 표준독성물질에 대한 민감도 및 현장시료에 대한 적용 가능성이 입증된다면 해양생태 독성 평가용 실험생물로서 매우 유용할 것으로 판단된다. 또한 독성물질에 대한 민감도는 생물의 생활사(life cycle)에 따라 다르기 때문에 실험생물은 성숙한 개체를 사용하기보다 개체발생 학적으로 민감도가 가장 높은 것으로 알려진 초기 성장 단계의 생물을 이용하는 것이 독성물질에 대한 생물의 위해성을 평가하는 데 큰 도움(1)될 것으로 여겨진다RForget et al.
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