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문제 정의
- 본 연구는 난분해성 염색폐수의 생물학적 처리에 대한 연구가 주목을 받고 있는 상황에서 생물학적 처리 가 가능한 균주의 획득과 색도 제거를 목표로 염색폐수로부터 색도 제거 능이 우수한 백색부후 균을 분리하였다.
- 본 연구에서는 난분해성 염색폐수의 생물학적 처리에 대한 기초 연구로서 난분해성물질인 염료를 분해할 수 있는 생물학적 처리에 응용 가능한 미생물을 선별 및 분리하고자* 하였다.
제안 방법
- Gel 전개 및 염기서열 분석에는 ABI Prism 310 Genetic analyzer(PE Applied Biosystem)를 이용하였다. National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 이용하여 DNA 데이터베이스와 유사한 염기서열을 비교하여 각각을 동정하였다.
- PCR 산물은 Wizard PCR prep kit(Promega, Madison, WI, USA)로 정 제하고, BigDye terminator cycle sequencing kits(Applied Biosystems, Forster City, CA, U.S.A.)을 이용하여 sequencing 반응을 하였고, 반응에 는 PCR 반응에 사용한 동일한 primer를 사용하였다. Gel 전개 및 염기서열 분석에는 ABI Prism 310 Genetic analyzer(PE Applied Biosystem)를 이용하였다.
- PCR 증폭은 10 pmol의 각각의 primer, 250 M dNTP, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 40 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 2U의 Tag-DNA polymerase(Bioneer, Korea) 및 100 ng의 template DNA를 첨가하여 최종 volume을 50|H로 조정하였다. DNA 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 3분간 실시하고 denaturation 40i(94oC), annealing 40i(55oC), extension 1 분(72P) 으로 30 cycle을 실시한 뒤 final extension을 72℃에서 15분간 실시하였다.
- PDA 배지에서 전 배양한 분리 균주를 IX 1cm의 정 사각형으로 잘라 100 ppm 농도로 염료가 포함된 MGYM 고체 배지의 중앙에 놓고 배지 상에서의 탈색된 영역의 지름을 기준으로 측정하였다. 탈색된 영역의 중심을 직교하는 수직선과 수평선을 평판배지의 밑면에 유성 펜으로 그려 5일 경과되었을 때 종축 및 횡축의 직경을 측정한 후 두 값을 평균하여 탈색 영역의 직경으로 정하고 탈색영역의 면적을 구하여 전체 평판의 면적에 대한 퍼센트 비율로 나타내었다.
- 균체의 확보를 위해 PDA 배지에 멸균된 cellophane membrane을 깔고 균을 접종하여 25℃에서 3~4일간 배양하였다. 배양된 균을 1.5 m/ microtube에 모았고 여기에 100 B의 STES buffer(500 mM NaCl, 200mM Tris-HCl(pH 7.6), 10 mM EDTA, 1% SDS)와 glass beads를 첨가하여 TOMY micro tube mixer(TOMY, Seiko, Japan; 를 이용하여 20분간 mix 한 후 200诃의 TE buffer(pH 8.0)를 첨가했다. 이를 동량의 phenol/ chloroform/isoamyl ale아10I extraction(25:24:1) 용액으로 추출한 다음 RNase A(20 mg/mZ) 5 p/를 첨가하여 37℃에서 20분간 배양한 후 0.
- 염색폐수처리시설의 생물학적 처리 조를 거친 염색 폐수로부터 활성이 높은 미생물을 분리하기 위해 시료를 포기 배양하면서 7일 간격으로 시료를 100 nV씩 취하여 Reactive Blue 19와 Reactive Yellow 145를 각각 100 ppm 첨가하여 반 연속 배양을 실시하였다. 배양된 시료를 희석(103-105)하여 염료가 첨가된 MGYM (Modified Glucose Yeast Extract Medium; 2.0 g glucose, 1.0 g yeast extract, 0.14 g MgSO4 - 7H2O, 0.5g KH2PO4, l-0g K2HPO4, 0.4g NaCl, 2% agar) 고체 배지에 0.1 mZ를 도말한 후 30土性에서 10일간 배양하였다. 배지에서 색도가 제거된 부분의 콜로니를 취하여 순수분리를 위해 여러 차례의 교대 배양을 실시한 후 Potato Dextrose Agar(PDA) 사면배지에 배양하여 4℃에서 보관하면서 필요시 계대하여 사용하였다.
- 1 mZ를 도말한 후 30土性에서 10일간 배양하였다. 배지에서 색도가 제거된 부분의 콜로니를 취하여 순수분리를 위해 여러 차례의 교대 배양을 실시한 후 Potato Dextrose Agar(PDA) 사면배지에 배양하여 4℃에서 보관하면서 필요시 계대하여 사용하였다.
- 염료를 함유한 평판 배지에서의 균사체 성장 및 염료 색도 제거능력이 우수한 것으로 판별된 균주를 8가지 염료가 각각 포함된 MGYM 액체배지에 접종하여 30리에서 150rpm으로 5일 교반 배양하였다. 색도 분해 능력의 확인은 배양액 ImZ를 원심분리(4000 ipm, 10분)한 다음 상등액의 흡광도를 측정 (UVmini 1240)하여 확인하였다. 측정된 흡광도를 Standard curve와 비교하여 배지 내의 염료의 농도를 산정하였다.
- 염료를 함유한 평판 배지에서의 균사체 성장 및 염료 색도 제거능력이 우수한 것으로 판별된 균주를 8가지 염료가 각각 포함된 MGYM 액체배지에 접종하여 30리에서 150rpm으로 5일 교반 배양하였다. 색도 분해 능력의 확인은 배양액 ImZ를 원심분리(4000 ipm, 10분)한 다음 상등액의 흡광도를 측정 (UVmini 1240)하여 확인하였다.
- 염색폐수처리시설의 생물학적 처리 조를 거친 염색 폐수로부터 활성이 높은 미생물을 분리하기 위해 시료를 포기 배양하면서 7일 간격으로 시료를 100 nV씩 취하여 Reactive Blue 19와 Reactive Yellow 145를 각각 100 ppm 첨가하여 반 연속 배양을 실시하였다. 배양된 시료를 희석(103-105)하여 염료가 첨가된 MGYM (Modified Glucose Yeast Extract Medium; 2.
- 0)를 첨가했다. 이를 동량의 phenol/ chloroform/isoamyl ale아10I extraction(25:24:1) 용액으로 추출한 다음 RNase A(20 mg/mZ) 5 p/를 첨가하여 37℃에서 20분간 배양한 후 0.1 volume의 3M sodium acetate과 2 volume의 cold 95% ethanol로 DNA의 침전을 유도하였다. 이를 70% 에탄올로 세척 후, 진공 건조한 다음 50叫의 증류수에 녹였다.
- 색도 분해 능력의 확인은 배양액 ImZ를 원심분리(4000 ipm, 10분)한 다음 상등액의 흡광도를 측정 (UVmini 1240)하여 확인하였다. 측정된 흡광도를 Standard curve와 비교하여 배지 내의 염료의 농도를 산정하였다. 또한 염료 내의 색도 제거력을 확인하기 위하여 다음 식을 적용하여 색도가 제거된 것을 퍼센트로 나타내었다.
- PDA 배지에서 전 배양한 분리 균주를 IX 1cm의 정 사각형으로 잘라 100 ppm 농도로 염료가 포함된 MGYM 고체 배지의 중앙에 놓고 배지 상에서의 탈색된 영역의 지름을 기준으로 측정하였다. 탈색된 영역의 중심을 직교하는 수직선과 수평선을 평판배지의 밑면에 유성 펜으로 그려 5일 경과되었을 때 종축 및 횡축의 직경을 측정한 후 두 값을 평균하여 탈색 영역의 직경으로 정하고 탈색영역의 면적을 구하여 전체 평판의 면적에 대한 퍼센트 비율로 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 사용한 primer는 ITS5(5'-GGAAGT AAAAGTCGTAACAAGG-3'), ITS4(5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')< 이용하여 ITS 영역을 증폭하였다.
- 본 연구에서 사용한 염료는 반응성 염료인 Reactive Orange 16(RO-16), Reactive Blue 19(RB-19), Reactive Blue 49(RB-49), Reactive Yellow 145(RB-145) 4종과 산성염료인 Acid Orange lO(AO-lO), Acid violet 43(AO-43), Acid Blue 350(AB-350) 3종, 분산성 염료인 Disperse 비ue 106(DB-106) 1종을 사용하였으며, 총 8가지 염료에 대하여 색도 제거 실험을 실시하였다. 본 실험에서 사용한 염료 총 8종에 대한 화학 구조식은 Fig.
- 색도 제거 활성이 있는 집락으로부터 형태적 특성과 색등에 따라 Bacteria 13주와 3종의 곰팡이를 1차로 선별한 후 색도 제거에 대한 고체 배지 상의 효과가 가장 뛰어난 1종의 백색부후 균을 선정하여 H说05-1로 명명하여 본 실험에 사용하였다. HU刖5-1의 PDA 배지에서의 집락 형성 특징과 현미경적 특성은 각각 Fig.
이론/모형
- )을 이용하여 sequencing 반응을 하였고, 반응에 는 PCR 반응에 사용한 동일한 primer를 사용하였다. Gel 전개 및 염기서열 분석에는 ABI Prism 310 Genetic analyzer(PE Applied Biosystem)를 이용하였다. National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 이용하여 DNA 데이터베이스와 유사한 염기서열을 비교하여 각각을 동정하였다.
성능/효과
- .염료의 색도 제거 능력 확인 결과 HUE05-1 균주가 전체 액체배지에서 90% 이상의 높은 색도 제거 효과를 나 타내었으며 (Fig. 7), 교반 과정에 의한 산소공급으로 색 도제 거가 잘 이루어진 것으로 생각된다.
- , RB49, RB19 염료는 4일 만에 100% 색도 제거 효과를 나타내어 분리된 백색부후 균 HU疋05-1의 색도 제거효율이 매우 우수하였다. AB35O와 RY145 염료에서도 각각 61%, 91% 색도 제거율을 보임으로서, 분리된 균 주를 이용하여 지속적인 실용화 개발을 한다면 산업폐수처리 분야에 기술적, 경제적 효용성을 높일 수 있는 가능성이 있는 결과를 얻었다.
- 고체 배지 상의 색도 제거 능력 측정 결과 실험에 사용된 대부분의 염료는 4일 안에 100% 색도 제거 효과가 나타났으며, 액체배지에서는 90% 이상의 높은 색도 제거 효과를 보였다.
- 분리된 HUE05-1 균주의 ITS sequencing의 염기 서열을 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK 와 RDP(RNA database project) 에서 확인한 결과 HUE05-1 균주는 87.7%만 유사하게 나타난 기존의 Bjerkandera adusta외는 다른 새로운 색도 제거능력이 있는 균주일 가능성이 큰 것으로 조사되었다.
- 4와 같다. 이를 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK와 RDP(RNA database project) 에서 확인한 결과 색도 제거 능력이 큰 HUE05-1 균주는 기존의 알려지지 않은 새로운 균주로서 Bjerkandera o血와 87.7% 정도 유사하지만(Fig. 5) 기존의 Bjerkandera adwa외는 다른 새로운 종인 균주로 판별되었다
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