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문제 정의
- , 2005)에 자생하는 야생버섯들로부터 fibrin 분해 활성을 검색하고 발표한 바 있다. 그중에서 식용 가능하고 혈전 용해 활성이 큰 민자 주 방망이 버섯을 확인하고 이 버섯으로부터 혈전 용해 효소를 분리 정제한 후생 화학적 특성을 연구하고자 한다. 민자 주 방망이 버섯은 우리나라를 포함한 북반구 일대와 호주 등에 분포하며 늦가을부터 초겨울에 걸쳐 정원, 잡목림, 혼합림, 내 땅 위에 단생 또는 군 생하는 낙엽분해성과 외생 균근성버섯으로 균륜을 형성한다.
제안 방법
- 3단계를 거처 민자 주 방망이 버섯으로부터 혈전 용해 효소를 분리 정제하였다 1(Table 1). 활성을 갖는 대부분의 효소는 DEAE-cellulose 관에 붙지 않고 흘러나왔다.
- 표준대조 구로는 plasmin을 사용하였다. Plasmin을 연속적으로 희석하여 얻은 표준 곡선에 따라 활성을 계산하였다. Fibrin plate는 plasminogen0] 제거된 fibrinogen과 plasminogen0] 포함된 fibrinogen^- 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다.
- 단백질의 분자량은 전기영동과 MALDI-TOF/MS (Voyager DE STR, Perseptive Biosystems)을 이용하여 결정하였으며, gel은 coomassie blue R-250과 silver staining kit (Pharmacia 사 Littlee Chalfont Buckinghamshire; England)로 염색하였다. MALDI-TOF/MS에 의한 분자량 측정은 기초과학지원연구소(서울)에서 수행하였다.
- 분리한 효소(1.3 ug/ml)와 섬유 소원 (2 mg/ml)를 36°C에서 반응시키면서 일정한 시간 간격을 두고 반응액 일부를 취하여 전기영동을 행하여 섬유 소원의 분해 과정을 분석하였다.
- 분리한 효소에 각각 0.5, 1, 2, 3%의 NaCl을 첨가 후 fibrin plate에 점적하고 36°C incubator에서 8시간 동안 방치한 후 용해된 면적을 측정하여 활성을 비교하였다.
- 정제한 효소의 활성에 효소 저해제의 영향을 알아보기 위하여 2 mM의 EDTA, 1, 10-phenanthroline 과 단백질 분해효소 저해제인 PMSF, E-64과 0.4 mM의 Pepstain A을 같은 부피의 혈전 용해 효소 용액과 섞은 후 fibrin plate에 점적하고 36°C incubator에서 8시간 동안 방치한 후 용해된 면적을 측정하여 활성을 비교하였다.
- 0 M ammonium suifhte의 농도 기울기로 흘려준다. 활성 분획 을 다시 모아 20 mM sodium phosphate 완중액(pH6.0)에 투석시킨 후 동일한 완충용액으로 미리 평형 시킨 fast protein liquid chromatography (FPLC)의 Mono S column (5.0X100 mm)에 주입하였다. 완충용액 3 ml로 씻어준 후 0.
- 효소 용액을 20 ul씩 fibrin plate 위에 점적한 후 36°C에서 8시간 동안 방치하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해 면적을 측정하여 상대적인 활성을 즉정하였다. 표준대조 구로는 plasmin을 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 민자 주 방망이 버섯은 2004년 9월 오대산에서 채집한 버섯자실체를 분류동 정 후 시료로 사용하였다. 시약으로 사용한 fibrinogen, plasmin (P 4895, 3 units), plasminogen, thrombin, bovine serum albumin, agarose, glycine, Sephadex G-150 와, protease inhibits는 Sigma (St.
- 본 실험에 사용한 민자 주 방망이 버섯은 2004년 9월 오대산에서 채집한 버섯자실체를 분류동 정 후 시료로 사용하였다. 시약으로 사용한 fibrinogen, plasmin (P 4895, 3 units), plasminogen, thrombin, bovine serum albumin, agarose, glycine, Sephadex G-150 와, protease inhibits는 Sigma (St. Louis, Missouri 63178; USA) 제품을, DEAE-cellulose^- Whatman (Maidstone; England) 제품을, LMW Electrophoresis calibration Kit는 Pharmacia (Little Chalfont Buckinghamshire; England) 제품을 사용하였다.
- 정제된 효소의 기질에 대한 선택성을 조사하기 위해 합성된 p-nitroaniline를 포함하는 펩티드 기질들을 사용하였다. 3 mM 기질 용액 50(11에 0.
- 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해 면적을 측정하여 상대적인 활성을 즉정하였다. 표준대조 구로는 plasmin을 사용하였다. Plasmin을 연속적으로 희석하여 얻은 표준 곡선에 따라 활성을 계산하였다.
이론/모형
- Haverkata-Trass의 fibrin plate 법 (Haverkate and Traas, 1974)에 따라 2% gelatin 용액에 녹인 0.7% (w/v) fibrinogen 용액 10 ml 와 0.05 M barbital 완충용액 (pH 7, 5)에 녹인 thrombin (100 NIH units) 50 ul을 잘 섞은 후 이를 petri dish에 부어 fibrin 막을 만들었다. 효소 용액을 20 ul씩 fibrin plate 위에 점적한 후 36°C에서 8시간 동안 방치하였다.
- 단백질의 분자량은 전기영동과 MALDI-TOF/MS (Voyager DE STR, Perseptive Biosystems)을 이용하여 결정하였으며, gel은 coomassie blue R-250과 silver staining kit (Pharmacia 사 Littlee Chalfont Buckinghamshire; England)로 염색하였다. MALDI-TOF/MS에 의한 분자량 측정은 기초과학지원연구소(서울)에서 수행하였다.
- 분리된 효소의 아미노산 서열은 기초과학지원연구소(서울)의 precise protein sequencing system (Applied Biosystems Model Procise-491)을 사용하여 결정하였다.
- 효소의 단백질은 Lowry 등 (Lowry et al., 1951)의 방법에 의하여 bovine serum albumin을 사용한 표준 곡선에 의해 정량하였다.
성능/효과
- 30°C까지는 변화를 보이지 않다가 40°C에서 서서히 감소하기 시작하여 50°C에서 급격히 감소하다 70°C에서 거의 활성이 사라짐을 확인하였다 (Fig. 3).
- N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe pNA를 강하게 분해시켰고, Lys pNA는 중간 정도, D-Phe-Pip-Arg pNA와 Leu pNA는 약하게 분해시켰으며, 나머지는 기질들과 반응하지 않았다. 또한 fibrin과 fibrinogen을 분해함을 확인하였다 (Table 2).
- 5, 1, 2, 3%의 NaCl 첨가 효과에 대한 결과이다. 실험에 첨가한 모든 농도의 NaCl은 혈전 용해 활성을 저해시키는 것으로 나타났는데, 0.5%와 1%의 염을 가했을 때는 첨가하지 않았을 때의 약 91%의 활성을 나타냈고, 2%와 3%를 첨가 시에는 85%의 활성으로 같았다.
- 섬유 소원의 Aa chain과 y chain은 짧은 시간 안에 거의 분해하지만 BP chain은 분해하지 않는 선택성을 갖고 있었다. 위 실험 결과로부터 이 효소는 기존에 사용되고 있는 혈전용해제인 플라즈미노겐 활성화제들과는 다르게 혈전의 주성분인 섬유소와 섬유 소원을 직접 분해하는 fibrinolytic enzyme으로 기질에 대한 선택성이 큰 새로운 혈전 용해 효소인 것을 알 수 있었다. 일반적으로 혈전성 성인병은 병징이 나타나기 시작한 후에는 치료가 매우 어려운 한계가 있어 혈전을 감소시키는 식품이나 약품을 상시 섭취하여 혈전에 의한 성인병을 미리 예방하는 것이 최선의 방법이다.
- 활성을 갖는 대부분의 효소는 DEAE-cellulose 관에 붙지 않고 흘러나왔다. 이 활성 부분을 모아 Phenyl Sepharose 관을 이용하여 분리한 결과 ammonium sulfiite의 낮은 농도에서 활성 부분이 나타났다. 이를 다시 FPLC의 Mono S column을 이용하여 분리한 활성 분획은 SDS- PAGE 위에서 분자량 34 kDa의 단일band로 나타났다(Fig.
- 1 kDa)으로부터 분리한 혈전 용해 효소에 비하여 큼을 알 수 있었다. 이 효소의 15번째까지 N- terminal amino acid 서열분석 결과는 Tyr-Pro-Ser-Pro-Ser- His-Gln-Thr-Ala-Val-Asn-Ala-Ile-Ile-X으로 지금까지 알려져 있지 않은 새로운 효소였으며 여러 종류의 합성 기질을 이용하여 기질특이성을 실험한 결과 반응 시 반응 자리에 선택성이 큼을 알 수 있었다. 또한 이 효소는 serine protease로 추정되며, 지금까지 발표된 잎새버섯과 느타리버섯 (Nonaka et al.
- 정제한 효소와 섬유 소원 (fibrinogen)의 반응 시 시간별로 취한 반응액을 SDS-PAGE로 분석한 결과 Aa chain과 ychain은 10분 후에 거의 분해되지만 Bp chain은 60분 후에도 분해하지 않았다 (Fig. 5).
후속연구
- 버섯을 이용한 식품은 장기간 복용하여도 부작용이 거의 없고 (Ahn, 1992), 유효성분이 미량이라도 식품으로 자주 이용 시 큰 영향을 줄 수 있을 뿐 아니라 버섯의 균사체로부터 원하는 물질을 대량 생산할 수 있는 장점이 있다. 따라서 많은 생리활성물질과 더불어 선택성이 좋은 혈전 용해 물질을 함유한 버섯은 새로운 혈전용해제 개발의 재료뿐 아니라 기능성 식품을 개발하는 데도 좋은 재료로 사용할 수 있을 것이다. 따라서 본 실험실에서는 좀 더 혈전 용해 활성이 좋고 혈전에 대항 선택성이 좋은 버섯 종을 찾기 위해 치악산 (Kim et al.
- 일반적으로 혈전성 성인병은 병징이 나타나기 시작한 후에는 치료가 매우 어려운 한계가 있어 혈전을 감소시키는 식품이나 약품을 상시 섭취하여 혈전에 의한 성인병을 미리 예방하는 것이 최선의 방법이다. 따라서 생성된 혈전을 제거할 수 있는 혈전 용해 물질을 함유하고 있는 재료를 식품으로 사용하여 항상 사용할 수 있다면 혈전증 치료에 큰 효과를 얻을 수 있을 것이다.
- 이와 같이 혈전 용해 활성은 크면서 독성도 없고, 대량 재배 시 다른 나무에 피해를 주지 않는 식용 가능한 민자주방망이버섯 이 식품으로 이용되어 자주 섭취할 수 있다면 혈전에 의한 혈관계 질환의 예방과 치료에 큰 효과를 볼 수 있을 것이다. 따라서 이 버섯은 새로운 혈전용해제 개발의 후보물질로 사용할 수 있을 것이며, 또한 기능성 식품 개발의 재료 물질로도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 오래전부터 식용과 약용으로 이용되고 있는 버섯은 항암효과 (Kim et al., 1983), 항균효과 (Park et al, 1995), 항산화 효 과(Stavino, 1997)를 나타내는 물질뿐 아니라 뇌졸중, 뇌혈전증, 심장병과 같은 혈관계 질환에 대한 치료와 예방 효과를 나타내는 물질도 포함하고 있는 것으로 알려져 있으며 (Kubo et al., 1983; Kabir and Kimura, 1989), 근래에는 혈전 용해 효소도 함유하고 있는 것으로 알려져 새로운 혈전용해제 개발을 위한 유용한 소재로 이용될 수 있을 것으로 예상되며, 또한 이와 같은 유용물질의 함유로 기능성 식품 개발의 재료로도 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 항종양 작용도 높은 것으로 알려진 민자 주 방망이 버섯으로부터 분리한 혈전 용해 효소의 비활성은 22.
- 즉, 할미송이 버섯으로부터 분리한 혈전 용해 효소의 활성은 매우 크지만 할미송이 버섯은 약간의 독성을 갖고 있으며, 뽕나무버섯의 경우는 식용 가능하지만 야생에서 대량 재배 시 버섯 균사가 사물기생과 더불어 활물기생도 하므로 다른 나무의 성장에 피해를 줄 수 있다. 이와 같이 혈전 용해 활성은 크면서 독성도 없고, 대량 재배 시 다른 나무에 피해를 주지 않는 식용 가능한 민자주방망이버섯 이 식품으로 이용되어 자주 섭취할 수 있다면 혈전에 의한 혈관계 질환의 예방과 치료에 큰 효과를 볼 수 있을 것이다. 따라서 이 버섯은 새로운 혈전용해제 개발의 후보물질로 사용할 수 있을 것이며, 또한 기능성 식품 개발의 재료 물질로도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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