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문제 정의
- SEM 관찰을 통해 세포 부착도 및 세포수의 양상을 살펴본 결과도 역시 앞서의 결과와 연관이 있는 비슷한 경향을 보임을 확인할 수 있었다. SEM 관찰은 FBS를 포함한 배양액과 무혈청 배양액을 각각 공급해준 다음 슈반세포가 FBS의 유무와 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따라 부착 및 성장에 어떤 영향을 받는지 세포 부착 형태를 통해 살펴보고자 실시하였다. 먼저 FBS를 함유한 배양액을 공급한 경우 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따른 차이는 거의 나타나지 않았으며, 모든 군에서 부착된 세포는 filopodia 및 lamellipodia 등이 뻗어 나와 있는 형태를 보이며 세포의 부착, 성장, 이동 등이 잘 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 소수성 표면을 가져비교적 세포 부착도가 떨어지는 PLGA 고분자 표면에 세포부착 및 성장을 향상시키기 위해 세포 접착성 단백질인 피브로넥틴(FN), 피브리노겐(FG), 라미닌(LM), 비트로넥틴(VN)과 폴리펩타이드인 폴리-D-라이신(PDL) 및 폴리-L-라이신(PLL)을 흡착시켜 표면을 코팅하였다. 또한 그동안의 표면 개질 연구에 있어서는 주로 결합조직이나 상피조직 혹은 세포와 개질된 고분자의 표면과의 상호관계에 대한 연구가 대부분이었다면, 본 연구에서는 신경교세포인 슈반세포와 고분자의 표면과의 상호관계를 연구하였다. 이미 지난 연구에서 슈반세포를 이용하여 염소산 처리된 PLGA 필름의 표면과의 상호관계에 대한 연구가 진행된 바 있으나, 본 실험에서는 PLGA 필름에 접착인자를 코팅하여 슈반세포가 부착 및 성장하는데 가장 적합한 특성을 지닌 접착인자를 확인하고자 세포의 부착과 성장거동을 비교하였다.
- 또한 그동안의 표면 개질 연구에 있어서는 주로 결합조직이나 상피조직 혹은 세포와 개질된 고분자의 표면과의 상호관계에 대한 연구가 대부분이었다면, 본 연구에서는 신경교세포인 슈반세포와 고분자의 표면과의 상호관계를 연구하였다. 이미 지난 연구에서 슈반세포를 이용하여 염소산 처리된 PLGA 필름의 표면과의 상호관계에 대한 연구가 진행된 바 있으나, 본 실험에서는 PLGA 필름에 접착인자를 코팅하여 슈반세포가 부착 및 성장하는데 가장 적합한 특성을 지닌 접착인자를 확인하고자 세포의 부착과 성장거동을 비교하였다.
제안 방법
- 5 ×105 세포수/필름(필름의 면적; 약 25 cn?) 의 농도로 파종한 다음 FBS를 포함한 배양액과 무혈청 배양액을 공급해 주고 37 ℃의 세포배양기에서 배양하였다. 1, 2, 및 3일이 경과하면 배양액을 제거하고, 인산염완충식염수 (PBS, Gibco BRL.) 로 세척한 다음 세포를 트립신처리해서 계수하여 배양액 내의 FBS 첨가 유무에 따른 각 군별 세포수를 측정하여 비교하였다.
- PLGA 필름의 준비 및 단백질 혹은 폴리펩타이드 코팅. PLGA 1 g을 MC 20 mL에 용해시켜 5% PLGA 용액을 준비한 후 유리 재질의 페트리 접시에 6 mL씩 부어서 상온에서 건조시켜 용액 캐스팅하여 100+30 ㎛ 두께의 필름을 제조하였다. 제조된 필름은 70% 에탄올로 멸균한 다음 3차 증류수로 세처 건조하여 사용하였다.
- 이러한 결과는 초기 세포의 부착 및 퍼짐에 영향을 줄 것으로 사료되며, 이러한 차이가 나타나는 이유는 ESCA 분석 결과에 의해 설명된다. PLGA 필름에 흡착된 단백질이나 폴리펩타이드를 ESCA를 이용하여 분석하였다. 순수한 단백질과 폴리펩타이드 분말의 질소의 양을 ESCA로 분석한 결과 11~15%로 알려져 있다.
- 제조된 필름은 70% 에탄올로 멸균한 다음 3차 증류수로 세처 건조하여 사용하였다. 건조된 필름에 FN, FG, LM, VN, PDL, PLL용액으로 37 ℃에서 1시간씩 인큐베이션한 후 표면에 부착되지 않은 단백질 혹은 폴리펩타이드를 제거하기 위해 3차 증류수로 세척한 다음 건조하는 과정을 3회 반복 실시함으로써 PLGA 필름에 접착인자를 코팅하였다. 각 단백질과 폴리펩타이드의 농도는 Table 1과 같다.
- 각 시료의 표면에서 5회 이상 측정한 후 평균값을 취하여 물 접촉각으로 사용하였다. 또한 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 PLGA필름 과 대조군인 코팅하지 않은 PLGA 필름의 표면을 관찰하기 위해 SEM으로 관찰을 실시하였다. 또한 코팅된 PLGA 필름 표면의 화학구조 변화를 확인하기 위해 ESCA(ESCALAB MK II, V.
- 또한 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 PLGA필름 과 대조군인 코팅하지 않은 PLGA 필름의 표면을 관찰하기 위해 SEM으로 관찰을 실시하였다. 또한 코팅된 PLGA 필름 표면의 화학구조 변화를 확인하기 위해 ESCA(ESCALAB MK II, V. G. Scientific Co., UK)분석을 통해 질소 IS 피크 값으로 상대적으로 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드의 양을 확인하였다. 상대적인 단백질 혹은 펩타이드의 흡착량은 다음과 같은 식에 의해 계산하였다
- 이 방법은 필름 표면에 물방울을 떨어뜨려 물과 표면이 이루는 각을 측정하는 방법으로 일반적으로 접촉각이 클수록 소수성이 증가하고 접촉각이 작을수록 친수성이 증가한다. 물 접촉각 측정기(TantecTM, CAM-PLUS micro, USA) 를 이용하여 시료에 10 μL의 증류수 혹은 배양액을 떨어뜨리고 각각의 물방울이 재료의 표면과 이루는 접촉각을 측정하였다. 각 시료의 표면에서 5회 이상 측정한 후 평균값을 취하여 물 접촉각으로 사용하였다.
- 본 실험에서는 PLGA 필름에 접착인자를 코팅하여 슈반세포가 부착 및 성장하는데 가장 적합한 세포친화적 환경을 조성하여, 조직공학적 신경유도관으로 이용될 때 슈반세포의 부착, 성장 등이 용이하도록 하기 위해 접착인자를 코팅하여 슈반세포를 배양하여 실험하였다. 조직공학적 신경 유도관의 개발에 있어 재생세포원과의 상호관계가 중요한 요소 중 하나인데, 본 실험의 결과를 통해 신경유도관에 재생세포의 종류에 따라 적절한 접착인자를 처리함으로써 세포친화적 환경을 제공할 수 있음을 알 수 있었다 또한 in vitro 환경에서 세포의 성장은 초기 부착도뿐만 아니라, 성장인자 등의 세 포 영양인자의 공급이 매우 중요하게 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 27 이들은 세포의 부착과 신장, 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 연구되어져 왔는데, 28-35 이러한 접착성 당단백질류가 세포의 부착을 향상시키는 이유로는 세포막에 존재하는 세포의 부착에 기인하는 인자들 때문인데, 예로 폴리라이신의 경우에는 정전기적 인력이 그 인자로 작용하는데 이는 폴리라이신의 경우 양전하를 띠고 있으며 일반적으로 세포막은 음전하를 가지고 있어 세포의 점착을 향상시킨다고 보고된 바 있다. 본 연구에서는 소수성 표면을 가져비교적 세포 부착도가 떨어지는 PLGA 고분자 표면에 세포부착 및 성장을 향상시키기 위해 세포 접착성 단백질인 피브로넥틴(FN), 피브리노겐(FG), 라미닌(LM), 비트로넥틴(VN)과 폴리펩타이드인 폴리-D-라이신(PDL) 및 폴리-L-라이신(PLL)을 흡착시켜 표면을 코팅하였다. 또한 그동안의 표면 개질 연구에 있어서는 주로 결합조직이나 상피조직 혹은 세포와 개질된 고분자의 표면과의 상호관계에 대한 연구가 대부분이었다면, 본 연구에서는 신경교세포인 슈반세포와 고분자의 표면과의 상호관계를 연구하였다.
- , USA) 과 20 pg/mL 뇌하수 추출물(Gibco BRL, USA)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 배양하였다. 분리된 슈반세포는 특성 결정을 위해 S-100 단백질 및 GFAP로 면역화학적 염색을 실시하였다.
- ) 으로 하룻밤 동안 고정하고 알코올 구배용액을 이용하여 각 10분씩 탈수 과정을 진행하였다. 세포를 배양한 PLGA 필름을 잘라 양면테이프를 이용하여 시료 폴더에 고정시킨 후 아르곤 가스 하에서 2분 동안 플라스마스퍼터 (Emscope, Model SC500K, UK)를 이용하여 약 200 ㎛의 두께로 백금 코팅하였고 이를 주사 전자현미 경 (Hitachi Co., Model S-2250N, Japan)을 이용하여 PLGA 필름표면의 세포를 관찰하였다.
- 좌골신경으로부터 분리한 신경 다발의 기질로부터 섬유아세포를 제거하고 약 95%의 순수한 슈반세포를 배양할 수 있었다. 슈반세포는 S-100 단백질과 GFAP의 면역화학적 염색을 통해 확인하였다. 현미경을 통해 양성반응을 보이는 세포를 확인한 결과 S-100에서 약 95%, GFAP에서 약 93%의 세포가 양성반응을 보이고 있었다.
- 현미경을 통해 양성반응을 보이는 세포를 확인한 결과 S-100에서 약 95%, GFAP에서 약 93%의 세포가 양성반응을 보이고 있었다. 이렇게 순수 배양된 슈반세포를 사용하여 접착성 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 PLGA 표면과 슈반세포와의 상호작용을 관찰하였다.
- 5X105세포수/ 필름의 농도로 파종한 다음 FBS를 포함한 배양액과 무혈청 배양액을 공급하여 하루 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 수회 세척하여 이물질을 제거하였다. 이를 10% 포르말린(Sigma Chem Co.) 으로 하룻밤 동안 고정하고 알코올 구배용액을 이용하여 각 10분씩 탈수 과정을 진행하였다. 세포를 배양한 PLGA 필름을 잘라 양면테이프를 이용하여 시료 폴더에 고정시킨 후 아르곤 가스 하에서 2분 동안 플라스마스퍼터 (Emscope, Model SC500K, UK)를 이용하여 약 200 ㎛의 두께로 백금 코팅하였고 이를 주사 전자현미 경 (Hitachi Co.
- SEM 관찰. 접착성 단백질 및 폴리펩타이드로 코팅된 고분자 필름 표면에서 배양된 슈반세포의 부착 및 성장거동을 통해 여러 가지 흡착된 단백질과 폴리펩타이드에 따른 세포의 수와 형태를 관찰하였다. 코팅된 PLGA 필름의 표면에 슈반 세포를 2.
- 앞서 분리한 슈반 세포를 1~2회계대 배양하여, 세포를 대량 배양한 후 트립신-EDTA 처리하여 세포를 분리한 다음 사용하였다. 처리하지 않은 PLGA 필름을 대조군으로 하고 접착인자로 알려진 단백질 및 폴리펩타이드로 코팅된 PLGA 필름에 각각 슈반 세포를 2.5 ×105 세포수/필름(필름의 면적; 약 25 cn?) 의 농도로 파종한 다음 FBS를 포함한 배양액과 무혈청 배양액을 공급해 주고 37 ℃의 세포배양기에서 배양하였다. 1, 2, 및 3일이 경과하면 배양액을 제거하고, 인산염완충식염수 (PBS, Gibco BRL.
- PLGA 필름의 표면 분석. 코팅된 PLGA 필름과 코팅하지 않은 PLGA 필름 표면의 친수성을 확인하기 위해 물과 배양액 (FBS 포함) 에서의 접촉각을 측정하였다. 이 방법은 필름 표면에 물방울을 떨어뜨려 물과 표면이 이루는 각을 측정하는 방법으로 일반적으로 접촉각이 클수록 소수성이 증가하고 접촉각이 작을수록 친수성이 증가한다.
대상 데이터
- 시약 및 재료 필름의 재료인 PLGACResomer® RG 756, lactic acid:glycolic acid molar ratio = 75 : 25, 90000 g/mole)는 Boehringer Ingelheim사(Germany) 로부터 구입하였다. 접착인자로는 FN(Sigma Co.
- 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 표면에서의 슈반세포 배양 본 실험에서는 이전의 실험에서 사용한 Morrissey의 방법에 기초한 슈반세포 분리 방법을 사용하였다. 우선 F344 rat (Japan SLC INC., Japan)으로부터 분리한 좌골신경을 PBS로 세척한 다음 상피를 제거하고 혈관 및 여타의 조직을 제거한 다음, 잘게 자른다. 잘게 자른 신경조각을 well plate에 4~5조각 정도를 넣고 일주일마다 신경조각을 수거해 새로운 well plate로 옮겨줌으로써 섬유아세포를 1차 제거한다.
- 시약 및 재료 필름의 재료인 PLGACResomer® RG 756, lactic acid:glycolic acid molar ratio = 75 : 25, 90000 g/mole)는 Boehringer Ingelheim사(Germany) 로부터 구입하였다. 접착인자로는 FN(Sigma Co., USA), FG(Sigma Co.), LM(Sigma Co.), VN(Sigma Co.), PDL(Sigma Co.), 및 PLL(Sigma Co.)을 사용하였으며, 세포배양액으로는 Dulbecco's modified essential media (DMEM) 및 우태아혈청(FBS), 페니실린-스트렙 토마이신(PS) 를 Gibco BRL. (USA)사에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 분석. 각각의 실험군들의 평균값과 표준편차를 확인하였으며, 통계학적 분석은 Student's t-test를 수행하였다. 결과 값이 PC0.
이론/모형
- 슈반세포의 배양과 확인. Morrissey 방법을 이용해 섬유이 세포의 오염 없이 순수한 슈반세포를 확보할 수 있었다. 좌골신경으로부터 분리한 신경 다발의 기질로부터 섬유아세포를 제거하고 약 95%의 순수한 슈반세포를 배양할 수 있었다.
- 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 표면에서의 슈반세포 배양 본 실험에서는 이전의 실험에서 사용한 Morrissey의 방법에 기초한 슈반세포 분리 방법을 사용하였다. 우선 F344 rat (Japan SLC INC.
성능/효과
- 그러나 FN, FG, LM의 경우 대조군을 포함한 나머지 군에 비해 접촉각이 상대적으로 작게 나타났다. 또한 물방울 적하 후 10분이 지난 후 접촉각을 측정하여 물방울이 퍼지는 정도를 관찰하였는데, 이 역시 FN, FG, LM의 경우 대조군보다 접촉각이 5-15° 정도 작게 나오는 것으로 미루어보아(Figure 2) 물방울이 퍼지는 속도 역시 빠름을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 초기 세포의 부착 및 퍼짐에 영향을 줄 것으로 사료되며, 이러한 차이가 나타나는 이유는 ESCA 분석 결과에 의해 설명된다.
- 순수한 단백질과 폴리펩타이드 분말의 질소의 양을 ESCA로 분석한 결과 11~15%로 알려져 있다.24본 실험의 ESCA의 결과에서 코팅하지 않은 PLGA 필름에서는 질소를 포함하지 않는 것을 기준으로 하여, 접착인자로 코팅된 표면의 질소 함량을 순수한 접착인자의 질소 함량으로 나누어 상대적인 흡착량을 계산한 결과 FN, FG, LM의 경우 최소 80% 이상으로 흡착되었음을 확인할 수 있었으며, PDL과 PLL은 20% 이하로 흡착률이 낮았는데, 여러 논문에서도 이와 같은 결과를 나타내고 있었다(Table 2 and Figure 3) 24,27 VN의 경우에는 순수한 분말의 양이 다른 접착인자에 비해 현저히 작아 측정이 되지 않았기에 상대적인 흡착량을 계산할 수 없었다. 또한 SEM으로 관찰한 결과 코팅하지 않은 PLGA 필름은 매끄러운 표면을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었는데, 코팅한 표면 역시 매끄러운 표면을 가지고 있어 차이를 관찰할 수 없었다(Figure 4).
- 순수한 단백질과 폴리펩타이드 분말의 질소의 양을 ESCA로 분석한 결과 11~15%로 알려져 있다.24본 실험의 ESCA의 결과에서 코팅하지 않은 PLGA 필름에서는 질소를 포함하지 않는 것을 기준으로 하여, 접착인자로 코팅된 표면의 질소 함량을 순수한 접착인자의 질소 함량으로 나누어 상대적인 흡착량을 계산한 결과 FN, FG, LM의 경우 최소 80% 이상으로 흡착되었음을 확인할 수 있었으며, PDL과 PLL은 20% 이하로 흡착률이 낮았는데, 여러 논문에서도 이와 같은 결과를 나타내고 있었다(Table 2 and Figure 3) 24,27 VN의 경우에는 순수한 분말의 양이 다른 접착인자에 비해 현저히 작아 측정이 되지 않았기에 상대적인 흡착량을 계산할 수 없었다. 또한 SEM으로 관찰한 결과 코팅하지 않은 PLGA 필름은 매끄러운 표면을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었는데, 코팅한 표면 역시 매끄러운 표면을 가지고 있어 차이를 관찰할 수 없었다(Figure 4).
- 또한 신경돌기는 FG와 LM, VN의 경우 많이 관찰되었다. 각각의 실험군에 따라 세포가 분포하는 모습에도 차이가 있었는데 FN과 FG의 경우 균일하게 세포가 분포하고 있는 반면에, 나머지의 경우에는 성긴 콜로니를 이루며 세포가 분포함을 관찰할 수 있었다(Figure 8).
- 각각의 실험군들의 평균값과 표준편차를 확인하였으며, 통계학적 분석은 Student's t-test를 수행하였다. 결과 값이 PC0.05일 때 충분한 유의성을 갖는 것을 기준으로 하였다.
- 24본 실험의 ESCA의 결과에서 코팅하지 않은 PLGA 필름에서는 질소를 포함하지 않는 것을 기준으로 하여, 접착인자로 코팅된 표면의 질소 함량을 순수한 접착인자의 질소 함량으로 나누어 상대적인 흡착량을 계산한 결과 FN, FG, LM의 경우 최소 80% 이상으로 흡착되었음을 확인할 수 있었으며, PDL과 PLL은 20% 이하로 흡착률이 낮았는데, 여러 논문에서도 이와 같은 결과를 나타내고 있었다(Table 2 and Figure 3) 24,27 VN의 경우에는 순수한 분말의 양이 다른 접착인자에 비해 현저히 작아 측정이 되지 않았기에 상대적인 흡착량을 계산할 수 없었다. 또한 SEM으로 관찰한 결과 코팅하지 않은 PLGA 필름은 매끄러운 표면을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었는데, 코팅한 표면 역시 매끄러운 표면을 가지고 있어 차이를 관찰할 수 없었다(Figure 4).
- 먼저 FBS를 함유한 배양액을 공급한 경우 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따른 차이는 거의 나타나지 않았으며, 모든 군에서 부착된 세포는 filopodia 및 lamellipodia 등이 뻗어 나와 있는 형태를 보이며 세포의 부착, 성장, 이동 등이 잘 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 슈반세포의 신경돌기로 추측되는 돌기들이 세포로부터 잘 뻗어 있는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, FBS를 함유한 배양액을 공급한 경우 무혈청 배양액을 공급한 경우에 비해 부착된 세포수가 많음을 확인할 수 있었다 (Figure 7).
- 우선, 초기 세포 부착은 PLGA 표면의 단백질 흡착과 관련 있음을 확인할 수 있었으며, 세포의 성장은 배양액의 FBS의 함량의 영향을 받는 것으로 나타났다. 또한 슈반세포의 신경돌기의 성장은 흡착된 세포 접착인자의 종류에 따라 차이를 보이고 있었으나, 배양액에 FBS가 포함된 경우 비슷한 정도의 신경돌기 성장을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 슈반세포의 부착과 성장이 특정한 세포 접착인자에 의해 영향을 받음을 알 수 있었으며, 결과적으로 세포의 부착과 성장을 향상시키기 위해서는 세포의 종류나 배양환경 등을 고려하여 적절한 표면 환경을 제공해야 할 것이다.
- SEM 관찰은 FBS를 포함한 배양액과 무혈청 배양액을 각각 공급해준 다음 슈반세포가 FBS의 유무와 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따라 부착 및 성장에 어떤 영향을 받는지 세포 부착 형태를 통해 살펴보고자 실시하였다. 먼저 FBS를 함유한 배양액을 공급한 경우 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따른 차이는 거의 나타나지 않았으며, 모든 군에서 부착된 세포는 filopodia 및 lamellipodia 등이 뻗어 나와 있는 형태를 보이며 세포의 부착, 성장, 이동 등이 잘 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 슈반세포의 신경돌기로 추측되는 돌기들이 세포로부터 잘 뻗어 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 뿐만 아니라, FBS를 함유한 배양액을 공급한 경우 무혈청 배양액을 공급한 경우에 비해 부착된 세포수가 많음을 확인할 수 있었다 (Figure 7).반면에 무혈청 배양액의 경우 흡착된 단백질 혹은 폴리펩타이드에 따라 세포수와 부착 형태에 차이를 보이고 있었는데, 세포 부착과 증식은 FN, FG, VN의 경우가 우수하였으며, filopodia와 lamellipodia 등 역시 FN과 FG에서 가장 왕성하게 뻗어 있는 것으로 보아 세포가 활동적임을 확인할 수 있었다. 그러나 PLGA와 PDL, PLL의 경우에는 부착된 세포에서 filopodia나 lamellipodia# 뻗고 있는 형태를 관찰하기 어려웠다.
- 본 실험에서 FBS의 첨가 유무에 따라 세포 부착도가 차이가 남을 확인할 수 있었는데, 이를 바탕으로 2, 5, 10%의 FBS를 포함하는 배양액을 이용하여 동일한 실험을 실시한 결과 초기 세포 부착도는 FBS의 첨가로 인해 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다. 이는 FBS 내에 세포 접착인자인 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴 등의 흡착에 따른 것으로 해석할 수 있다.
- 본 실험에서 앞선 결과에서 알 수 있듯이, PLGA 필름에서 단백질이나 폴리펩타이드가 흡착된 표면에서의 세포의 부착과 성장이 서로 다른 양상을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 우선, 초기 세포 부착은 PLGA 표면의 단백질 흡착과 관련 있음을 확인할 수 있었으며, 세포의 성장은 배양액의 FBS의 함량의 영향을 받는 것으로 나타났다.
- 초기 부착도는 FG>FN>untreated= VN>LM=PDL=PLL의 순이었으며, 각 실험군 중에서 특히 FN과 FG의 경우 뚜렷한 차이를 보이고 있었다. 세포 성장률은 3일 후의 세포수를 기준으로 볼 때 대조군에 비해 FN, FG, LM, VN의 증가가 두드러짐을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 앞선 결과에서 알 수 있듯이, PLGA 필름에서 단백질이나 폴리펩타이드가 흡착된 표면에서의 세포의 부착과 성장이 서로 다른 양상을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 우선, 초기 세포 부착은 PLGA 표면의 단백질 흡착과 관련 있음을 확인할 수 있었으며, 세포의 성장은 배양액의 FBS의 함량의 영향을 받는 것으로 나타났다. 또한 슈반세포의 신경돌기의 성장은 흡착된 세포 접착인자의 종류에 따라 차이를 보이고 있었으나, 배양액에 FBS가 포함된 경우 비슷한 정도의 신경돌기 성장을 확인할 수 있었다.
- 조직공학적 신경 유도관의 개발에 있어 재생세포원과의 상호관계가 중요한 요소 중 하나인데, 본 실험의 결과를 통해 신경유도관에 재생세포의 종류에 따라 적절한 접착인자를 처리함으로써 세포친화적 환경을 제공할 수 있음을 알 수 있었다 또한 in vitro 환경에서 세포의 성장은 초기 부착도뿐만 아니라, 성장인자 등의 세 포 영양인자의 공급이 매우 중요하게 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 본 연구진의 선행 실험인 접착인자로 코팅된 표면과 골수 간엽줄기세포 및 혈관 내피세포와의 상호작용에 관한 연구의 결과와는 차이를 보이고 있었는데, 이러한 사실로부터 세포의 종류에 따라 선호하는 표면접착 기질이 다름을 확인할 수 있었다. 현재 본연구진은 접착인자가 코팅된 표면에 세포가 부착될 때의 세포의 분자생물학적 변화를 확인하기 위해 세포의 접착인자로 알려진 피브로넥틴, 트롬보스폰딘 등을 RT-PCR을 통해 확인하는 실험을 진행 중이며, 또한 본 실험의 결과를 신경유도관에 적용시켜 이를 이용한 동물실험이 진행 중에 있다.
- 이러한 결과로 미루어 보아 특정한 접착인자는 초기 세포 부착도에 큰 영향을 끼치지만, 세포의 증식에 있어서는 접착인자보다는 배양액 내의 영양인자인 FBS의 함량이 더 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
- 26 다양한 방법을 이용하여 고분자 재료에 세포친화성을 부여하는 실험들이 진행되고 있다. 일련의 실험 결과를 통하여 고분자의 표면을 물리적 또는 화학적으로 처리하거나, 단백질을 흡착시켜 표면처리되지 않은 고분자 표면에 비해 세포 부착도가 우수해진다고 알려져 있으며, 코로나 방전 등의 방법에 비해 단백질이 흡착된 표면에서의 부착도가 더 우수하게 관찰된다는 사례가 있었다.
- 이는 PLGA 필름의 표면에 흡착된 접착인자의 양과 관련이 있는 것으로 사료된다. 전체 세포수나 증식도의 경우에는 최고 세포수가 1.5X1C)5세포수/필름 정도로 최고 세포수 가 6.5 X105 세포수/필름인 FBS를 포함하는 배양액에 비해 매우 저조함을 확인할 수 있었다. 초기 부착도는 FG>FN>untreated= VN>LM=PDL=PLL의 순이었으며, 각 실험군 중에서 특히 FN과 FG의 경우 뚜렷한 차이를 보이고 있었다.
- 본 실험에서는 PLGA 필름에 접착인자를 코팅하여 슈반세포가 부착 및 성장하는데 가장 적합한 세포친화적 환경을 조성하여, 조직공학적 신경유도관으로 이용될 때 슈반세포의 부착, 성장 등이 용이하도록 하기 위해 접착인자를 코팅하여 슈반세포를 배양하여 실험하였다. 조직공학적 신경 유도관의 개발에 있어 재생세포원과의 상호관계가 중요한 요소 중 하나인데, 본 실험의 결과를 통해 신경유도관에 재생세포의 종류에 따라 적절한 접착인자를 처리함으로써 세포친화적 환경을 제공할 수 있음을 알 수 있었다 또한 in vitro 환경에서 세포의 성장은 초기 부착도뿐만 아니라, 성장인자 등의 세 포 영양인자의 공급이 매우 중요하게 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 본 연구진의 선행 실험인 접착인자로 코팅된 표면과 골수 간엽줄기세포 및 혈관 내피세포와의 상호작용에 관한 연구의 결과와는 차이를 보이고 있었는데, 이러한 사실로부터 세포의 종류에 따라 선호하는 표면접착 기질이 다름을 확인할 수 있었다.
- 슈반세포는 S-100 단백질과 GFAP의 면역화학적 염색을 통해 확인하였다. 현미경을 통해 양성반응을 보이는 세포를 확인한 결과 S-100에서 약 95%, GFAP에서 약 93%의 세포가 양성반응을 보이고 있었다. 이렇게 순수 배양된 슈반세포를 사용하여 접착성 단백질 혹은 폴리펩타이드로 코팅된 PLGA 표면과 슈반세포와의 상호작용을 관찰하였다.
후속연구
- 또한 슈반세포의 신경돌기의 성장은 흡착된 세포 접착인자의 종류에 따라 차이를 보이고 있었으나, 배양액에 FBS가 포함된 경우 비슷한 정도의 신경돌기 성장을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 슈반세포의 부착과 성장이 특정한 세포 접착인자에 의해 영향을 받음을 알 수 있었으며, 결과적으로 세포의 부착과 성장을 향상시키기 위해서는 세포의 종류나 배양환경 등을 고려하여 적절한 표면 환경을 제공해야 할 것이다.
- 이러한 결과들은 본 연구진의 선행 실험인 접착인자로 코팅된 표면과 골수 간엽줄기세포 및 혈관 내피세포와의 상호작용에 관한 연구의 결과와는 차이를 보이고 있었는데, 이러한 사실로부터 세포의 종류에 따라 선호하는 표면접착 기질이 다름을 확인할 수 있었다. 현재 본연구진은 접착인자가 코팅된 표면에 세포가 부착될 때의 세포의 분자생물학적 변화를 확인하기 위해 세포의 접착인자로 알려진 피브로넥틴, 트롬보스폰딘 등을 RT-PCR을 통해 확인하는 실험을 진행 중이며, 또한 본 실험의 결과를 신경유도관에 적용시켜 이를 이용한 동물실험이 진행 중에 있다.
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