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문제 정의
- 45). 그러나, 본 연구는 시 (hgr) 단위 보다는 실제 임상에서 일어날 수 있는 분 (minute) 단위의 짧은 시간에 따른치주인대 섬유세포의 활성도를 조사하는데 초점을 맞추었다.
- 그러므로 이번 실험의 주요 목적은 발거 후 실온의 상태에서 구강 외 노출시간의 차이에 따른 쥐 치아 치근면의 치주 인대 세포의 활성도를 MTT 검색법을 이용하여 측정하고 동시에 실제로 건조된 시간 변화에 따라 MTT로 염색된 치아의 치근을 냉동 절단법을 이용해서 절단한 후 현미경으로 관찰함으로써 MTT 검색법에 의한 측정치가 실제 치근면의치주인대세포 활성도 평가에 얼마나 높은 정확성을 갖는지 여부를 검 증하기 위해 진행 하였다.
- 또한 이번 실험의 중요한 의의는 MTT 검색법이 치주인대 세포의 활성도 평가에서 배양된 세포가 아닌 치근면에 붙어있는 세포를 직접 평가할 수 있는 기존 평가법의 문제점을 보완해주는 새로운 대안이 될 수 있는 가능성을 제시해 주었다.
- 이에 본 연구는 지금까지의 실험결과를 토대로 MTT 검색법을 이용하여 흰쥐 상악 대구치를 발거 후 짧은 시간 (즉시, 10분, 20분, 40분, 60분)동안 실온에 노출시킨 다음 치아를 MTT용액에 저장 후 치근면의 치주인대 세포 활성도를 microplate reader (BIO-RAD, AC, USA)로 흡광도 (Optical Density)를 측정함과 동시에 이를 냉동 절단법을 이용한 조직학적인 관찰 결과를 토대로 치주 인대 세포의 활성도 평가에 이용되는 MIT검색법의 유용성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 96-well plate에 MTT 용액 (0.05 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 200问 를 넣고 각 군당 제 1, 2대구치 각각 12개 치아를 MTT 용액이 있는 각 well에 담았다. 이때 혈액 내의 혈구세포 개재 가능성을 최소화하기 위하여 식염수로 치근면을 깨끗이 세척 하였다.
- Hupp 등은© 탈구된 치아의 잠재적인 치유 능력을 보다 명확히 밝혀내기 위해 세포의 표식자로서 radioactive DNA precursor인 H3 thymidine을 치 주인대세포에 부착시 킨 후치아를 탈회시켜 시편을 관찰하여 활성도를 평가하였다. Lekic 등도3 교정치료 목적으로 발치된 소구치의 치근막에서 치주인대세포를 채취하여 배양시켜 하나의 세포에서 형성된 군집 (colony) 을 methylene blue 등으로 염색하여 그 군집의 숫자를 세어 활성도를 평가하였다. 그리고 Ashkenazi 등은13' trypsin과 collagenase를 이용하여 치근 표면으로 부터 직접 치주인대세포를 채취하고 배양시켜 이를 다양한 저장 용액에 보관한 후 neutral red나 trypan blue 등으로 염색하여 치주인대 세포 활성도를 평가하였다.
- 여러가지 방법이 제시되었다. Patil 등은탈구된 치아의 치주인대 세포 활성도를 평가하는데 fluorescein diac- etate를 이용하여 염색한 후 광학 현미경과 혈구 계산판 (hemocytometer)으로 직접 세어 활성도를 측정하였다. Hupp 등은© 탈구된 치아의 잠재적인 치유 능력을 보다 명확히 밝혀내기 위해 세포의 표식자로서 radioactive DNA precursor인 H3 thymidine을 치 주인대세포에 부착시 킨 후치아를 탈회시켜 시편을 관찰하여 활성도를 평가하였다.
- 각 군당 상악 제 1, 2 대구치 각각 10개 치아를 발거 한 후 MTT 검색에서와 같이 치아를 MTT용액이 있는 각 well에 담근 후 알루미늄 foil로 96-well plate를 싸서 3시간 동안 37℃에서 배양해서 MTT가 환원되도록 했다. 그 후 각 well에서 치아를 제거한 후 Tissue-Tek O.
- 배양해서 MTT가 환원되도록 했다. 그 후 각 well에서 치아를 제거한 후 Tissue-Tek O.C.T (Optimal Cutting Temperature) Compound® (Co. Sakura made in USA)로 포매한 후 -20℃에서 냉동 시킨 다음 for- mazan결정의 광학 현미경 관찰을 위해 즉시 10 四 두께로 냉동 절단 (LEICA® CM3050 S Germany) 하여 표본을 제작하였으며 일부는 현미경 관찰시 주위조직과의 형태를 보여주기 위한 대조염색으로 Nuclear Fast Red 시액을 이용하여 염색하였다. 현미경상에서 보이는 치근면상의 특징적 인 MTT formazan 결정의 형태 및 분포 차이를 광학현미경 하에서(X 50, 100, 200, 400, 1000) 관찰한 후 현미경과 연결시킨 디지털 카메라 (LEICA® DC 300F)로 대표적 인 부위를 촬영하였다.
- 그 후 염색된 치아를 새로운 well에 다시 놓고 치아의 탈회 없이 염색된 치주조직 부위를 깨끗이 탈색시키기 위해 치아에 1% acid alcohol 350 网를 넣고 1시간 동안 담가두었다. 그 후 치아를 각각의 96-well plate에서 꺼낸 다음 탈색되어 염색된 well내의 용액을 microplate reader (BIO-RAD, AC, USA)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 간접적으로 치아에 붙어있는 치주조직의 양을정량적으로 측정하였다.
- 이들 치아를 MTT 검색법과 냉동 절단법을 이용한 조직학적 관찰에 모두 사용하였다. 날카로운 탐침으로 peritomy를 시행한 후 일관성 있는 결과를 얻기 위해 치아 주위 조직에 최소한의 외상을 가하면서 발거를 시행했으며 이때 발치와 주변의 출혈은 면봉 으로 조절하고 발치 후에는 파절된 부위가 없는지 현미경 하에서 모든 치근의 건전성을 확인하였다.
- 또한 현미경 관찰을 위해 동일한 염색 방법인 Hema- toxylin-eosin으로 10분 동안 염색한 후 Tissue-Tek O.C.T Compound®로 포매한 후 -20℃에서 냉동 절단하여 10 ㎛ 두께로 시편을 만들어 염색된 치주조직을 광학 현미경으로 관찰하였다.
- 흰쥐 80마리를 이용하였다. 발치를 용이하게 하기 위해 0.4% g-aminoproprionitrile (/5-APN, Sigma, St. Lousis, MO, USA)를 함유한 Purina 분말과 물을 사료로서 발치 전 3일간 공급하였다.
- 실험에 사용된 치아의 치근면에 붙어있는 치주조직의 양을 정량적으로 측정하기 위해 MTT 검색 실험 후 각 군의 well에서 제거된 치아를 각 군별로 96-well plate에 치아를 다시 위치시키고 Hematoxylin 350 问을 넣고 10분간 염색한 후 흐르는 물에 1분 정도 수세한 후 다시 eosin용액 350 I域을 넣고 10분간 염색한 다음 95% ethanole 30초간 탈수 시킨 다. 그 후 염색된 치아를 새로운 well에 다시 놓고 치아의 탈회 없이 염색된 치주조직 부위를 깨끗이 탈색시키기 위해 치아에 1% acid alcohol 350 网를 넣고 1시간 동안 담가두었다.
- 이번 실험에서 처음 시도된 Hematoxylin-Eosin 검색에 의한 정량적 측정법은 치근면에 붙어있는 치주조직의 양을 정 량적으로 측정하기 위해 처음에는 질량이나 표면적 등을 이용하여 구하려 했으나 기술적으로 불가능 하였고 CT scan도 이용하려 했으나 여러 가지 문제로 측정이 어려워서 MTT검색법을 응용하여 사용하게 되었다. 상악 제1, 2 대구치 각각에서 발치시에 치아의 치근면에 붙어있는 치주조직의 양을 정량적인 수치로 표시하기가 사실상 어렵고 같은 치아 부위라 할지라도 치근의 길이와 지름에 있어 제 각기다 다르므로 정확한 측정이 어려운 문제점을 보완하기 위해 시도된 방법이다.
- Sakura made in USA)로 포매한 후 -20℃에서 냉동 시킨 다음 for- mazan결정의 광학 현미경 관찰을 위해 즉시 10 四 두께로 냉동 절단 (LEICA® CM3050 S Germany) 하여 표본을 제작하였으며 일부는 현미경 관찰시 주위조직과의 형태를 보여주기 위한 대조염색으로 Nuclear Fast Red 시액을 이용하여 염색하였다. 현미경상에서 보이는 치근면상의 특징적 인 MTT formazan 결정의 형태 및 분포 차이를 광학현미경 하에서(X 50, 100, 200, 400, 1000) 관찰한 후 현미경과 연결시킨 디지털 카메라 (LEICA® DC 300F)로 대표적 인 부위를 촬영하였다.
- 흰쥐 80마리를 이용하여 상악 제 1, 2 대구치 발거 후 실온의 건조 상태에서의 짧은 시간 변화 (즉시, 10분, 20분, 40분, 60분)에 따른 쥐 치아 치근면의 치주인대 세포의 활성도를 MTT 검색법으로 측정함과 동시에 이를 냉동 절단법을 이용한 조직학적인 관찰을 통해 치주인대세포의 활성도 측정에 있어 MTT검색법의 유용성을 검증하였다.
대상 데이터
- 생후 4주된 건강하고 평균 체중 100 gm 내외의 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 80마리를 이용하였다. 발치를 용이하게 하기 위해 0.
데이터처리
- MTT 및 Hematoxylin-Eosin 검색법 에서 얻은 흡광도 (OD)는 one-way ANOVA로 분석하였으며 , 군 간의 비교는 Tukey s Studentized Range(HSD) Test 방법을 사용하였다. 그리고 각 군 간의 통계분석법은 95% 신뢰 수준이다.
이론/모형
- 1 ml/W0 g) 마취 하에 접근이 가장 용이한 좌, 우측 상악 제 1, 2 대구치를 모두 발거하였다. 이들 치아를 MTT 검색법과 냉동 절단법을 이용한 조직학적 관찰에 모두 사용하였다. 날카로운 탐침으로 peritomy를 시행한 후 일관성 있는 결과를 얻기 위해 치아 주위 조직에 최소한의 외상을 가하면서 발거를 시행했으며 이때 발치와 주변의 출혈은 면봉 으로 조절하고 발치 후에는 파절된 부위가 없는지 현미경 하에서 모든 치근의 건전성을 확인하였다.
성능/효과
- 이번 실험의 MTT 검색 결과를 살펴보면 20분 건조군 (2.210)은 즉시 처치군 (2.694)과 10분 건조군 (2.872) 과의 비교에서 통계학적인 유의차가 있음을 보였는데 , 그것은 Lindskog와 Blomlof가'"4' 건조 보관의 임계시간 (critical time)은 18 - 30분 사이인 것처 럼 보이며 그 후로는 치근 흡수에 있어 현저한 증가를 보인다는 결과와 일치하였다.
- 1. MTT 검색에 의한 흡광도 값에 있어 즉시 처치군과 10 분 건조군 사이에는 통계학적인 유의차가 없었다. 그러나, 즉시 처치군 및 10분 건조군은 20분 40분 및 60분 건조 군과 비교시 통계학적인 유의차를 보였다.
- 2. 실험에 사용된 상악 제 1 대구치의 Hematoxylin-Eosin 염색에 의한 흡광도의 평균 측정값은 상악 제 1 대구치가 제 2 대구치에 비해 더 큰 흡광도 값을 보였다. 그러나 동일 치아의 각 군 간에 평균 흡광도 값은 약간의 차이는 있었으나, 통계학적인 유의차는 보이지 않았다 (p <0.
- 3. 조직학적 현미경 관찰에서 시간 경과에 따라 환원된 MTT crystal의 모양과 분포 및 수에서 확연히 구별되는 특징적 인 양상을 보여주었다.
- 4. 치아에 붙어있는 치주조직 양의 현미경 비교 관찰을 위한 치아 시편의 Hematoxylin-Eosin 염색 관찰에서 시간 경과에 따른 치 주조직 양에 있어 군 간에 차이가 관찰되지 않았다.
- : 시간경과에 따라 crystal의 모양과 분포 및 수에서 확연히 구별되는 특징적인 양상을 보여주었다. 즉시 (Figure 6) 및 10분 건조 군 (Figure 7)에서는 가시 모양의 crystal이 전 치주인대부위 조직과 치수 내에 밀도 높게 골고루 폭넓게 퍼져 있었으며 치수내가 상대적으로 약간 더 높은 밀도의 분포 양상을 보였다.
- : 실험에 사용된 거의 모든 치아에서 치근주위에 어느 정도 균일한 두께의 치주인대 조직을 관찰할 수 있었으며 치아에 붙어있는 치주조직 양의 현미경 비교 관찰에서 모든 군의 치아에서 비슷한 정도의 치주조직 양을 관찰할 수 있었다.
- : 치근단에서 치경부로 갈수록 치주인대 부위의 MTT 염색의 정도는 거의 변화가 없었으나, 치수 내에서는 조금 다른 양상을 보였다. 치근단 부위에서는 치주인대 부위 조직에서와 거의 비슷한 정도의 MTT 염색 정도를 보였으나 치경부로 갈수록 MTT 염색이 약해지는 모습을 보였다 (Figure 4).
- Hematoxylin-Eosin 염색에 의한 흡광도 측정에서 상악제1 대구치 (1.067)와 제2 대구치 (0.790) 사이에 통계학적인 유의차 (p< 0.05)가 존재하였으며 상악 제 1 대구치에서 더 큰 흡광도 (OD) 값을 보였다. 그러나 동일한 치아를 사용한 각 군 간에는 통계학적인 유의차를 보이지 않았다.
- MTT 검색에 의한 흡광도 (OD)값은 대조군 (2.694)과 1군 (2.872) 사이를 제외하곤 시간이 흐를수록 감소된 값을 보였는데 건조 시간이 20분 (2.210) 경과 후부터 감소 폭이 증가 하다가 특히 , 3군 (1.310)과 4군 (0.970)에서는 급격한 감소를 보였다. MTT 검색에 의한 흡광도 (OD) 값이 대조군 (2.
- 응용될 수 있음을 보여 주었다. 건전한 치주 인대 세포의 보존이 치아 이식이나 재식의 성공에 중요한 영향을 미치며 구강 외 건조시간이 20분을 넘지 않아야 한다는 것을 보여주었다.
- 실험에 사용된 상악 제 1 대구치의 Hematoxylin-Eosin 염색에 의한 흡광도의 평균 측정값은 상악 제 1 대구치가 제 2 대구치에 비해 더 큰 흡광도 값을 보였다. 그러나 동일 치아의 각 군 간에 평균 흡광도 값은 약간의 차이는 있었으나, 통계학적인 유의차는 보이지 않았다 (p <0.05).
- 그리고 20분 이상 건조 군 (Figure 8 - 10)에서 부터는치주인대 부위의 crystal 결정체 수는 급격히 감소하는 양상을 보였고 치수 내도 약간의 차이는 있으나 치주인대 부위와 비슷한 양상을 보였다. 또한 crystal 결정체 모양도 시간이 경과될수록 crystal이 극히 한정된 몇 군데 부위에 cluster처럼 뭉쳐져 있는 양상을 보였다. 즉시 처치 군에서 MTT 염색에 의한 crystal 결정체를 저배율(X 100)에서 고배율(X 1000)로 연속 관찰시 특징적으로 많은 가시 같은 형태의 crystal 이 나선 형태로 전 치주인대부위 조직과 치수 내에서 골고루 산재해 있는 모습을 관찰할 수 있었다.
- 있음을 보였다. 또한, 건전한 치주인대 세포의 보존이 치아 이식이나 재식의 성공에 중요한 영향을 미치며 구강 외 건조시간이 20분을 넘지 않아야 한다는 것을 보여주었다.
- 본 연구의 결과를 종합적으로 생각해보면, MTT 검색법으로 측정한 흡광도 값과 실제로 냉동 절단법을 이용해 절단한 치근면의 MTT crystal 관찰 소견을 서로 비교하였을 때 상당히 일치된 결과를 보임으로써 MTT 검색법은 치아재식 술이나 이식술의 치료 성패를 결정짓는 치주조직의 재생에 중요한 치주인대 내의 살아있는 세포를 객관적으로 평가하는데 응용될 수 있음을 보여 주었다. 건전한 치주 인대 세포의 보존이 치아 이식이나 재식의 성공에 중요한 영향을 미치며 구강 외 건조시간이 20분을 넘지 않아야 한다는 것을 보여주었다.
- 이번 실험의 결과는 MTT 검색법으로 측정한 값과 실제로 냉동 절단법을 이용해서 절단한 치근면의 관찰 결과를 비교하였을 때 상당히 밀접한 상관관계가 있음을 보임으로써 이 방법이 치주인대세포의 활성도 평가에 충분히 사용될 수 있음을 입증해주었다.
- 이번 실험의 결과를 종합적으로 분석해보면 MTT 검색법에 의한 측정값과 냉동 절단법을 이용한 시편의 MTT 염색관찰 소견 결과를 서로 비교 했을때 상당히 밀접한 상관 관계가 있음을 보였다. 또한, 건전한 치주인대 세포의 보존이 치아 이식이나 재식의 성공에 중요한 영향을 미치며 구강 외 건조시간이 20분을 넘지 않아야 한다는 것을 보여주었다.
- 즉시 처치 군에서 MTT 염색에 의한 crystal 결정체를 저배율(X 100)에서 고배율(X 1000)로 연속 관찰시 특징적으로 많은 가시 같은 형태의 crystal 이 나선 형태로 전 치주인대부위 조직과 치수 내에서 골고루 산재해 있는 모습을 관찰할 수 있었다. 전체적인 crystal의 분포를 살펴보면 치주인대 내에서 치근면에 인접 한 부위 와 치조골에 인접한 부위가 중간부위보다 좀 더 높은 밀도의 crystal 분포를 보였다. 즉시 및 10분 처치 군에서 대조염색 (Nuclear Fast Red) 으로 염색 후 관찰한 일부 시편에서 치근단 1/3 정도의 세포성 백악질로 추정되는 부위에서 특징적인 백악질 세포와 백악질모세포를 명확히 관찰할 수 있었다.
- 조직학적 인 관찰 결과를 살펴보면 즉시 처치군과 10분 건조군 에서는 치근단 에서 치경부로 갈수록 치주인대 부위의 MTT 염색의 정도는 거의 변화가 없었으나, 치수 내에서는 치경부로 갈수록 MTT 염색이 약해지는 모습을 보였다. 이것은 아마도 생후 4주된 쥐를 사용해서 근첨이 완전히 형성되지는 않아서 MTT 용액이 치근단 공이나 분지를 통해 침투되는 깊이의 한계로 해석되며 대부분 치근단 1/2 정도까지 침투되었다.
- 전체적인 crystal의 분포를 살펴보면 치주인대 내에서 치근면에 인접 한 부위 와 치조골에 인접한 부위가 중간부위보다 좀 더 높은 밀도의 crystal 분포를 보였다. 즉시 및 10분 처치 군에서 대조염색 (Nuclear Fast Red) 으로 염색 후 관찰한 일부 시편에서 치근단 1/3 정도의 세포성 백악질로 추정되는 부위에서 특징적인 백악질 세포와 백악질모세포를 명확히 관찰할 수 있었다.
- 즉시 처치 군과 10분 건조군에서 MTT 염색에 의한 crystal 결정체를 동일 시편에서 저배율 (x 100)에서 고배율(X 1000)로의 연속 관찰시 특징적으로 많은 가시 같은 형태의 crystal이 치주인대부위와 치수 내에서 관찰되었고 전 치주인대부위와 치수 내에 골고루 널리 산재해 있는 모습을 관찰할 수 있었다. 이는 건강한 치주인대와 치수 내에서 살아있는 세포들의 고른 분포를 뜻한다고 해석된다.
- 또한 crystal 결정체 모양도 시간이 경과될수록 crystal이 극히 한정된 몇 군데 부위에 cluster처럼 뭉쳐져 있는 양상을 보였다. 즉시 처치 군에서 MTT 염색에 의한 crystal 결정체를 저배율(X 100)에서 고배율(X 1000)로 연속 관찰시 특징적으로 많은 가시 같은 형태의 crystal 이 나선 형태로 전 치주인대부위 조직과 치수 내에서 골고루 산재해 있는 모습을 관찰할 수 있었다. 전체적인 crystal의 분포를 살펴보면 치주인대 내에서 치근면에 인접 한 부위 와 치조골에 인접한 부위가 중간부위보다 좀 더 높은 밀도의 crystal 분포를 보였다.
- 790이었다. 치근의 수나 지름에 있어 상대적으로 큰 상악 제 1 대구치가 제 2 대구치에 비해 더 큰 흡광도 (OD) 값을 보였다. 그러나 동일 치 아 부위의 각군 (대조군, 1 - 4군)간에 평균 흡광도 (OD) 값은 약간의 차이는 있었으나, 통계학적인 유의차는 보이지 않았다 (p< 0.
후속연구
- 이러한 결과는 치주조직 양의 정량적 측정을 위한 H&E 염색에 의한 검색법의 객관성을 평가하는데 있어서 중요한 근거가 될 수 있으므로 의미 있는 결과라 사료된다. 앞으로 이 측정 방법의 객관성과 정확성을 입증하기위해 보다 더 많은 연구와 검증이 필요하리라 사료된다.
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