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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 OECD phase-3 프로토콜에 따라 testosterone propionate가 성 성숙 이전단계의 고환에 미치는 영향을 조사하여 안드로겐성, 항안드로겐성 물질 노출로 인한 장기 발달에 문제점을 관찰 하고자 한다.
- , 1989). 항안드로겐성 물질이 고환 발달에 영향이 없다면 병행 투여 하였을 때는 어떠한 영향이 있는지 확인하였다. 대표적인 항안드로겐성인 FLU를 가지고 병행 투여하여 고환 발달을 관찰하였다.
제안 방법
- , 1999). Hershberger assay Phase 1의 경우 단일 물질로 실험을 하여 효능제 (TP)와 길항제 (FLU)를 선정하여 생식장기 감소를 확인 하였으며, Phase 2는 이를 바탕으로 아고니스트 (methyltestosterone, trebolone)와 안타고니스트 (vinclozolin, procymi- done, linuron, DDE, finasteride)추가로 선정하여 생식 장기 무게 변화, 28일 반복 투여를 통한 독성실험을 하였다(Hershberger et al., 1953). Phase 3에서는 수술에서의 기술 문제점과 동물 보호 차원을 고려하여 미성숙 랫드로 대체 할 수 있는 방법을 모색하는데 중점을 두었다.
- TP와 FLU의 병행 투여에 의한 cDNA microar- ray분석을 통해 2배 이상 변화된 유전자들을 관찰하였다.
- 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 고환 발달 과정 중 steroidogenesis 기전 중 어떠한 변화에 의해 일어나는 지를 cDNA microarray, 단백질 변화에서 관찰 하였다. 유전자 발현에서도 steroidogenesis에 관련이 있는 CYP11A 즉, pregnenolone 단계에서 억제 되는 것을 확인할 수 있었다.
- 항안드로겐성 물질이 고환 발달에 영향이 없다면 병행 투여 하였을 때는 어떠한 영향이 있는지 확인하였다. 대표적인 항안드로겐성인 FLU를 가지고 병행 투여하여 고환 발달을 관찰하였다. FLU는 안드로겐 수용체와 안드로겐 사이의 결합을 경쟁적으로 저해하는 길항제로서 생식 장기 및 외부 생식기 발달에 저해 하는 것으로 보고가 되었다.
- 증상을 관찰하였다. 또한 체중은 1일 1회 매일 측정하였다, 시험물질을 마지막 투여한 후 24시간째 모든 동물을 ether로 마취하여 북부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 모든 동물에 대하여 생식장기 (고환, 부고환, 복측 전립선, 정낭, 항문거군, 요도구선), 일반장기 (신장, 부신, 간)를 분리하여 무게를 측정하였다.
- 또한 체중은 1일 1회 매일 측정하였다, 시험물질을 마지막 투여한 후 24시간째 모든 동물을 ether로 마취하여 북부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 모든 동물에 대하여 생식장기 (고환, 부고환, 복측 전립선, 정낭, 항문거군, 요도구선), 일반장기 (신장, 부신, 간)를 분리하여 무게를 측정하였다. 체중변화량, 사료 섭취 변화량은 매일 측정하고 난 후 투여를 하였다.
- 시험 기간동안 모든 동물에 대하여 사망여부 및 일반 증상을 관찰하였다. 또한 체중은 1일 1회 매일 측정하였다, 시험물질을 마지막 투여한 후 24시간째 모든 동물을 ether로 마취하여 북부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다.
- 안드로겐성 물질 실험은 testosterone propionate 0, 4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6 ㎎/㎏/day의 농도로 피하 투여 (s.c 3 mL/kg/day)하여 10일간 투여하였다.
- 안드로겐성 물질과 항안드로겐성 물질 병행 투여 실험은 testosterone propionate 1.0mg을 피하 투여 (s.c 3 mL/kg/day)한 후 5분이 지나서 flutamide 0.3, 1.0, 10, 30㎎/㎏/day의 농도로 경구 투여 (oral 5 mL/kg/day) 하였다.
- 임신 기간 동안은 일반상태를 관찰 하였으며, 출산일은 생후 0일로 판정하였다.
- 재현성을 살펴보기 위하여 동일한 프로토콜로 2 회 반복 실험하였다.
- 모든 동물에 대하여 생식장기 (고환, 부고환, 복측 전립선, 정낭, 항문거군, 요도구선), 일반장기 (신장, 부신, 간)를 분리하여 무게를 측정하였다. 체중변화량, 사료 섭취 변화량은 매일 측정하고 난 후 투여를 하였다.
- 항안드로겐성 물질 실험은 flutamide 10 ㎎/㎏/ day, Linurone 100 ㎎/㎏/day, p, p'-DDE 160 mg/ kg/day, procymidone 100 ㎎/㎏/day의 농도로 경구투여(oral 5mL/kg/day)하여 10일간 투여하였다.
대상 데이터
- 이것은 oils와 직접적인 관계가 있다고 할 수 없는 부분이어서, 생식장기 무게변화는 몸무게의 증가로 인한 것이라는 논란이 제기 되었다. 따라서 untreated군과 유사한 결과를 얻은 corn oil로 선정하였다. 양성대조군의 경우에는 17a-methyltestosterone (17MT) 와 testosterone propionate (TP)의 차이 이다(van Roijen et al.
- Louis, MO, USA),DDE (purity > 99%, Catalog # 12, 389-7)사 이다. 물질의 희석과 음성대조군으로 사용한 물질은 corn oil는 Sigma (St. Louis, MO, USA)사 이다.
- 시켰다. 본 실험동물은 미국 실험동물관리 인증 협회 (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care: AAALAC)가 인증한 시설에서 사육되었다.
- 본 연구에 사용된 실험동물로는 Sprague-Dawley (SD)계 22일령 랫드를 사용하였으며, 수컷과 암컷을 1:2로 교배시킨 후 임신이 확인된 동물을 polycarbonate cage에 1마리씩 개별 사육하였다. 임신 기간 동안은 일반상태를 관찰 하였으며, 출산일은 생후 0일로 판정하였다.
- 실험 동물은 국립독성연구소의 청정사육 시설 내에서 생산•사육된 특정 병원성 부재 (specific pathogen free) Sprague-Dawley계 랫드를 일정 사육 조건 (온도 23±1℃, 습도 55 ±5%, 명암 교대 시간 12시간)하에서 사육하였으며 사료와 물은 자유 섭취 시켰다. 본 실험동물은 미국 실험동물관리 인증 협회 (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care: AAALAC)가 인증한 시설에서 사육되었다.
- 실험군은 각 군당 6마리씩 사용하여 실험을 하였다.
- 안드로겐성 물질로 사용한 testosterone propionate (purity > 97%, Catalog # 205-08432)은 Wako Chemical (Japan)사 이다.
- 항안드로겐성 물질로 사용한 flutamide (puri- ty>97%, Catalog # F-9397)는 Sigma (St. Louis, MO, USA), procymidone (purity >98.7%, Catalog # PS-2126), linuron (purity > 99%, Catalog # PS-372)는 Supelco Chemical (St. Louis, MO, USA),DDE (purity > 99%, Catalog # 12, 389-7)사 이다. 물질의 희석과 음성대조군으로 사용한 물질은 corn oil는 Sigma (St.
데이터처리
- 얻어진 모든 시험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, TP시험은 음성대조군간에, 항안드로겐성물질은 양성대조군과 비교하였다.
- 통계학적 분석은 ANOVA 분석을 실시한 후 군간 비교는 Dunnett's test를 실시하여, p<0.05 이하인 경우 유의성 있는 것으로 평가하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 안드로겐성과 항안드로겐 활성평가를 위한 in vivo 단기검색법인 Hershberger assay를 실시하였다.
성능/효과
- TP의 경우에는 Hershberger assay와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. Flutamide 3 mg, DDE 16 mg, finasteride 1.0 mg, procymidone 3 mg에서 부터 유의적으로 감소하였다. 안드로겐은 남성 생식기관에서 중요한 역할을 하고 있으며, LH/FSH secretion의 feedback 조절과 부생식선 발달에도 관여를 하고 있다.
- TP 0.4~ 1.6mg 투여시 생식장기 무게 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과 생식장기 무게 변화들 중 고환 무게만 용량 의존적으로 감소하였다 (Table 1, 2). 절대 무게 변화에서는 1.
- TP에 의한 변화는 23개의 up regulated와 40개의 down regulated 유전자들, Flu에 의한 변화는 11개의 up regulated와 31개의 down regulated 유전자들을 관찰할 수 있었다.
- TP와 FLU를 병행 투여한 생식 장기 무게 변화를 조사한 결과 고환 무게 변화는 용량-반응적으로 증가하는 경향을 보였다 (Table 5, 6). 특히, FLU 3.
- FLU는 안드로겐 수용체와 안드로겐 사이의 결합을 경쟁적으로 저해하는 길항제로서 생식 장기 및 외부 생식기 발달에 저해 하는 것으로 보고가 되었다. 그 결과 고환 무게가 FLU 1.0 mg에서부터 회복 되는 경향을 보여 이것은 FLU와 TP가 각 각 androgen receptor에 경쟁적으로 반응을 하여 증가하는 것으로 사료되어진다. TP와 FLU의 병행투여 이외에 다른 항안드로겐성 물질들의 병행 투여에서도 고환의 무게가 용량 의존적으로 증가 된다는 결과들과 일치 하였다.
- 동일한 프로토콜로 실시한 2회 실험결과 모두, 유사한 형태의 결과를 나타내어 시험 간 편차는 관찰되지 않았다.
- 0 mg 투여 군에서부터 유의성 있는 감소를 보였다 (Table 5, 6). 복측 전립선의 경우 기타 생식 장기들에 비해 덜 민감하게 반응을 보여 절대 무게에서는 FLU 10 mg투여 군, 상대 무게에서는 FLU 3.0 mg투여 군에서부터 유의성 있게 감소하였다.
- 부고환, 정낭, 항문거근, 요도구선은 FLU 1.0 mg 투여 군에서부터 유의성 있는 감소를 보였다 (Table 5, 6). 복측 전립선의 경우 기타 생식 장기들에 비해 덜 민감하게 반응을 보여 절대 무게에서는 FLU 10 mg투여 군, 상대 무게에서는 FLU 3.
- , 1988). 안드로겐성 물질에서만 고환 발달에 저해를 주는 것 인지 확인 하고자 항안드로겐성 물질로 알려진 FLU, DDE, LIN, PRO를 선정하여 실험을 하였다 각각 단독 투여 한 결과 고환 발달에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었고, 부 생식 장기들에서는 감소하는 경향을 보여 주었다 (Gray et al., 1989). 항안드로겐성 물질이 고환 발달에 영향이 없다면 병행 투여 하였을 때는 어떠한 영향이 있는지 확인하였다.
- 위의 3가지의 in vivo 실험을 통해서 미성숙 시기에 안드로겐성 물질이 노출이 되었을 때 고환 발달에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 고환 발달 과정 중 steroidogenesis 기전 중 어떠한 변화에 의해 일어나는 지를 cDNA microarray, 단백질 변화에서 관찰 하였다.
- 고환 발달 과정 중 steroidogenesis 기전 중 어떠한 변화에 의해 일어나는 지를 cDNA microarray, 단백질 변화에서 관찰 하였다. 유전자 발현에서도 steroidogenesis에 관련이 있는 CYP11A 즉, pregnenolone 단계에서 억제 되는 것을 확인할 수 있었다. Cholesterole preg- henolone 단계를 거쳐서 leydig cell에서 고환을 발달 시킨다.
- 유전자 변화들 중에서 steroidogenesis에 관련 인자들을 중심으로 본 결과, cholesterol에서 pregne-nolone으로 넘어가는 단계에 관여하는 CYP11A의 감소를 것을 확인할 수 있었다(Figs. 1, 2). 1.
- 체중은 최고 용량군인 FLU 10 mg 투여 군에서 투여 기간 동안 양성대조군인 TP투여 군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Data not shown). 투여 기간 동안 약물 투여와 관련된 어떠한 이상 증상도 관찰되지 않았다.
- 있었다. 특히, TP 1.0mg 이상 노출이 되면 고환 발달에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 미성숙 시기에안드로겐성 물질이 노출이 되면 혈류를 통해 부생식장기 호르몬 수용체들에 반응을 주어 증가 한 반면, 테스토스테론 생성 기관에서는 LH 에 영향으로 감소하는 것으로 사료되어진다 (Almiron et al.
- 부고환, 정낭에서는 음성대조군과 항안드로겐성 물질 투여 군들을 (FLU 10 mg, LIN 100 mg, DDE 160 mg, PRO 100 mg) 비교 하였을 때 유의성 있게 감소하는 반면, 복측 전립선에서는 정소와 마찬가지로 변화가 없었다. 항문거근은 FLU 10 mg 투여 군, DDE 160 mg 투여 군에서 , 요도구선은 FLU 10 mg 투여 군에서 유의성 있는 감소를 나타냈다(Table 3, 4).
- 항안드로겐성 물질 투여 군 (FLU 10 mg, LIN 100 mg, DDE 160 mg, PRO 100 mg)의 생식장기 무게 변화에 미치는 영향을 조사한 결과 고환 무게는 음성대조군과 항안드로겐성 물질 투여 군들을 비교 하였으나 아무런 영향을 나타내지 않았다 (Table 3, 4). 부고환, 정낭에서는 음성대조군과 항안드로겐성 물질 투여 군들을 (FLU 10 mg, LIN 100 mg, DDE 160 mg, PRO 100 mg) 비교 하였을 때 유의성 있게 감소하는 반면, 복측 전립선에서는 정소와 마찬가지로 변화가 없었다.
후속연구
- 미성숙 시기에 안드로겐성 물질이 노출이 되면, 고환 발달변화로 형태, 길이 등 외형적인 변화로 인해 무게 감소가 나타나는 것으로 사료 되어진다. 또한, 고환발달에는 CYP11A가 주요하게 관여하는 것으로 사료 되어져 앞으로 고환발달 장애에 추가적 연구를 요하는 것으로 생각합니다.
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