The purpose of this study was to investigate the effect of Imyosan on apoptosis in human colorectal cancer HCT116 cells. Phellodendron amurense Rupr. and Atratylodes lancea D.C. compose Imyosan. First of all, to study the cytotoxic effect of methanol extract of Imyosan (IMS-MeOH) on HCT116 cells, th...
The purpose of this study was to investigate the effect of Imyosan on apoptosis in human colorectal cancer HCT116 cells. Phellodendron amurense Rupr. and Atratylodes lancea D.C. compose Imyosan. First of all, to study the cytotoxic effect of methanol extract of Imyosan (IMS-MeOH) on HCT116 cells, the cells were treated with various concentrations of IMS-MeOH and then cell viability was determined by XTT reduction method. IMS-MeOH reduced viability of HCT116 cells in a dose and time-dependent manner. To confirm the induction of apoptosis, the c1eavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP), a substrate for caspase-3 and a typical sign of apoptosis, and the activation of caspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 were examined by western blot analysis. IMS-MeOH decreased procaspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 levels in a dose-dependent manner and induced the clevage of PARP. IMS-MeOH triggered the mitochondrial apoptotic signaling by increasing the release of cytochrome c from mitochondria to cytosol. Furthermore, IMS-MeOH also downregulated the anti-apoptotic Bcl-2 and upregulated the pro-apoptotic-Bax. Therefore, these results suggest that IMS-MeOH induced HCT1l6 cell death through the mitochondrial pathway. To explore whether the activities of caspases was required for induction of apoptosis by IMS-MeOH, caspase-3, -8, -9 activity measured by using substrates, respectively. IMS-MeOH increased caspase-3, -8, -9 activity. Co-treatment with inhibitors of caspase-3, -8, -9 and IMS-MeOH significantly blocked IMS-MeOH-triggered apoptosis in HCT1l6 cells. These results suggest that IMS-MeOH induces caspases-mediated apoptosis.
The purpose of this study was to investigate the effect of Imyosan on apoptosis in human colorectal cancer HCT116 cells. Phellodendron amurense Rupr. and Atratylodes lancea D.C. compose Imyosan. First of all, to study the cytotoxic effect of methanol extract of Imyosan (IMS-MeOH) on HCT116 cells, the cells were treated with various concentrations of IMS-MeOH and then cell viability was determined by XTT reduction method. IMS-MeOH reduced viability of HCT116 cells in a dose and time-dependent manner. To confirm the induction of apoptosis, the c1eavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP), a substrate for caspase-3 and a typical sign of apoptosis, and the activation of caspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 were examined by western blot analysis. IMS-MeOH decreased procaspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 levels in a dose-dependent manner and induced the clevage of PARP. IMS-MeOH triggered the mitochondrial apoptotic signaling by increasing the release of cytochrome c from mitochondria to cytosol. Furthermore, IMS-MeOH also downregulated the anti-apoptotic Bcl-2 and upregulated the pro-apoptotic-Bax. Therefore, these results suggest that IMS-MeOH induced HCT1l6 cell death through the mitochondrial pathway. To explore whether the activities of caspases was required for induction of apoptosis by IMS-MeOH, caspase-3, -8, -9 activity measured by using substrates, respectively. IMS-MeOH increased caspase-3, -8, -9 activity. Co-treatment with inhibitors of caspase-3, -8, -9 and IMS-MeOH significantly blocked IMS-MeOH-triggered apoptosis in HCT1l6 cells. These results suggest that IMS-MeOH induces caspases-mediated apoptosis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
또한 caspase-3, -8. -9의 activity 측정을 통해 apoptosis의 기전에 관하여 조사한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
二妙散의 메탄올 추출물에 의해 HCT 116 세포의 증식이 저해되는 것이 apoptosis에 의해 유도되는 것인 지 알아보았다. 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 세포내의 apoptosis 과정에 관여하는 단백질의 발현 및 활성을 조사함으로써 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다.
二妙散의 메탄올 추출물에 의해 procaspase-3, -8, -9의 발현이 감소되는 것으로 보아 caspases의활성화를 통해 apoptosis가 매개되는 것인지 알아보기 위해 caspase-3. -8, -9의 activity를 측정急-” 한 결과, 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 caspase-3, -8.
본 실험에서는 二妙散이 사람 대장암 세포주인 HCT116의 세포사멸에 어떠한 영향을 주는 지 알아 보았다. 먼저, HCT116 세포에 대한 二妙散의독성효과를 조사하기 위하여 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별, 시간별로 처리한 후 XTT assay를 수행하여 세포 생존율의 변화를 관찰하였다.
1). 이러한 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 세포 생존율의 감소가 apoptosis에 의한 것인 지 알아보았다.
4). 이에 각각의 특이적 저해제를 추출물과 함께 처리한 후 세포생존율과 apoptosis에 어떠한 변화가 있는지 알아보았다. Fig.
대한 자료는 확인되지 않았다. 이에 본 실험에서는 사람 대장암 세포주인 HCT116을 이용하여 二妙散의 메탄올 추출물의 항암 효과를 조사하였다. 먼저, 세포독성여부를 확인하기 위하여 XTT assay를 수행하였고, apoptosis (programmed cell death) 가 유도되는 지 확인하기 위하여 apoptosis 에 관련된 단백질의 발현 양상을 western blot을 통해 알아보았다.
창출과 황백을 1:1로 배합한 二妙散의 메탄올 추출물이 사람 대장암 세포주 HCT116에 어떠한 영향을 주는 지 알아보았다.
제안 방법
1. XTT assay를 수행하여 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 HCT116 세포 생존율의 억제 효과를 확인하였다. 추출물의 처리농도와 처리 시간에 의존적으로 세포의 생존율이 저해되는 것으로 나타났다.
Caspase-3의 특이적인 저해제인 Ac-DEVD-CHO 와 caspase-8의 특이적 저해제인 Z-IETD-FMK, caspase-9의 특이적 저해제인 Z-LEHD-FMK를 二 妙散의 메탄올 추출물과 함께 처리하여 세포 생존율의 변화와 세포사멸이 진행되는 정도를 알아보았다. Fig.
Apoptosis에 관련된 단백질들의 발현 양상을 조사하기 위하여 각각의 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다. Procaspase-3, -8, -9의 발현양상을 조사함으로써 caspase의 활성화 정도를 알아보고 apoptosis의 지표인 PARP의 cleavage를 관찰하였다. 그 결과, 0.
각 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. Well당 100 “1의 XTT labeling mixture (5 ml XTT labeling reagent + 0.1 ml electron coupling reagent를 처리하여 4시간 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm 에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
二妙散의 메탄올 추출물에 의해 유도되는 세포사멸이 세포내 어떠한 신호전달을 통해 일어나는지 알아보기 위하여 세포사멸의 경로 중 하나인 mitochodrial pathway에 관여하는 Bcl-2와 Bax의 발현양상과 cytochrome c가 mitochodria로부터 세포질로 방출되는 정도를 알아보았다. 그 결과, Fig.
지 알아보았다. 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 세포내의 apoptosis 과정에 관여하는 단백질의 발현 및 활성을 조사함으로써 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Apoptosis에 관련된 단백질들의 발현 양상을 조사하기 위하여 각각의 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다.
二妙散의 메탄올 추출물을 처리 한 경우 사람 대장암 세포주인 HCT116 의 증식에 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 다양한 농도 (0. 0.05. 0.1. 0.3, 0.5, 0.7, 1 mg/ml)로 24시간 처리한 후 XTT assay를 수행하였다. 그 결과, 처리농도에 의존적으로 세포생존율이 저해되는 것을 볼 수 있었다.
1 ml electron coupling reagent를 처리하여 4시간 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm 에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
보았다. 먼저, HCT116 세포에 대한 二妙散의독성효과를 조사하기 위하여 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별, 시간별로 처리한 후 XTT assay를 수행하여 세포 생존율의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 농도의존적으로 세포생존율의 감소가 나타났다.
이에 본 실험에서는 사람 대장암 세포주인 HCT116을 이용하여 二妙散의 메탄올 추출물의 항암 효과를 조사하였다. 먼저, 세포독성여부를 확인하기 위하여 XTT assay를 수행하였고, apoptosis (programmed cell death) 가 유도되는 지 확인하기 위하여 apoptosis 에 관련된 단백질의 발현 양상을 western blot을 통해 알아보았다. 또한 caspase-3, -8.
4%까지 감소되었다. 세포의 생존율을 50%까지 저해하는 농도 (ICso) 인 0.7 mg/ml 을 세포에 처리한 후 0〜48시간까지 반응시켜 세포생존율의 변화를 알아보았다. 12시간 처리 시 69.
1과 같다. 약재 3배량의 80% methanol 을 가한 다음 48시간 동안 추출하였다 이 과정을 2회 반복한 후 여과하여 농축한 것을 동결 건조하여 분말을 얻어 실험에 사용하였다. 이 분말은 세포배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium (DMEM)에 녹여 (IMS-MeOH) 사용하였다.
000 xg에서 1시간 동안 원심분리한다. 얻어진 상층 액으로 12.8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSTPAGE) 를 수행한 후, cytochrome c 항체를 사용한 immunoblotting을 통해 세포질로 방출되는 cytochrome c를 분석하였다.
secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 검증하였다. 각 시료의 단백질 정량은 bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
것을 관찰하였다. 이에 caspases의 활성화를 매개로 apoptosis가 유도되는 것인지 확인하기 위하여 caspase-3, -8, -9의 activity를 측정하였다. 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별로 24시간 동안 처리한 후, 각각의 substrate 를 이용하여 caspase-3, -8, -9의 activity을 측정한 결과.
XTT assay용 kit는 Amersham Pharmacia Biotechnology사 (Arlington Heights. US£에서 구입하였고, protein assay reagent는 Bio-Rad사 (Hercules. USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
USA) 에서. anti-Bcl-2 와 anti-cytochrome (는 BD PharMingen사 (San Jose, USA)에서, anti-PARP, anti-beta - actin 은 Cell Signaling Technology 사 (Beverly, USA) 에서 구입하였다. 2 차 항체인 Anti-mouse IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody, anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사.
본 실험에 사용한 약재는 동국대학교 한의과대학 본초학 교실에서 선별된 것을 정선하여 사용하였으며. 二妙散의 구성 및 한 貼의 비율 및 총량은 Table.
USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide는 Bio-Rad사 (Hercules, US£에서구입하였고 NP-40, CAPS, protease inhibitors 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 anti-procaspase-3.
약재 3배량의 80% methanol 을 가한 다음 48시간 동안 추출하였다 이 과정을 2회 반복한 후 여과하여 농축한 것을 동결 건조하여 분말을 얻어 실험에 사용하였다. 이 분말은 세포배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium (DMEM)에 녹여 (IMS-MeOH) 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 평균과 표준 편차로 표현하고 유의성 검증은 Sigma Plot 2001 (Window용 version 7.0)을 이용하여 unpaired t-test를 실시하였다.
이론/모형
二妙散의 추출물이 HCT116에 대한 세포 독성을 갖는 지 알아보기 위해 XTT assay 방법"을 이용하였다. Well당 5硕개의 cell을 96 well plate에 분주하고 24시간동안 배양한 다음 serum free media로 16시간 starvation 시킨 후.
二妙散의 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 세포내의 apoptosis 과정에 관여하는 단백질의 발현 및 활성을 조사함으로써 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Apoptosis에 관련된 단백질들의 발현 양상을 조사하기 위하여 각각의 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다. Procaspase-3, -8, -9의 발현양상을 조사함으로써 caspase의 활성화 정도를 알아보고 apoptosis의 지표인 PARP의 cleavage를 관찰하였다.
성능/효과
2. Apoptosis의 지표가 되는 PARP와 caspases의발현양상을 조사하기 위하여 각각의 항체를 사용하여 western blot을 수행한 결과, 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 PARP 의 cleavages가 관찰되었고 procaspase-3. -8.
3. 추출물에 의한 apoptosis의 경로를 알아보기 위해 mitochondrial pathway 에 관여하는 Bcl-2, Bax, cytochrome c의 발현양상을 조사한 결과, 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 mitochondria로 부터 세포질로 cytochrome c 의 방출량이 증가하였고, anti-apoptotic Bcl-2 의 감소와 pro-apoptotic Bax의 증가가 관찰되었다.
2%. 75.4%, 66.6%까지 세포 생존율이 감소되었고 1 mg/ml 의 고농도에서는 44.4%까지 감소되었다. 세포의 생존율을 50%까지 저해하는 농도 (ICso) 인 0.
이에 각각의 특이적 저해제를 추출물과 함께 처리한 후 세포생존율과 apoptosis에 어떠한 변화가 있는지 알아보았다. Fig. 5에서 보듯이 추출물에 의한 세포생존율의 감소가 억제되는 것으로 관찰되었고, 또한 PARP cleavages가감소되는 것으로 보아 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 세포사멸이 저해되는 것을 알 수 있었다.
二妙散의 메탄올 추출물에 의해 HCT116의 세포사멸 유도 시 procaspase-3, -8, -9의 발현이 감소되는 것을 관찰하였다. 이에 caspases의 활성화를 매개로 apoptosis가 유도되는 것인지 확인하기 위하여 caspase-3, -8, -9의 activity를 측정하였다.
실험결과들로 보아. 二妙散의 메탄올 추출물은 대장암 세포주인 HCT116의 apoptosis를 유도할 수 있으며, 이는 mitochondria를 경유하며, 또한 caspases를 매개로 한 apoptosis임을 알 수 있었다. 이로써 二妙散이 대장암 치료에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 보이며 앞으로 더 많은 실험을 통하여 이에 관여하는 분자적 기전에 대해 알아보아야 할 것이다.
Procaspase-3, -8, -9의 발현양상을 조사함으로써 caspase의 활성화 정도를 알아보고 apoptosis의 지표인 PARP의 cleavage를 관찰하였다. 그 결과, 0.3 mg/ml 의 농도에서 PARP의 cleavage가 관찰되기 시작하였고 그 이상의 농도에서는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한 procaspase-3.
방출되는 정도를 알아보았다. 그 결과, Fig. 3에서 보듯이 처리한 二妙散의 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포질내의 cytochrome c 의 양이 점차 증가하였다. 또한, 농도 의존적으로 antiapoptotic Bcl-2가 감소하였고 proapoptotic Bax가 증가됨으로서 Bcl-2와 Bax의 비 (ratio)를나타내는 Bcl-2/Bax 값이 점차 낮아질 것으로 보인다.
먼저, HCT116 세포에 대한 二妙散의독성효과를 조사하기 위하여 二妙散의 메탄올 추출물을 농도별, 시간별로 처리한 후 XTT assay를 수행하여 세포 생존율의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 농도의존적으로 세포생존율의 감소가 나타났다. IC50 값인 0.
7, 1 mg/ml)로 24시간 처리한 후 XTT assay를 수행하였다. 그 결과, 처리농도에 의존적으로 세포생존율이 저해되는 것을 볼 수 있었다. Fig.
5(A)에서 보듯이 각각의 저해제를 함께 처리한 경우에는 二妙散의 메탄올 추출물에 의해 나타나는 PARP의 cleavage가 감소되는 것을 확인할 수 있다. 또한 XTT assay를 통해 조사해 본 결과, 각각의 caspases의 저해제를 처리한 경우 二 妙散의 메탄올 추출물에 의한 저해되는 세포 생존율 감소가 억제되는 것으로 나타났다 (Fig. 5(B)).
二妙散의 메탄올 추출물에 의한 apotosis가 caspases를 매개로 한 것인지 확인하기 위해 각각의 substrate를 이용하여 caspase-3, -8, -9 의 activity!- 측정한 결과, 농도가 증가함에 따라 caspases의 activity가 증가하였다. 또한 caspase-3, -8, -9의 특이적인 저해제인 Ac-DEVD-CHO, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK를 각각 二妙散의 메탄올 추출물과 함께 처리한 경우 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 세포의 생존율 감소가 억제되었고 apoptosis도 저해되는 것을 확인하였다.
이 같은 결과로 보아, 二妙散의 메탄올 추출물은 대장암 세포주인 HCT116의 생존율을 감소시키고 mitochondrial pathway# 통한 apoptosis를 유도할 수 있으며, 또한 caspases를 매개로 하여 apoptosis를 유도하는 것으로 생각된다.
또한, 농도 의존적으로 antiapoptotic Bcl-2가 감소하였고 proapoptotic Bax가 증가됨으로서 Bcl-2와 Bax의 비 (ratio)를나타내는 Bcl-2/Bax 값이 점차 낮아질 것으로 보인다. 이러한 결과로 보아, 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 apoptosis는 mitochondrial pathway를 경유하는 것으로 볼 수 있었다.
5(B)). 이러한 실험 결과로 보아 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 세포사멸이 caspases를 매개로 하는 것임을 알 수 있었다.
XTT assay를 수행하여 二妙散의 메탄올 추출물에 의한 HCT116 세포 생존율의 억제 효과를 확인하였다. 추출물의 처리농도와 처리 시간에 의존적으로 세포의 생존율이 저해되는 것으로 나타났다.
후속연구
二妙散의 메탄올 추출물은 대장암 세포주인 HCT116의 apoptosis를 유도할 수 있으며, 이는 mitochondria를 경유하며, 또한 caspases를 매개로 한 apoptosis임을 알 수 있었다. 이로써 二妙散이 대장암 치료에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 보이며 앞으로 더 많은 실험을 통하여 이에 관여하는 분자적 기전에 대해 알아보아야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.