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문제 정의
- 이러한 효능은 자두 품종에 따라 약간 달리 나타났으며, 특히 자두 품종 솔담의 에틸아세테이트 추출 분획물과 포모사의 헥산 추출 분획물은 인체 자궁경부암세포주에 우수한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 따라서 우수한 식품학적인 가치가 확인된 이러한 자두 성분들에 대해 물질 분석에 관한 연구 가능성을 제시한다.
제안 방법
- 1. 자두의 품종별 추출물이 인체 상피세포주와 암세포 주에 대한 세포 증식 및 억제 효과를 조사하였다. 실험에 사용한 자두 품종으로는 대석조생, 포모사 및 솔 담이었으며, 생자두에서 제조된 건조 자두의 평균 수율은 4.
- salicina L.계열의 자두품종인 대석조생, 포모사 및 솔담을 유기 용매로 추출하여, 이를 인체 상피 세포주 HaCat 세포와, 자궁경부암 세포주인 HeLa, SiHa, C33A 세포주, 그리고 위암 세포주인 SNU 638 암세포 주에 처리하여 이들 세포주의 생장에 미치는 효과를 알아보았다.
- 중량은 선발된 생자두의 10 kg을 개별 중량으로 측정하였으며, 제핵한 후 70t에서 온풍 건조하여 건중량과 수율을 측정하였다. 당도는 품종별로 제핵하여 과육 부분을 분쇄, 착즙 후 굴절 당도계(RA-510, Kyoto Electronics, MFG. Co. Ltd, Japan)로 측정하였다. 유기 용매를 통한 자두의 기능성 성분 추출 방법은 천연물 화학 연구법(Woo WS 2001)이 제시한 방법을 다음과 같이 변형하여 실행하였으며, Fig.
- 최종적으로 부탄올 층과 분리된 물 층은 80”C에서 감압 농축하여 물 분획물(KCD-05) 을 얻었다. 또한, 최초 메탄올로 침출된 추출물은 80℃에서 농축하여 메탄올 추출물(KCD-06)을 얻었으며, 자두의 열수 추출물(KCD-7)은 건조 자두에 10배량의 물을 넣고 100“C에서 1시간 동안 3회 반복 추출한 후, 여과 및 농축 과정을 거쳐 얻었다. 상기와 같은 방법으로 자두 품종 포모사(KCP) 분획 KCP-1, KCP-2, KCP-3, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7을얻었으며, 솔담(KCJ, 솔담)의 유기 용매 분획물 KCJ-1, KCJ-2, KCJ-3, KCJ-4, KCJ-5, KCJ-6, KCJ-7을 얻어 실험에 사용하였다.
- 상기와 같이 분획하여 얻은 자두의 유기 용매 추출물을 DMSO에 용해하여 최종 농도가 50 /zg/mL가 되도록 조절하여 각 세포주 배양액에 투여하였다.
- Ltd, Japan)로 측정하였다. 유기 용매를 통한 자두의 기능성 성분 추출 방법은 천연물 화학 연구법(Woo WS 2001)이 제시한 방법을 다음과 같이 변형하여 실행하였으며, Fig. 1에 표시하였다. 자두 품종 가운데 건조된 대석조생(KCD)을 분쇄기에서 파쇄한 다음, 추출 용기에 넣고 3배량의 메탄올을 가하여 16시간 동안 냉침시켰다.
- 인체 자궁경부암 세포주인 SiHa, HeLa 및 C33A 세포에 대한 자두의 추출물 분획을 첨가한 세포와 첨가하지 않은 세포의 SRB 염색에 따른 흡광도를 측정하여 세포 증식에 대한효과를 비교 분석하였다.
- 자두 유기 용매 추출물들이 인체 자궁경부 암세포주 SiHa 세포 증식에 미치는 효과는 Fig. 4의 결과와 같이 세포 증식을 억제하는 특성을 가진 분획, 그리고 추출물을 가하지 않은 군과 비교하여 세포의 증식에 크게 영향을 미치지 않은 분획으로 구분되었다. 즉, 자두 추출물 가운데 암세포의 증식을 80% 이하로 억제시킨 것은 품종 솔담의 헥산 분획(KCJ-1) 과 에틸아세테이트 분획(KCJ-3)으로 대조군 대비 70.
- 1에 표시하였다. 자두 품종 가운데 건조된 대석조생(KCD)을 분쇄기에서 파쇄한 다음, 추출 용기에 넣고 3배량의 메탄올을 가하여 16시간 동안 냉침시켰다. 메탄올 추출액을 분액깔때기에 넣고, 헥산과 물을 가하였다(자두 메탄올 추출물 : 물 : 헥산= 1 : 9 : 10).
- 자두를 품종별로 수집하여 잘 세척 한 다음, 표면의 수분을 제거한 후 자두의 품종별 특성을 조사하였다. 중량은 선발된 생자두의 10 kg을 개별 중량으로 측정하였으며, 제핵한 후 70t에서 온풍 건조하여 건중량과 수율을 측정하였다.
- 자두의 유기용매 추출물 분획에서 상피세포 성장에 미치는 효과를 보고자 상피세포주 HaCaT에 자두의 유기용매 분 획별 추출물을 가하고 48시간 후에 분획별 추출물을 가한 각 well의 세포의 형태를 관찰하고(Fig. 2), 각 well의 흡광도를 추출물을 가하지 않은 well의 흡광도와 비교 분석한 결과는 Fig. 3과 같다. 자두 추출물의 품종별 HaCaT 세포 증식은 서로 다른 특성을 나타내었다.
- 후 자두의 품종별 특성을 조사하였다. 중량은 선발된 생자두의 10 kg을 개별 중량으로 측정하였으며, 제핵한 후 70t에서 온풍 건조하여 건중량과 수율을 측정하였다. 당도는 품종별로 제핵하여 과육 부분을 분쇄, 착즙 후 굴절 당도계(RA-510, Kyoto Electronics, MFG.
- 각각의 용매가 잘 섞이도록 반복적으로 흔들어 준 다음, 헥산 층과 물 층이 분리되도록 정체하였다. 하층에 형성된 물 층은 잘 분리하여 다른 분액깔때기에 보관하고, 유기 용매 헥산을 동일한 방법으로 첨가하여 3회 반복하여 추출하였다. 분리된 헥산 층은 회전식 진공 추출기(EYELA, Japan)에서 80℃로감압 농축하여 자두의 헥산 분획 추출물(KCD-1)을 얻었다.
대상 데이터
- SiHa 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며, HeLa 세포는 L-glutamine(300 mg/L), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 가 첨가된 RPMI1640에 fetal bovine serum(FBS)을 10%를 가하여 만든 배지를 사용하였다. C33A세포주는 DMEM과 F12 배지를 1:1로 혼합하여 FBS를 5% 농도로 첨가한 배지를 사용하였다.
- A cell을 사용하였다. SiHa 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며, HeLa 세포는 L-glutamine(300 mg/L), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 가 첨가된 RPMI1640에 fetal bovine serum(FBS)을 10%를 가하여 만든 배지를 사용하였다. C33A세포주는 DMEM과 F12 배지를 1:1로 혼합하여 FBS를 5% 농도로 첨가한 배지를 사용하였다.
- cell was HPV 18 positive and wild type p53. The data were expressed as meaMSD of three independent experiments performedin triplicate.
- 이용하였다. 사람 상피세포주인 HaCaT 세포는 10% FBS와 항생제(페니실린 100 U/mL + 스트렙토마이신 100 mg/mL)가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포주를 96 well plate에 각각 3xl03 4 cell°] 되도록 분주한 다음 자두의 유기 용매 추출물 분획들을 각 세포주 배양액에 투여하였다.
- 또한, 최초 메탄올로 침출된 추출물은 80℃에서 농축하여 메탄올 추출물(KCD-06)을 얻었으며, 자두의 열수 추출물(KCD-7)은 건조 자두에 10배량의 물을 넣고 100“C에서 1시간 동안 3회 반복 추출한 후, 여과 및 농축 과정을 거쳐 얻었다. 상기와 같은 방법으로 자두 품종 포모사(KCP) 분획 KCP-1, KCP-2, KCP-3, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7을얻었으며, 솔담(KCJ, 솔담)의 유기 용매 분획물 KCJ-1, KCJ-2, KCJ-3, KCJ-4, KCJ-5, KCJ-6, KCJ-7을 얻어 실험에 사용하였다.
- 상피세포 증식 유도에 미치는 영향을 분석하여 세포 생장에 미치는 효과를 알아보기 위하여 상피세포주인 HaCaT 세포를 이용하였다. 사람 상피세포주인 HaCaT 세포는 10% FBS와 항생제(페니실린 100 U/mL + 스트렙토마이신 100 mg/mL)가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
- 인체 상피세포주 HaCaT와 인체 자궁경부암세포주 HeLa, SiHa, C33A는 한국생명공학연구원이 보유하고 있는 세포주이고, 위암 세포주 SNU 638은 서울대학교 세포주 은행에서 분양받았다. 세포 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM), RPMI 등의 배지는 Gibco 日파사에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 자궁경부암 세포주로는 인체 유두종 바이러스 함유 세포주인 HeLa, SiHa cell과 일반 자궁경부암 세포주인 C33A cell을 사용하였다. SiHa 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며, HeLa 세포는 L-glutamine(300 mg/L), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 가 첨가된 RPMI1640에 fetal bovine serum(FBS)을 10%를 가하여 만든 배지를 사용하였다.
- 연구에 사용된 자두는 김천 농업직판장에서 판매되는 대석조생 (Oishiwase, KCD), 포모사(Formosa, KCP), 솔담(Soldam, KCJ)을 품종별로 완숙과를 구입하였다. 인체 상피세포주 HaCaT와 인체 자궁경부암세포주 HeLa, SiHa, C33A는 한국생명공학연구원이 보유하고 있는 세포주이고, 위암 세포주 SNU 638은 서울대학교 세포주 은행에서 분양받았다.
- KCJ)을 품종별로 완숙과를 구입하였다. 인체 상피세포주 HaCaT와 인체 자궁경부암세포주 HeLa, SiHa, C33A는 한국생명공학연구원이 보유하고 있는 세포주이고, 위암 세포주 SNU 638은 서울대학교 세포주 은행에서 분양받았다. 세포 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM), RPMI 등의 배지는 Gibco 日파사에서 구입하였다.
데이터처리
- 각 plate well의 흡광도는 560 때에서 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 추출물을 투여하지 않은 세포군과 투여한 세포군의 세포 증식 분석은 3번의 반복 시험을 통해 평균값과 표준 편차를 구하였다.
이론/모형
- 시험되는 세포주는 3TC에서 5% CO2를 공급하여 48 시간 동안 배양하였다. 배양 2일 후에 상피세포의 증식 능은 약품의 세포 독성능 측정에 이용되는 sulforhodamine(SRB) 염색법(Skehan et al 1990)으로 측정하였다. 즉, 48 시간 후에 각 96 well plate 내의 배양액을 제거하고 -20 ℃ 에 보관한 70% acetone 용액을 각 96 plate의 각 well에 100 //L씩 가한 다음 -20℃에서 30분간 세포를 고정하였다.
- 시험 세포주는 3TC에서 5% CO2 를 공급하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 2일 후에 암세포의 증식능은 상기와 같이 SRB 염색법으로 측정하였다.
성능/효과
- 2. 자두 추출물 중 인체 상피세포주 HaCaT 세포의 증식에 미치는 효능 측정에서 포모사 추출물인 KCP-6(147.3%), 솔담 추출물인 KCJ-4(127.9%), KCJ-3(120.3%), KCJ-6 (118.8%)과 그리고 대석조생에서 추출한 KCD-4(123.2%) 는 대조군 대비 20% 이상의 상피세포 증식 유도능을 보여, 포모사의 메탄올 추출물이 가장 우수한 상피세포 증식 효능이 있었다.
- 3. 인체 유두종 바이러스(HPV 16과 HPV 18) 유래 자궁경부암 세포주인 SiHa 세포와 HeLa 세포 증식에 미치는 자두의 유기 용매 추출물로는 품종 솔담의 에틸아세테이트 분획(KCJ-3)이 대조군 대비 각각 61.5%와 80%의 증식 억제 효과를 나타내었다. p53 변이 단백질 유래 자궁경부암 세포주 C33A 세포 증식에 미치는 효과는 포모사의 헥산 분획(KCP-1)과 대석조생의 헥산 분획(KCD-1)이 각각 20.
- 5%와 80%의 증식 억제 효과를 나타내었다. p53 변이 단백질 유래 자궁경부암 세포주 C33A 세포 증식에 미치는 효과는 포모사의 헥산 분획(KCP-1)과 대석조생의 헥산 분획(KCD-1)이 각각 20.4%와 61.7%로 매우 높은 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 위암세포주인 SNU 638 세포에서는 시험에 사용된 모든 분획 추출물(KCD-4, KCJ-3, KCJ-4, KCJ-6, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7)들이 증식 억제 효과를 보였다.
- 추출한 결과는 Table 2와 같다. 건조 자두 300 으을 메탄올로 16시간 동안 침지시킨 후, 여과 및 농축하여, 헥산(자두 메탄올 추출물 : 물 : 헥산 =1 : 9 : 10)으로 가하여 분리된 헥산 추출물(KC-1)은 0.15%의 평균 수율을 나타내었다. 헥산층으로 분리된 하층에 클로르포름을 넣어 분리된 클로르포름추출물(KC -2)의 평균 수율은 0.
- 결론적으로 자두의 추출물은 상피세포 증식을 유도하거나 바이러스 감염으로 인한 암 발생을 억제하거나 또는 p53 변이로 유발된 암세포도 억제할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인하였으며, 위암 발생도 억제할 수 있는 가능성도 확인하였다. 이러한 효능은 자두 품종에 따라 약간 달리 나타났으며, 특히 자두 품종 솔담의 에틸아세테이트 추출 분획물과 포모사의 헥산 추출 분획물은 인체 자궁경부암세포주에 우수한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
- 3%의 증가율을 보였다. 그리고 품종 대석조생의분획 추출물인 KCD-1, KCD-2, KCD-3, KCD-4은 HaCaT 세포에 대한 증식율은 각각 100.7%, 93.1%, 83.5%, 123.2%로 나타났으며, KCD-4 가 추출물을 가하지 않은 대조군에 비해 123.2%의 증가율을 보였다. 이 결과에서 품종 포모사의 메탄올 추출물인 KCP-6이 여러 분획물 중에서 가장 높은 세포증식 유도율을 보였다.
- 1%로 세포증식에 영향을 주지 않았다. 또한, 정상 상피세포주인 HaCaT 세포에서는 127.9%의 세포 증식 효과를 나타내었다(Fig. 7). 이는 KCJ-3 분획 성분이 HPV 유래 자궁경부암세포에만 특이적으로 증식 억제 효과를 나타내는 것을 의미한다.
- 자두의 품종별 추출물이 인체 상피세포주와 암세포 주에 대한 세포 증식 및 억제 효과를 조사하였다. 실험에 사용한 자두 품종으로는 대석조생, 포모사 및 솔 담이었으며, 생자두에서 제조된 건조 자두의 평균 수율은 4.0 ~4.41%로 나타내었으며, 솔담이 4.41%로 가장 우수하였다.
- 7%로 매우 높은 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 위암세포주인 SNU 638 세포에서는 시험에 사용된 모든 분획 추출물(KCD-4, KCJ-3, KCJ-4, KCJ-6, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7)들이 증식 억제 효과를 보였다.
- 2%의 증가율을 보였다. 이 결과에서 품종 포모사의 메탄올 추출물인 KCP-6이 여러 분획물 중에서 가장 높은 세포증식 유도율을 보였다. HaCaT 세포는 일반적으로 자외선 피폭에 대응하는 물질의 효능 시험 세포주로 이용된다(Ahsan et al 2007).
- 이러한 효능은 자두 품종에 따라 약간 달리 나타났으며, 특히 자두 품종 솔담의 에틸아세테이트 추출 분획물과 포모사의 헥산 추출 분획물은 인체 자궁경부암세포주에 우수한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 따라서 우수한 식품학적인 가치가 확인된 이러한 자두 성분들에 대해 물질 분석에 관한 연구 가능성을 제시한다.
- 78%였다. 이상과 같은 결과는 자두 품종에 상관없이 열수, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 클로르포름 및 헥산순으로 추출 수율이 높게 나타났다.
- 이상의 결과로 볼 때 자두 유기 용매 추출물들은 세포주의 종류에 따라 세포의 증식과 억제에 미치는 효과가 다른 것으로 나타났다. 즉, 품종 솔담의 에틸아세테이트 분획물인 KCJ-3 은 HPV 유래 자궁경부암 세포주인 SiHa, HeLa 세포에 대하여 61.
- 이는 KCJ-3 분획 성분이 HPV 유래 자궁경부암세포에만 특이적으로 증식 억제 효과를 나타내는 것을 의미한다. 이에 비해 KCP-1과 KCD-1 분획 성분은 Fig. 8과 같이 p 53 돌연변이 유래 자궁경부암세포인 C33A에 특이적으로 작용하였으나, 정상세포(HaCaT)와 다른 암세포주 생장 억제에 영향을 미치지 않아 p53 변이 암세포에 대하여 효과가 있을 것으로 추정된다. 상기 추출물들의 정확한 작용 기전을 밝히기 위해서는 자두 주줄 분획의 정제를 통한 실험이 요구된다.
- 자두 유기 용매 추출물의 각 분획이 C33A 세포 증식에 미치는 효과는 Fig. 6과 같으며, 세포 증식을 촉진시키는 특성을 가지는 분획은 KCJ-4(155.5%), KCJ-6(162.9%), KCP-3(156.8%), KCEM(163.8%), KCP-5(147.5%), KCP-6(167.8%), KCP-7(148.3%), KO>2(139.4%), KO>3(147.2%), KCEM(172.7%), KCJ-3(100.1%), KCP-2(117.8%)이며, 세포 증식을 억제하는 특성을 가진 분획은 KCP-1(20.4%), KCD-1(61.7%)이었다.
- 9。6조로 나타내었다. 자두 추출물을 얻기 위하여 생자두로부터 제핵하여 건조 자두를 제조한 결과 수율은 생자두 중량대비 4.0~4.41%로 나타났다(Table 1).
- 4의 결과와 같이 세포 증식을 억제하는 특성을 가진 분획, 그리고 추출물을 가하지 않은 군과 비교하여 세포의 증식에 크게 영향을 미치지 않은 분획으로 구분되었다. 즉, 자두 추출물 가운데 암세포의 증식을 80% 이하로 억제시킨 것은 품종 솔담의 헥산 분획(KCJ-1) 과 에틸아세테이트 분획(KCJ-3)으로 대조군 대비 70.5% 및 61.5%의 세포 증식을 나타내었고, 그 외의 다른 분획들은 세포의 증식 억제에 크게 영향을 미치지 않았다.
- 나타났다. 즉, 품종 솔담의 에틸아세테이트 분획물인 KCJ-3 은 HPV 유래 자궁경부암 세포주인 SiHa, HeLa 세포에 대하여 61.5%, 80.0%로 세포 증식을 억제하였으나, P53 변이단백질을 가진 자궁경부암 세포주 C33A에서는 100.1%로 세포증식에 영향을 주지 않았다. 또한, 정상 상피세포주인 HaCaT 세포에서는 127.
- 31%이었다. 최종 분획물중 물 추출물(KC-05)은 0.79%의 평균 수율을 보였으며, 연속적인 유기 용매 추출에 들어가기 전, 초기 메탄올 냉침물을 여과하여 농축된 메탄올 추출물(KC-6)은 1.28%, 그리고 별도의 건조 자두 열수 추출물의 수율(KC-7)은 1.78%였다. 이상과 같은 결과는 자두 품종에 상관없이 열수, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 클로르포름 및 헥산순으로 추출 수율이 높게 나타났다.
- 9와 같다. 추출물을 가하지 않은 wel에 대한 분획 추출물을 가한 well들의 암세포주 성장율 비교 실험에서 KCD-4(90.1%), KCJ-3(74.9%), KCJ-6(80.1%), KCP-4 (78.4%), KCP-5(85.8%), KCP-6(81.4%), KCP-7(70.5%) 분획물 모두 위암세포(SNU 638)의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
- 5와 같다. 추출물을 투여하지 않은 군과 비교하여 세포 증식을 촉진시키는특성을 가지는 분획은 KCP-1(115.5%), KCP-2(145.8%), KCP-3(151.3%), KCP-4(122.7%), KCP-5(145.0%), KCP-6(201.7%), KCP-7(118.3%), KCD-1(194.4%), KCD-2(172.4%), KCD-3 (152.9%), KCJ-4(118.8%)이었으며, 세포 증식을 억제하는 분획으로는 KCJ-3(80.0%)과 KCD-4(94.9%) 이었다.
- 9%의 증가율을 보였다. 품종 포모사의 분획 추출물인 KCP-1, KCP-2, KCP-3, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7 이 HaCaT 세포에 대한 증식율은 각각 97.9%, 90.2%, 94.9%, 107.4%, 113.9%, 147.3%, 109.4%로 나타났으며, 이 가운데 KCP-6이 추출물을 가하지 않은 대조군에 비해 147.3%의 증가율을 보였다. 그리고 품종 대석조생의분획 추출물인 KCD-1, KCD-2, KCD-3, KCD-4은 HaCaT 세포에 대한 증식율은 각각 100.
- 자두 추출물의 품종별 HaCaT 세포 증식은 서로 다른 특성을 나타내었다. 품종명 솔담 분획 추출물인KCJ-l, KCJ-3, KCJ-4, KCJ-5, KCJ-6이 HaCaT 세포에 미치는 증식율은 각각 71.6%, 120.3 %, 127.9%, 120.0%, 118.8%로 나타났으며, 이 중 최고 증가율을 보인 것은 KCJ-4로서, 추출물을 가하지 않은 대조군에 비해 127.9%의 증가율을 보였다. 품종 포모사의 분획 추출물인 KCP-1, KCP-2, KCP-3, KCP-4, KCP-5, KCP-6, KCP-7 이 HaCaT 세포에 대한 증식율은 각각 97.
- 품종별 자두의 개당 평균 중량은 대석조생 68.3g, 포모사 71.5 g, 솔담 81.2 으으로 나타내었으며, 수분 함량은 포모사 92.3%, 대석조생 88.2%, 그리고 솔담 82.3% 순이었다. 당도는 솔 담이 14.
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