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문제 정의
- 따라서 이번 연구는 제주도에 자생하는 두메꿀풀의 열수 추출물과 그 열수추출물을 첨가하여 배 양된 미생물 (£. rhamnosus) 배양액을 사료 내에 첨가하여 넙치 치어에 공급하였을 때의 성장효과, 생존율 및 비 특이적 면역반응을 조사하고자 수행되었다.
제안 방법
- 실험 사료의 단백질원으로 어분, 대두박 및 콘글루텐밀을 사용하였으며 , 탄수화물원으로는 밀가루, 지 질원으로는 오징 어 간어 유를 사용하였다. 3개의 실험사료는 기초사료를 이용한 대조구 (CON), 기초사료에 50mL의 열수추출액을 첨가한 HE 사료 및 50mL의 미생물 (£. rhamnosus) 배양액을 첨가한 LF 사료로 열수 추출액 과 미 생 물배 양액 을 액 상형 태 로 첨가하여 제 작되었다. 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료 조성 표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30-40%에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM- 14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다.
- 8주간의 사료공급 실험 후, 어류의 최종 평균무게를 측정하여 증체율 (Weight gain), 사료섭 취율 (Feed intake), 사료전환효율 (Feed conversion ratio), 일간성장률 (Specific growth rate), 단백 질 전환효율 (Protein efficiency ratio) 및 생 존율 (Survival) 을 계산하였다. 최종 무게측정 2일 후 마지막 사료 공급올한 후 3시간과 24시간 후에 각 수조마다 12마리씩의 어류를무작위로 선별하여 tricaine methanesulfbnate (MS-222, 100 mg/L) 용액으로 마취시켜 헤파린 처리가 된 주사기를 사용하여 미부동맥에서 채혈을 한 후, Hematocrit, Hemoglibin 및 Nitroblue tetrazolium (NBT) activity를 측정하였다.
- Hematocrit은 헤파린이 처리된 모세혈관채혈튜브 (Micro- Hematocrit Capillary Tubes)에 혈액을 채운 다음 고무판(Wax plates)에 세운 후, 혈액진단원심분리기 (Micro Hematorit VS- 12000, Vision Scientific, Korea)에서 10분간 원심분리 하여값을 측정하였다.
- 2% NBT 용액을 1:1의 비율로 각각 50〃L씩 혼합한 후, 25℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 50〃L을 취하여 유리튜브에 옮긴다. 그 후 Formazon 생성을 감소시키기 위해 1 mL의 dimethyl forma- mide를 첨가한 후, 2000xg에서 5분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 상층액을 취한 후, NBT의 감소되는 범위를 spectrophotometer (Genesys 10 UV, Rochester, NY, USA)를 사용하여 최적의 흡광도인 540nm에서 측정하였다. Blank는 dimethyl formamide를 사용하였다.
- 0xl08 CFU/mL 농도로 접종하여 37℃에서 48시간 정치배양 되었다. 배양하는 동안 12시간마다 UV/VIS spectrophotometer (Hanson OPRON-3000, Korea)를 사용하여 660 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 생육을 조사하였고, 그 후 다시 MRS broth에 L. rhamnosus를 5% 접종한 후 자생식물 열수주줄액을 5% 첨가하여 37℃에서 48시간 배양한 후 실험사료 제작 시에 첨가되었다.
- 측정으로 분석되었다. 분석방법은 혈액과 0.2% NBT 용액을 1:1의 비율로 각각 50〃L씩 혼합한 후, 25℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 50〃L을 취하여 유리튜브에 옮긴다. 그 후 Formazon 생성을 감소시키기 위해 1 mL의 dimethyl forma- mide를 첨가한 후, 2000xg에서 5분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 상층액을 취한 후, NBT의 감소되는 범위를 spectrophotometer (Genesys 10 UV, Rochester, NY, USA)를 사용하여 최적의 흡광도인 540nm에서 측정하였다.
- 01 g)는 총 9개의 100L 원형수조에 각 수조 당 30 마리씩 무작위로 선택되어 배치되었다. 사료 공급 실험은 사료 실험구 당 3 반복구를두었으며 , 사육수는 여과해수를 사용하여 2-3 L/min 의 유수량이 공급되도록 조절되었고, 모든 실험수조에 용존산소 유지와 원활한 사육수 순환을 위하여 에어스톤을 설치하였다. 광주기는 자동타이머가 설치된 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지되었고, 전 실험기간 동안 평균 수온은 15℃에서 19℃ 범위로 자연수온에 의존되었다.
- 성장률 측정은 매 2주마다 실시되었고, 측정 2나 시간 전에 모든 실험어류를 절식시켰다. 사료공급실험은 총 8주간 수행되었다.
- 실험사료는 1일 2회 (09:00와 16:00시) 최초 어체중의 4% (dry matter basis)를 매 일 공급 하였고, 성장해 감에 따라 3%로 감소시키면서 제한급이를 하였다. 성장률 측정은 매 2주마다 실시되었고, 측정 2나 시간 전에 모든 실험어류를 절식시켰다. 사료공급실험은 총 8주간 수행되었다.
- rhamnosus) 배양액을 첨가한 LF 사료로 열수 추출액 과 미 생 물배 양액 을 액 상형 태 로 첨가하여 제 작되었다. 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료 조성 표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30-40%에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM- 14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다. 혼합반죽물은 소형쵸파기 (SMC-12, KOREA)를 이용하여 직경 3 mm 크기로 성형되었다.
- 광주기는 자동타이머가 설치된 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지되었고, 전 실험기간 동안 평균 수온은 15℃에서 19℃ 범위로 자연수온에 의존되었다. 실험사료는 1일 2회 (09:00와 16:00시) 최초 어체중의 4% (dry matter basis)를 매 일 공급 하였고, 성장해 감에 따라 3%로 감소시키면서 제한급이를 하였다. 성장률 측정은 매 2주마다 실시되었고, 측정 2나 시간 전에 모든 실험어류를 절식시켰다.
- 실험사료에서의 총 폴리페놀 함량은 Skerget et al. (2005)의 방법을 기초로 약간 수정하여 비색 정량하였다. 먼저, 사료를분쇄시킨 다음 각 사료의 1 g을 메타놀 50mL에 넣은 후 40℃ 에서 2시간 동안 추출하였다.
- 건조 후 꽃술 부위만 자른 다음 분쇄기를 이용하여 미세하게 분쇄한 후 실험에 사용하였다. 증류수 400 mL 당 40 g의 식물시료를 혼합하여 100℃ 수욕상에서 약 30분간 중탕한 다음 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 1차 여과 과정을 거친 후 0.45 “m 주사기용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 식물 열수추출액을 조제 하였다. 조제된 시료는 4℃에 냉장 보관하여 실험사료 제작 시에 첨가되었다.
- 채집된 두메꿀풀은 물을 이용하여 흙과 같은 이물질을 제거한 후 바람이 잘 통하는 음지에서 3일 이상 건조하여 수분을 제거 하였다. 건조 후 꽃술 부위만 자른 다음 분쇄기를 이용하여 미세하게 분쇄한 후 실험에 사용하였다.
- 계산하였다. 최종 무게측정 2일 후 마지막 사료 공급올한 후 3시간과 24시간 후에 각 수조마다 12마리씩의 어류를무작위로 선별하여 tricaine methanesulfbnate (MS-222, 100 mg/L) 용액으로 마취시켜 헤파린 처리가 된 주사기를 사용하여 미부동맥에서 채혈을 한 후, Hematocrit, Hemoglibin 및 Nitroblue tetrazolium (NBT) activity를 측정하였다. 분석후, 남은 혈액은 Alanine aminotransferase (ALT)와 Aspartate aminotransferase (AST) 분석을 위해 원심분리기 (Micro 17TR, Hanil Science, Korea)를 이용하여 5,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하여 혈장을 분리하였다.
- 헤모글로빈, ALT 및 AST 분석은 각각의 시약과 반응 시킨 후 혈액생화학분석기 (Express plus system, Bayer, USA)를 이용하여 분석하였다. 헤모글로빈은 end point, ALT와 AST는 kinetic방법으로 분석되었다.
대상 데이터
- 이 실험에 사용된 자생식물 두메 꿀풀 (Pnme"a vulgaris) 추출액은 in 初7m에서 어류 질병미생물에 대한 항균활성과 항산화효과를 보였고, hydroxyl radical 소거활성도 BHA (Butylated hydroxyanisole) 및 BHT (Butylated hydroxytoluene)와 비교하여 높거 나 유사한 것으로 나타났다 (Moon et al, 2006).
- 그 후 Formazon 생성을 감소시키기 위해 1 mL의 dimethyl forma- mide를 첨가한 후, 2000xg에서 5분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 상층액을 취한 후, NBT의 감소되는 범위를 spectrophotometer (Genesys 10 UV, Rochester, NY, USA)를 사용하여 최적의 흡광도인 540nm에서 측정하였다. Blank는 dimethyl formamide를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 실험어류는 제주도내 창해수산에서 종묘생산된 넙치 치어로 제주대학교 소속 해양과환경연구소로운송되어, 4주 동안 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에적응할 수 있도록 순치시킨 후 사료공급실험에 사용되었다.
- 본 연구에 사용된 미생물은 한국종균협회 (KCCM, Korean Culture Center of Microorgaism)에서 L. rhamnosus (KCCM 32826)를 분양받아 MRS agar (Difco, USA)에서 stab culture하여 4】C에 보관하면서 계대배양 하였다.
- 6MJ/kg의 에너지 함량을 갖도록 동일하게 조성되었다(Table 1). 실험 사료의 단백질원으로 어분, 대두박 및 콘글루텐밀을 사용하였으며 , 탄수화물원으로는 밀가루, 지 질원으로는 오징 어 간어 유를 사용하였다. 3개의 실험사료는 기초사료를 이용한 대조구 (CON), 기초사료에 50mL의 열수추출액을 첨가한 HE 사료 및 50mL의 미생물 (£.
- 실험사료 제조는 우선 모든 사료원들을 파쇄기를 이용하여 분말형태로 일정하게 만들고, 각 사료원들을 사료 조성 표에 따라 정확히 무게를 잰 후, 잘 섞은 다음 사료원 총량의 30-40%에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기 (NVM- 14-2P, KOREA)로 혼합, 반죽시켰다. 혼합반죽물은 소형쵸파기 (SMC-12, KOREA)를 이용하여 직경 3 mm 크기로 성형되었다. 성형된 실험사료는 -70℃ 동결냉동 건조기에서 건조시켜 , 시 브 (Sieve)를 이용하여 적 당한 크기의 사료로 가공되 었으며, 사료 공급 전까지 -20℃ 냉동고에 보관되었다.
데이터처리
- 0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Duncan's multiple test (P<0.05)로 비교되었다. 데 이터는 평균값 士표준편차 (mean士 SD)로 나타내었다.
- 데 이터는 평균값 士표준편차 (mean士 SD)로 나타내었다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석되었다.
- 실험사료군의 배치는 완전확률계획 법 (Completely randomized design)에 따라 실시하였고, 성장 및 분석결과는 SPSS (Version 12.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Duncan's multiple test (P<0.
이론/모형
- 실험사료의 일반성분은 AOAC (1995) 방법에 따라 수분은상압가열건조법 (125 ℃, 3 hr), 조회분은 직접회화법 (550t, 12 hr), 단백질은 자동 조단백분석기 (Kejltec system 2300, Sweden)로 분석되었으며, 지방은 Folch et al. (1959)의 방법에따라 Soxhlet 추출장치 (Soxhlet heater system C-SH6, Korea)를이용하여 분석되었다.
- 분석하였다. 헤모글로빈은 end point, ALT와 AST는 kinetic방법으로 분석되었다.
성능/효과
- 8주간의 성장실험 결과, 사료 내 자생식물 두메꿀풀의 열수추출액 (HE)과 미 생물배 양액 (LE) 첨가에 따른 성장률, 일간성장률, 사료전환효율, 사료섭취율, 단백질전환효율 및 생존율에서는 유의 적 인 차이를 관찰할 수 없었다 (Table 2). 비록유의적인 차이는 관찰할 수 없었지만 HE와 LE 첨가구가 대조구에 비해 성장률과 단백질전환효율에서 낮은 경향을 보였다.
- 실험사료를 섭취한 넙치 치어의 혈장성분의 변화는 Table 3에나타내 었다. ALT와 AST의 분석결과, HE와 LF 실험사료를섭취한 실험구가 대조구와 비교하여 뚜렷하게 낮은 경향을관찰할 수 있었으며, ALT의 값에서는 HE를 섭취한 실험구가대조구보다 유의적으로 낮은 값을 보였다 (P<0.05).
- ALT와 AST의 활성에서는 HE와 LF 사료를 섭취한 실험구가 대조구보다 낮은 값을 나타내 었고 (Table 3), HE 실험 구의 ALT 활성은 대조구 보다 유의적으로 낮았다 (P<0.05). ALT와 AST 효소들의 활성은 일반적으로 척추동물에서 간의 기능과상태를 나타내는 지표로서 자주 사용되며 일반적으로 높은 ALT와 AST는 간 기 능의 손상 또는 약화를 의미 한다.
- (Pan et al, 2003). 따라서 사료 내 두메꿀풀 열수추출액과 미생물배양액은 넙치의 간 기능을 개선시킬 수 있을 것으로 판단된다.
- (2006)은 넙치에서 NBT activity를 분석하여 톳의 면역증강효과를 증명하였다. 따라서 이 연구에서 나타난 높은 NBT 활성은 사료 내 HE와 LF의 첨가가 어류의 면역력을 증강시킬수 있음을 잘 말해준다고 할 수 있다
- 유산균들의 콜레스테롤 저하성, 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성에 대해 연구한 결과, Lactobacillus 균주들에서 강한 내성이 있는 것으로 보고되었다. 따라서 이 연구에서도 자생식물 추출물을 0.5% 첨가하여 배양한 미생물 Z. rhamnosus가 사료 공급을 통해 효과적으로 생체 내에 전달되어 비 특이적 면역반응 (증가된 NBT 활성, Table 4)을 높였을 것으로 판단된다.
- 먹이공급 3시간 후의 혈액에서 분석한 NBT activity는 HE와 LF를 섭취한 실험구에서 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였다 (P<0.05). 실험사료 내 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 모든 실험사료에서 0.
- 먹이공급 후 3시간과 24시간 후의 혈액에서 hematocrit, hemoglobin 및 NBT activity를 비교하면, 3시간 후의 결과가 24시간 후의 결과보다 유의적으로 높았다. 이것은 어류의 대사과정에서 먹이 섭취 후 소화과정을 거쳐 3시간 후에 영양소가 장으로부터 흡수되어 혈액으로 공급되어 각 조직과 기관으로 전달되고 24시간 후에는 다시 정상으로 돌아오는 것을 나타낸다.
- 본 연구에서 사료 내 자생식물 두메꿀풀의 열수 추출액과 미생물 배양액을 첨가하여 넙치 치어에 공급한 결과, 성장률, 일간성 장률, 사료전환효율, 사료섭 취 율, 단백 질전환효율 및 생존율에 아무런 영향을 미치지 않았다. 식물체에서의 생리활성물질은 주로 대사과정 중에 생합성 되는 2차 대사산물로 식물체가 생존과정 중에 함유하면서 생체대사에 유용하게 사용하거나, 외부로 분비되어 다른 식물의 생장에 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다 (Rice, 1984; Kim et al.
- 비록유의적인 차이는 관찰할 수 없었지만 HE와 LE 첨가구가 대조구에 비해 성장률과 단백질전환효율에서 낮은 경향을 보였다. 실험사료를 섭취한 넙치 치어의 혈장성분의 변화는 Table 3에나타내 었다.
- 사료 내 열수추출액과 미생물배양액이 비 특이적 면역반응에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 시간대별 (먹이공급 후 3 hr, 24 hr 후)로 혈 액을 채취하여 NBT activity를분석한 결과, 3시간 후에 자생식물 두메꿀풀 추출액과 미생물배 양액을 첨가한 실험구 (HE, LF)에서 대조구보다 유의 적으로 높은 활성을 보였다. 어류의 외부 병원체에 대한 방어 시스템은 포유동물에서 설명된 것과 기본적으로 비슷하다(Iwama and Nakanishi, 1996).
- 하지만 보다 더 구체적인 메커니즘은 장기간의 성장실험과 자생식물 추출물의 성분분석을 통한 충분한 해석이 필요할 것으로 판단된다. 생존율에서는 HE와 LF 첨가구에서 대조구보다 높은 경향을 보였고, HE 첨가구에서는 100%의 생존율을 보였다. 이 결과는 자생식물 두메꿀풀에서의 항균, 항산화 효과에 기인된 것으로 사료된다.
- 05). 실험사료 내 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 모든 실험사료에서 0.2±0.03%로 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다.
- 이 연구결과를 요약하면, 사료 내 자생식물 두메꿀풀의 열수 추출액과 미생물배양액은 넙치 치어의 성장에는 영향을 미치지 않지만 비 특이적 면역반응에 효과가 있는 것으로 사료된다. 따라서 항생제를 대체하여 어류의 질병 치료제로써 사용이 가능할 것으로 판단되며, 사료첨가제로써 이용 할 수 있도록 대량 생산이 가능한 산업적인 생산 공법이 마련되어야 할 것으로 판단된다.
- 최종 사료공급 3시간 후와 24시간 후의 혈액을 채취하여 hematocrit, hemoglobin 및 NBT activity를 분석한 결과 (Table 4), 3시간 후의 혈액에서 hematocrit, hemoglobin 및 NBT activity가 24시간'후의 결과보다 높은 값을 보였다. 먹이공급 3시간 후의 혈액에서 분석한 NBT activity는 HE와 LF를 섭취한 실험구에서 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였다 (P<0.
후속연구
- 이것은 어류의 대사과정에서 먹이 섭취 후 소화과정을 거쳐 3시간 후에 영양소가 장으로부터 흡수되어 혈액으로 공급되어 각 조직과 기관으로 전달되고 24시간 후에는 다시 정상으로 돌아오는 것을 나타낸다. 따라서 생리활성 물질의 구체적인 대사과정 시간과 그 효능이 미치는 시간에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 항생제를 대체하여 어류의 질병 치료제로써 사용이 가능할 것으로 판단되며, 사료첨가제로써 이용 할 수 있도록 대량 생산이 가능한 산업적인 생산 공법이 마련되어야 할 것으로 판단된다. 또한 성장률이 다소 감소하는 경향을 보임에 따라 부작용을 고려하여 보다 장기적인 사육실험과 공격 실험, 장내 미생물 분석 등의 추가적인 실험이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 항생제를 대체하여 어류의 질병 치료제로써 사용이 가능할 것으로 판단되며, 사료첨가제로써 이용 할 수 있도록 대량 생산이 가능한 산업적인 생산 공법이 마련되어야 할 것으로 판단된다. 또한 성장률이 다소 감소하는 경향을 보임에 따라 부작용을 고려하여 보다 장기적인 사육실험과 공격 실험, 장내 미생물 분석 등의 추가적인 실험이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
- 이 연구에서도 자생식물 열수주출액의 성분 중 억제작용을 일으키는 물질이 비록 유의적인 차이는 없었지만 성장률에 영향을 끼친 것으로 사료된다. 하지만 보다 더 구체적인 메커니즘은 장기간의 성장실험과 자생식물 추출물의 성분분석을 통한 충분한 해석이 필요할 것으로 판단된다. 생존율에서는 HE와 LF 첨가구에서 대조구보다 높은 경향을 보였고, HE 첨가구에서는 100%의 생존율을 보였다.
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