Two experiments were designed to examine short-term effects of human chorionic gonadotropin (hCG), and long-term effects of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa), $17{\alpha}-hydroxyprogesterone$ (17P), and $17{\alpha},20{\beta}-dihydroxy-4-pregnen-3-one\;(17,20{\beta}P)$
Two experiments were designed to examine short-term effects of human chorionic gonadotropin (hCG), and long-term effects of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa), $17{\alpha}-hydroxyprogesterone$ (17P), and $17{\alpha},20{\beta}-dihydroxy-4-pregnen-3-one\;(17,20{\beta}P)$, alone or in combination, on milt production of the starry flounder Platichthys stellatus. In the first experiment, fish were injected with either 200 IU hCG/kg body weight or the same volume of marine fish Ringer's solution (MFRS). In the second experiment, each fish was implanted with a blank cholesterol pellet (control), $200\;{\mu}g$ GnRHa, $500\;{\mu}g$ 17P, or $100\;{\mu}g\;17,20{\beta}P/kg$ body weight alone or in combination. In the first experiment, hCG injection resulted in an increase in the expressible milt volume and a decrease in the spermatocrit (Sct). After pellet implantation in the second experiment, the milt volume was increased in males treated with GnRHa, GnRHa+17P, or $GnRHa+17,20{\beta}P$. On day 7 after hormone pellet implantation, the milt volume began to increase, and on day 14, the milt volume in the $GnRHa+500\;{\mu}g$ 17P group was significantly higher than that in the control group. Compared with the control group, the hormone pellet-treated groups had a significant reduction in the mean Sct and sperm concentration (Sc) at day 7 after pellet implantation, while there were no differences in total sperm number. The results suggest that increases in milt volume are generally associated with decreases in Sct and SC, suggesting that the main mechanism for the increase in milt volume was milt hydration.
Two experiments were designed to examine short-term effects of human chorionic gonadotropin (hCG), and long-term effects of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa), $17{\alpha}-hydroxyprogesterone$ (17P), and $17{\alpha},20{\beta}-dihydroxy-4-pregnen-3-one\;(17,20{\beta}P)$, alone or in combination, on milt production of the starry flounder Platichthys stellatus. In the first experiment, fish were injected with either 200 IU hCG/kg body weight or the same volume of marine fish Ringer's solution (MFRS). In the second experiment, each fish was implanted with a blank cholesterol pellet (control), $200\;{\mu}g$ GnRHa, $500\;{\mu}g$ 17P, or $100\;{\mu}g\;17,20{\beta}P/kg$ body weight alone or in combination. In the first experiment, hCG injection resulted in an increase in the expressible milt volume and a decrease in the spermatocrit (Sct). After pellet implantation in the second experiment, the milt volume was increased in males treated with GnRHa, GnRHa+17P, or $GnRHa+17,20{\beta}P$. On day 7 after hormone pellet implantation, the milt volume began to increase, and on day 14, the milt volume in the $GnRHa+500\;{\mu}g$ 17P group was significantly higher than that in the control group. Compared with the control group, the hormone pellet-treated groups had a significant reduction in the mean Sct and sperm concentration (Sc) at day 7 after pellet implantation, while there were no differences in total sperm number. The results suggest that increases in milt volume are generally associated with decreases in Sct and SC, suggesting that the main mechanism for the increase in milt volume was milt hydration.
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문제 정의
이 연구는 우리나라 동해 중부해역에 분포하며 새로운 양식대상 종으로 주목받고 있는 강도다리 (Platichthys stellatus)를대상으로 현재 양식 어류의 배란을 유도하기 위하여 가장 많이 이용하고 있는 human chorionic gonadotropin (hCG) 의주사에 의한 단기적인 정액증산효과를 조사하였다. 또한 GnRHa 와 Y1 a -hydroxyprogesterone (17P) 및 17, 206P 의 혼합펠렛이 정액량 증가와 수화현상에 미치는 장기적인 영향을 함께 조사하였다.
제안 방법
두 번째 실험은 산란기의 후반에 Gn呱Ha와 함께 17P 및 17, 20硏>가 배정에 미치는 장기영향을 파악하기 위하여 각 호르몬의 펠렛이나 혼합 펠렛을 등 근육에 삽입하였다. 실험구들은 호르몬이 함유되지 않은 대조구 펠렛을 투여한실험구 (control)와 어체중 1 kg당 GnRHa 200 建 펠렛을 투여한 실험구 (GnMa), 17P 500 建 펠렛을 투여한 실험구 (17P), 17, 20BP 100 建 펠렛을 투여한 실험구 (17, 206P), GnRHa 200 建+17P 500 “g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17P) 및 GnRHa 200 〃g+17, 20BP 100 "g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17, 20/?P) 등 6개로 설정되었다. 각 실험구는 6마리의 수컷으로 구성되었고, 정액은 7일 간격으로 28일간 채취하였으며 1차 실험과 같이 Mv, Sc, Set 및 TSN를 측정하였다.
Human chorionic GtH (hCG; Sigma, USA)는 해산 어류용생 리식 염수에 희 석하여 사용하였으며 , GnRHa (des-Gly10[D-Ala6]-luteinising hormone releasing hormone ethylamide; Sigma, USA) 펠렛은 Lee et al. (1986)의 방법을 변형하여 제작하였다. 첫 번째 실험은 산란기 초기에 hCG의 단기효과를 조사하기위하여 12마리씩 두 그룹으로 나누어 어체중 1kg당 200 IU 농도의 hCG와 같은 양의 생 리식염수를 등 근육에 주사한후 2일째와 5일째 채취 된 정 액 량 (milt volume: Mv)과 Sc, Set 및 총 정자수 (total sperm number: TSN)를 측정하였다.
실험구들은 호르몬이 함유되지 않은 대조구 펠렛을 투여한실험구 (control)와 어체중 1 kg당 GnRHa 200 建 펠렛을 투여한 실험구 (GnMa), 17P 500 建 펠렛을 투여한 실험구 (17P), 17, 20BP 100 建 펠렛을 투여한 실험구 (17, 206P), GnRHa 200 建+17P 500 “g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17P) 및 GnRHa 200 〃g+17, 20BP 100 "g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17, 20/?P) 등 6개로 설정되었다. 각 실험구는 6마리의 수컷으로 구성되었고, 정액은 7일 간격으로 28일간 채취하였으며 1차 실험과 같이 Mv, Sc, Set 및 TSN를 측정하였다. 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균士표준오차로 표시하였으며, 측정값들 사이의 유의 차 유무는 SPSS -통계 패키지(version 11.
각 희석액에서 측정은 두 개의 tube를 사용하여 두 번 반복하였고, data 분석에는 평균 결과를사용하였다. 두 번째 실험은 산란기의 후반에 Gn呱Ha와 함께 17P 및 17, 20硏>가 배정에 미치는 장기영향을 파악하기 위하여 각 호르몬의 펠렛이나 혼합 펠렛을 등 근육에 삽입하였다. 실험구들은 호르몬이 함유되지 않은 대조구 펠렛을 투여한실험구 (control)와 어체중 1 kg당 GnRHa 200 建 펠렛을 투여한 실험구 (GnMa), 17P 500 建 펠렛을 투여한 실험구 (17P), 17, 20BP 100 建 펠렛을 투여한 실험구 (17, 206P), GnRHa 200 建+17P 500 “g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17P) 및 GnRHa 200 〃g+17, 20BP 100 "g 펠렛을 투여한 실험구 (GnRHa+17, 20/?P) 등 6개로 설정되었다.
또한 GnRHa 와 Y1 a -hydroxyprogesterone (17P) 및 17, 206P 의 혼합펠렛이 정액량 증가와 수화현상에 미치는 장기적인 영향을 함께 조사하였다.
4 g)를 사용하였으며, 실험 전 모든 어류들은 등 근육에 PIT tag (Identification Devices, USA)를 삽입하여 각 개체를 구별할 수 있도록 하였다. 실험어를 2톤 용량의원형 FRP수조에 수용하여 자연 수온과 광주기 조건 아래에서 사육하였으며 , 시 판되는 넙 치 용 배 합사료 (수협사료, 한국)가 1일 1회 매일 오전 10시에 공급되었다. 해수나 배설물에 의해 오염되지 않게 정액을 채취하기 위하여 실험어들을 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Sigma, USA) 200 ppm에 마취시킨 다음, 복부를 부드럽게 압박하여 정액을 채취하였고, 정액의 특성을 조사하기 전까지 0℃에서 냉장보관 하였다.
Video-timer는 정자의 희석과 함께 동시에 시작하였고, 정자 운동은 운동이 종료할 때까지 녹화하였다. 인공해수로희석 후 5초의 연속된 video ftame 아래에서 정자 머리가 앞쪽으로 운동할 때의 정자를 운동하는 것으로 간주하였다. 운동성은 각 측정마다 무작위로 선택한 최소 50개의 정자들을평가하는 것으로 결정하였다.
첫 번째 실험은 산란기 초기에 hCG의 단기효과를 조사하기위하여 12마리씩 두 그룹으로 나누어 어체중 1kg당 200 IU 농도의 hCG와 같은 양의 생 리식염수를 등 근육에 주사한후 2일째와 5일째 채취 된 정 액 량 (milt volume: Mv)과 Sc, Set 및 총 정자수 (total sperm number: TSN)를 측정하였다. 정 자의활성을 즉정하는 요인으로는 Striissmann et al. (1994)의 방법을 변형하여 정자활성지수 (sperm activity index: SAI), 움직 이는 정자의 비 율 (percentage of motile sperm, PMS) 및 운동하는정자의 속도 (swimming speed: SS)를 계산하였다. 정자의 활성을 평가하기 위하여 채취된 정액을 인공해수에 희석하여 관찰용 슬라이드글라스 (Teflon Printed Glass Slide; 21 wells; 4 mm diameter of each well; Funakoshi Co.
해수나 배설물에 의해 오염되지 않게 정액을 채취하기 위하여 실험어들을 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Sigma, USA) 200 ppm에 마취시킨 다음, 복부를 부드럽게 압박하여 정액을 채취하였고, 정액의 특성을 조사하기 전까지 0℃에서 냉장보관 하였다. 정자농도 (sperm concentration: Sc)는 2% eosin 용액으로 염색한 후 광학현미경 아래에서 혈구계산판을 이용하여 계수하였고, spermatocrit (Set)는 일반적인 혈액분석 방법인 microhematocrit법을 변형하여 측정하였다.
(1994)의 방법을 변형하여 정자활성지수 (sperm activity index: SAI), 움직 이는 정자의 비 율 (percentage of motile sperm, PMS) 및 운동하는정자의 속도 (swimming speed: SS)를 계산하였다. 정자의 활성을 평가하기 위하여 채취된 정액을 인공해수에 희석하여 관찰용 슬라이드글라스 (Teflon Printed Glass Slide; 21 wells; 4 mm diameter of each well; Funakoshi Co., Japan) 위에 활성화된 정자를 즉시 옮기고, cover slip 없이 운동을 관찰하였다. 운동은 현미경 (Zeiss, Germany)에 부착되어 있는 video camera와 video-timer가 있는 VHS video-recorder로 기록하였다.
(1986)의 방법을 변형하여 제작하였다. 첫 번째 실험은 산란기 초기에 hCG의 단기효과를 조사하기위하여 12마리씩 두 그룹으로 나누어 어체중 1kg당 200 IU 농도의 hCG와 같은 양의 생 리식염수를 등 근육에 주사한후 2일째와 5일째 채취 된 정 액 량 (milt volume: Mv)과 Sc, Set 및 총 정자수 (total sperm number: TSN)를 측정하였다. 정 자의활성을 즉정하는 요인으로는 Striissmann et al.
실험어를 2톤 용량의원형 FRP수조에 수용하여 자연 수온과 광주기 조건 아래에서 사육하였으며 , 시 판되는 넙 치 용 배 합사료 (수협사료, 한국)가 1일 1회 매일 오전 10시에 공급되었다. 해수나 배설물에 의해 오염되지 않게 정액을 채취하기 위하여 실험어들을 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Sigma, USA) 200 ppm에 마취시킨 다음, 복부를 부드럽게 압박하여 정액을 채취하였고, 정액의 특성을 조사하기 전까지 0℃에서 냉장보관 하였다. 정자농도 (sperm concentration: Sc)는 2% eosin 용액으로 염색한 후 광학현미경 아래에서 혈구계산판을 이용하여 계수하였고, spermatocrit (Set)는 일반적인 혈액분석 방법인 microhematocrit법을 변형하여 측정하였다.
대상 데이터
실험 어류는 국립수산과학원 동해 특성화 연구센터와 양식관리팀의 사육실에서 사육중인 수컷 어미 60마리 (전장 29.1±0.6 cm, 체중 643.0±24.4 g)를 사용하였으며, 실험 전 모든 어류들은 등 근육에 PIT tag (Identification Devices, USA)를 삽입하여 각 개체를 구별할 수 있도록 하였다. 실험어를 2톤 용량의원형 FRP수조에 수용하여 자연 수온과 광주기 조건 아래에서 사육하였으며 , 시 판되는 넙 치 용 배 합사료 (수협사료, 한국)가 1일 1회 매일 오전 10시에 공급되었다.
, Japan) 위에 활성화된 정자를 즉시 옮기고, cover slip 없이 운동을 관찰하였다. 운동은 현미경 (Zeiss, Germany)에 부착되어 있는 video camera와 video-timer가 있는 VHS video-recorder로 기록하였다. Video-timer는 정자의 희석과 함께 동시에 시작하였고, 정자 운동은 운동이 종료할 때까지 녹화하였다.
데이터처리
각 실험구는 6마리의 수컷으로 구성되었고, 정액은 7일 간격으로 28일간 채취하였으며 1차 실험과 같이 Mv, Sc, Set 및 TSN를 측정하였다. 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균士표준오차로 표시하였으며, 측정값들 사이의 유의 차 유무는 SPSS -통계 패키지(version 11.5)를 사용하여 95%의 신뢰수준에서 /-test 와 ANOVA 및 Tukey's multiple range test로 검정하였다.
운동성은 각 측정마다 무작위로 선택한 최소 50개의 정자들을평가하는 것으로 결정하였다. 각 희석액에서 측정은 두 개의 tube를 사용하여 두 번 반복하였고, data 분석에는 평균 결과를사용하였다. 두 번째 실험은 산란기의 후반에 Gn呱Ha와 함께 17P 및 17, 20硏>가 배정에 미치는 장기영향을 파악하기 위하여 각 호르몬의 펠렛이나 혼합 펠렛을 등 근육에 삽입하였다.
성능/효과
05). 14일째도 GnRHa 단독 처리구와 GnRHa와 17P의 혼합 처리구가 대조구보다 Mv가 많게나타났으나, GnRHa+17P 실험구만이 대조구보다 유의하게높은 값을 보였다(PV0.05). 그러나 TSN의 경우 전 실험기간동안 실험구들 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다 (P> 0.
05). Set는 48시 간과 120 시간 모두에서 hCG를 주사한 실험구에서 대조구보다 유의하게 낮은 값을 보였으며, Sc도 Set와 같은 경향이었지만 hCG를 주사한 그룹과 대조구 사이에서 유의한 차이는 찾아 볼 수 없었다. TSN의 경우도 정액량과 같이 hCG를 주사한 실험 구가 대조 구보다 많았으나 유의한 차이는 없었다 (P>0.
05). hCG 주사 후 정자 운동성의 변화를 조사한 결과, hCG를 주사한 어류에서 얻은 정자의 SAI와 PMS 및 SS는 각각 2.0±0.2, 38.1±7.5%, 126.3±7.3 〃m/sec로 대조구의 1.9±0.3, 20.0±3.6%, 114.4±9.4〃m/sec와 유의한 차이가 없었다 (P> 0.05) (Table 1)..
그러나 그 실험의 결과는 호르몬 처리가 정자의 활성에 긍정적인 영향을미친다는 명확한 증거를 제시하지 못했다. 따라서 이번 연구에서 외인성 호르몬 처리가 정자의 활성에 미치는 영향을파악한 결과 정액량과 Set의 유의적인 변화에도 불구하고 정자의 활성은 변화가 없었다. 저자 등은 이미 greenback flounder (Rhombosolea tapirina) (Lim et al.
이러한 차이는 산란시기의 차이, 정액 채취빈도, 호르몬 처리방법의 차이 또는 종 특이성 등에의 해 유발될 수 있지만 아직까지 그 원인은 명확하지 않다. 본 연구에서도 산란기 초기에 hCG를 주사한 경우와 후반에 GnRHa 펠렛을 처리한 경우 정액 증산 효과에서 차이를 보였다. Clearwater and Crim (1998)은 yellowtail flounder에서 GnRHa 처리는 정자 운동성과 정장의 pH를 증가시킨다고 하였고, Lahnsteiner et al.
그러나 강도다리에 대한 GtH의 주사효과나 정액의 수화현상에 영향을 미치는 progestin이나 그 전구체에 대한 효과는 아직 알려져 있지 않다. 이 연구에서 hCG를 주사한 실험어와 GnRHa 펠렛을 이식한 실험어 모두에서 정액량이 증가하였고, Set는 감소하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 이미이 전의 연구 (Lim et al.
호르몬 펠렛 이식 후 Set와 Sc는 호르몬 처리 실험구들에서 낮아지는 경향을 보였다. 호르몬 처리 후 7일째 모든 호르몬처리구는 대조구와 비교하여 유의하게 Set가 낮아졌으며, Sc 도 17, 203P 100z/g 펠렛을 투여한 실험구를 제외하고 다른실험구들은 대조구보다 낮아졌다(PV0.05). 그러나 Set는 21 일째부터 실험구 사이에 유의한 차이가 나타나지 않았으며, Sc는 14일째부터 대조구와 호르몬 처리구 사이에서 유의한차이가 없었다 (P>0.
. 호르몬 펠렛을 등 근육에 삽입하여 28일간 정액 증산 효과를 관찰한 결과, 7일째 어체중 1 kg 당 GnRHa 200 zzg+17P 500 建 펠렛을 투여한 시험구의 Mv가 가장 많았으며, 다음이 GnRHa 단독 처리구였고, 세 번째가 GnRHa와 17, 20£P의 혼합 처리 실험구였다. 그러나 대조구와는 유의한 차이를 보이지 않았다(P느0.
후속연구
, 2004), in vitro 실험 에서도 배 양액 1 mL당 100 以g 17P와 100IU hCG에 정소 조직을 배양한 경우 17, 2第P 농도가 유의하게 증가하였다 (unpublished data). 따라서 강도다리 에서 도배 정유 도와 정액량 조절에 대한 17, 2%P의 역할을 명확히 구명하기 위하여 차후 전 산란기간 동안 체계적인 연구가 요구된다.
참고문헌 (27)
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