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문제 정의
- 본고에서는 초고압 추출 공정을 통한 홍경천의 독성 저감 및 항암활성 효과를 일아보기 위하여 실험을 실시하였는데 그 결과는 아래와 같다.
- 본 연구에서는 최근 국내 식 . 의약품 산업에서 이용하고 있는 초고압 추출 기술을 이용하여 추출한 홍경천의 추출물을 이용하여 독성 저감 효과를 탐색하고, 기존의 일반추출을 통한 추출물과의 항암활성 비교를 통하여 활성 증진의 정도를 알아보는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 4. Inhibition ratio of growth AGS (bar chart, %) and selectivity (line chart) in adding the crude extracts of R. sachalinensis (WE water extract at 60℃, control, UE: ultrasonification treated for 30 minutes at 60℃ with water solvent, HPE5: holding high pressure for 5 minutes after ultrasonification process for 30 minutes at 60℃ with water solvent, HPE15: holding high pressure for 30 minutes after ultrasonification process for 30 minutes at 60℃ with water solvent).
- Selecivity 측정은 SRB assay를 이용하여 정상세포 (HEK293, HEL299)에 대한 각 sample 농도에서 세포 독성을 측정하고, SRB assay를 이용하여 각 암세포주의 생육 억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
- 대조군으로 사용된 일반적인 추출 방법은 100g의 홍경천을 수직 환류냉각기가 부착된 추출 flask에 각각 10배의 증류수를 사용하여 60℃에서 12시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감암여과장치로 여과하여 농축 .
- 실험 대상 세포의 농도를 4-5 X 104 cellsM 으로 96 well plate의 각 well에 100ul씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37℃ 5% CO, 한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 l.Omg/ml로 100ul씩 첨가하여 48시간 배양하였다.
- 실험에 사용된 sample 농도는 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 mg/ml로 조절하여 정상세포에 대한 세포독성을 검토하였다. Fig.
- 초고압 처리 후 세포조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 저진공주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron, x400)은 일본의 Hitachi Science systems의 S-3500N으로 촬영하여 홍경천의 표면을 관찰하였다.
- 초고압 추출 후 조직 파괴의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 저진공주사현미경을 이용하여 홍경천 표면을 400배로 확대하여 관찰하였다 (Fig. 5). (A)는 60℃ 물에서 추출 후 초음파 처리한 것으로 홍경천의 조직 표면이 비교적 대부분이 파괴되지 않고 정상 상태의 형태를 유지하고 있는 반면 초고압으로 각각 5분, 15분 처리한 (B)와 (C)는 홍경천 조직 표면이 다 파괴되어 일반 추출을 실시한 것과 비교하면 극명한 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.
- 초고압 추출은 홍경천 100g을 비닐 팩에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Korea)를 이용하여 500Mpa의 압력으로 각각 5, 15분간 초고압 추출을 실행하였다. 초고압 추출이 끝난 홍경천을 수직환류냉각기가 부착된 추출 flask에 각각 10배의 증류수를 사용하여 60℃에서 12시간 2회 반복 추출한 후 초음파 추출공정을 30분 동안 병행 추출 하였다.
- 5, 15분간 초고압 추출을 실행하였다. 초고압 추출이 끝난 홍경천을 수직환류냉각기가 부착된 추출 flask에 각각 10배의 증류수를 사용하여 60℃에서 12시간 2회 반복 추출한 후 초음파 추출공정을 30분 동안 병행 추출 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 홍경천 (Rhodiola sachlinensis A. Bor) 은 2004년 10월 백두산에서 채취한 뿌리를 수입하여 실험에 사용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Alpha minimum essential medium (a-MEM)은 GIBCO (USA)로부터 구입하였고, Hepes buffer는 SIGMA (USA)에서 구입하였다. 혈청은 GIBCO (USA)사의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다.
- 실험에 이용된 세포주는 암세포로 인간 위암세포인 AGS (stomach adenocarcinoma, human), 인간 폐암세포인 A549 (lung adenocarcinoma, human), 인간 유방암세포인 MCF-7 (breast adenocarcinoma, human), 인간 간암세포인 Hep3B (liver adenocarcinoma, human)을 사용하였고 홍경천 추출물에 대하여 SRB assay를 측정하여 다음과 같은 실험결과를 얻었다.
- 실험에 이용된 세포주는 임세포로 인간 폐암세포인 A549 (lung adenocarcinoma, human, ATTC, USA), 인간 위암 세포인 AGS (stomach adenocarcinoma, human, ATTC, USA), 인간 유방암세포인 MCF-7 (breast adenocarcinoma, human, ATTC, USA), 인간 간암세포인 Hep3B (liver adenocarcinoma, human, ATTC, USA)를 사용하였고, 시료 자체의 세포 독성을 알아보기 위한 정상세포로는 인간 정상 신장세포인 HEK293 (Human embryonic kidney, ATTC, USA) 와 인간 정상 폐세포인 HEL299 (Human lung, ATTC, USA)를 사용하였다.
- 항암활성 측정은 A549, AGS, MCF-7, Hep3B의 암세포를 실험에 사용하여 실시하였다. 모든 암세포에서 L0mg/mC의 농도에서 75% 이상의 높은 억제활성을 보였고, 또한 암세포의 생육 활성에 대한 정상 세포의 세포독성의 비로 나타낸 선택적 사멸 도는 0.
- 혈청은 GIBCO (USA)사의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다.
데이터처리
- 흥경천 추출물에 대한 독성 및 항암활성의 실험결과는 triplicate determinations0]] 의한 Mean ± SD로 표시했으며 각 평균치 간의 차이는 anova test에 의해 p 0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 5). (A)는 60℃ 물에서 추출 후 초음파 처리한 것으로 홍경천의 조직 표면이 비교적 대부분이 파괴되지 않고 정상 상태의 형태를 유지하고 있는 반면 초고압으로 각각 5분, 15분 처리한 (B)와 (C)는 홍경천 조직 표면이 다 파괴되어 일반 추출을 실시한 것과 비교하면 극명한 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 기존의 초음파를 이용한 추출 방법은 탈기현상을 통해 용출량이 많아지기는 했지만 조직에는 영향을 주지 못한 반면에 초고압 추출을 실시한 (B), (C)에서는 겉으로 보여 지는 표면 조직뿐만 아니라 내부 조직까지 모두 영향을 받아 유용물질의 용출량 증가와 신물질 용출을 통해 수율이 증가한 것으로 보인다.
- 사멸도를 나타낸 것이다. A549와 AGS와 마찬가지로 각 시료에 대해 농도 의존적으로 증가하였으며, MCF-7과 Hep3B 는 1 mg/M 의 농도에서 HPE15가 각각 75.8%, 76.6%로 가장 높은 활성을 나타냈다. 선택적 사멸도는 0.
- 92배 정도 증가한 것으로 나타났다. 또한 초고압을 5분 실시한 것도 1.83배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이것은 뿌리식물인 홍경천은 섬유질이 많아 기존의 추출 방법으로는 용출되어지지 않았던 것들이 초고압 처리를 통해 조직과 세포막의 변형으로 인해 용매들이 세포 안으로 쉽게 들어감으로서 기존 물질들의 용출량 증가하고 새로운 물질이 용출되어 수율이 높게 나타난 것으로 보인다.
- 사용하여 실시하였다. 모든 암세포에서 L0mg/mC의 농도에서 75% 이상의 높은 억제활성을 보였고, 또한 암세포의 생육 활성에 대한 정상 세포의 세포독성의 비로 나타낸 선택적 사멸 도는 0.6mgyme에서 가장 높은 수치를 보였는데 모두 4 이상으로 나타났으며, 15분 동안 초고압 추출을 한 것이 가장 높게 나타났다.
- 홍경천의 주줄 수율은 Table 1과 같다. 모든 조건 중 초고압 추출을 15분간 실시하였을 때 가장 높은 추출량을 보였다.
- 2는 인간 정상폐세포인 HEL299에 대한 세포독성을 나타낸 것이다. 모든 추출물 중 HEK293과 마찬가지로 HPE15 가 1.0 mg/mC 의 농도에서 21.6%로 가장 낮은 세포독성을 나타냈으며, WE가 26.3%로 가장 높은 독성을 나타내었다.
- 본 실험결과를 통하여 초고압으로 인해 기존의 추출 방법으로는 추출되지 않았던 유용생리활성 물질들이 초고압으로 인해 조직과 세포막 파괴로 인해용출량 증가로 인해 수율이 증가하였으며, 홍경천의 독성 물질이 파괴되는 것으로 판단된다. 단순한 침전 추출법에 의한 추출방법보다는 초고압 추출에 의한 추출로 식물체에 함유되어 있는 성분 추출의 수율을 배가 시킬 수 있으며, 홍경천 자체 성분에 약간의 변화를 가할 수 있을 것으로 생각된다.
- 억제활성의 경우 대부분의 시료에서 농도 의존적으로 증가하였으며 HPE15에서 가장 높은 억제 활 성을 보였다. 선택적 사멸도는 모든 추출물에서 1~5의범위 중 0.6mg/ml에서 4.97로 암세포에 대한 가장 높은 선택적 사멸 도를 보였다.
- 1%로 가장 높은 억제활성을 보였다. 선택적 사멸도는 모든 추출물에서 1~6의 범위 중, 0.6mg/ml의 농도에서 5.23으로 암세포에 대한 가장 높은 선택적 사멸도를 보였다.
- 위의 결과를 통해 초고압과 초음파 처리를 병행하여 실시할 경우 일반 추출물보다 세포독성이 낮아지는 효과를 확인할 수 있다. 이것은 홍경천의 독성을 갖는 물질이 초고압으로 인해 변성되거나 파괴되어 홍경천의 독성이 낮아지는 데 영향을 미친 것으로 보이며, 초음파 처리는 탈기 현상을 통해 단순히 활성 물질의 용출량이 늘어나는 것에는 영향을 미치나 독성 물질의 파괴나 변성에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
- 인간의 정상 신장세포인 HEK293을 이용한 세포 독성은 초고압으로 15분간 처리한 것에서는 LOmg/mC의 농도에서 최고 20.4%의 세포독성을 보였으며, 초고압으로 5분간 처리한 것은 22.5%로 초고압 시간이 길어질수록 세포독성이 낮아지는 것을 확인했다. 일반 추출물은 25.
- 5%로 초고압 시간이 길어질수록 세포독성이 낮아지는 것을 확인했다. 일반 추출물은 25.3%로 초고압 처리한 군에 비해 높은 독성을 나타내어 초고압 처리 시 독성이 저감되는 것을 확인하였다. 초고압 처리 군은 또한 HEL299를 이용한 세포독성 실험에서도 l.
- 추출수율은 초고압으로 15분간 추출한 것이 일반 60℃의 물에서 추출한 것에 비해 약 1.92배 정도 증가한 것으로 나타났다. 또한 초고압을 5분 실시한 것도 1.
- 항암활성 실험 시 초고압과 초음파 처리를 실시한 것이 처리하지 않은 기존의 일반 추출에 비해 7% 이상의 높은 항암 활성을 보였다. 이것은 초고압 처리로 유용물질의 용출량 증가와 신물질의 용출을 통한 암세포의 생육 억제율 증가의 결과를 가져온 것으로 생각된다.
후속연구
- 또한 홍경천의 독성물질의 파괴나 변성을 통해 독성 저감에도 영향을 미친 것으로 보인다. 따라서 본 연구를 통해 초고압 추출을 통해 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 앞으로 활성 증진의 원인을 찾기 위해 성분분석 등의 연구가 진행되어야 할 것이다.
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