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문제 정의
- 본 연구에서는 UVB 조사후 fisetin의 처리가 p53의 감소와 PCNA의 증가에 기여함을 제시하였다. 특히 p53의 감소는 통계적 유의성을 충분히 확보함으로써 fisetin이 DNA 상해의 수준을 감소시켜 p53 이 요구되는 세포고사 과정을 감소시켰음을 시사한다.
- 본 연구에서는 UVB에 조사된 NIH3T3 세포에서 세포 고사와 DNA 단사절단에 미치는 fisetin 후처리의 효과에 대해서 연구하였다. 세포에 UVB (200 J/m2)* 조사하고 정상 배지에서 48시간 배양한 세포의 세포고사에 수반되는 핵 분절은 50% 정도의 세포에서 관찰되었다.
- 규명된 fisetin이 선정되었다. 본 연구에서는 섬유아세포인 NIH3T3 세포에서 fisetin이 UVB에 의한 세포고사 과정 중 나타나는 핵분절과 DNA 상해를 회복하는 과정 중 나타나는 DNA사의 절단에 어떠한 효과가 있는지를 세포 고사 경로에 관련된 p53 단백질과 세포주기를 진행하는데 연관된 PCNA 단백질의 수준들의 변화와 관련하여 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 첨가하였다. DAPI를 첨가한 후 실온에서 2Q분간염색한 후에 핵의 분절 정도를 형광현미경(Zeiss Axioskop 2 Plus)을 사용하여 관찰하였다. 전체 세포 중 세포고사에 의한 핵의 분절을 보이는 세포의 빈도를 구하여 그래프로 제시하였다.
- UVB에 의한 DNA 상해를 회복하는 과정중의 DNA 단사 절단의 양적 변화는 그 시간동안 남아 있는 DNA 상해의 수준과 상관성을 보인다. DNA 단사절단을 측정하기 위해 알칼리에 노출된 상태로 전기영동(Fig. 2A)한 후 각 밴드의 DNA 크기 분포의 평균치를 구하고 정상 대조군에 대한 상대치를 구하여 도식화하였다(Fig. 2B). Fisetin 자체로도 어느 정도의 DNA 사 절단이 유발되는 효과가 관찰되었으나 자외선 조사후 정상 배지에서 48 시간 배양한 세포는 정상 대조군에 비해 약 10% 이하로 DNA 크기가 감소됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- UVB에 의한 세포고사가 진행될 때 나타나는 핵의 분절현상을 관찰할 수 있는 DAPI 염색 분석을 수행하였다(Fig. 1). 세포에 UVB를 조사한 후 48 시간동안 배양 배지에서만 배양한 세포(Fig.
- UVB에 의해 유도되는 세포고사에 깊은 관련이 있는 것으로 알려진 p53 단백질의 발현이 fisetin에 의해 어떠한 변화를 보이는지 관찰하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다 (Fig. 3). 세포에 fisetin을 농도별(0, 50, 100, 300 μM)로 첨가하여 48 시간 반응시킨 세포(Fig.
- 이차항체를 1% 탈지유가 들어있는 TBS buffer에 1:2,000으로 희석한 용액을 처리하여 실온에서 30 분간 서서히 흔들어준 후 TBST buffer에서 20 분간 세척하였다. WEST-ZOL™ puls (iNtRON biotechnology), substrate solution : enhancer siolution (1:1) 에서 1분간 반응시킨 후 암실에서 Hyper film (Amersham)을 얹어 3분에서 10분간 노출시킨 후 현상하였다. 현상 후 densitometer에 의해 스캔하여 밴드들의 양적 수준을 측정하고, 각 실험군에서 거의 일정하게 나타나는 beta actin의 수준(결과의 그림에서 생략함)에 대한 상대값들을 각각 구한 후, 이 값들을 대조군에 대한 상대적인 수준으로 변환하여 그래프로 제시하였다.
- 본 연구에서는 UVB에 의한 세포고사뿐 아니라 DNA 회복의 정도를 반영하는 DNA 단사절단과 DNA 상해 반응에 민감한 p53 및 PCNA 단백질의 수준들과 연관하여 실험을 수행하였다.
- 회복과정 중 절제 단계 에서 나타나는 DNA 단사 절단 경향을 알아보고자 Sawyer 등의 방법[21]에 의한 알칼리 겔 전기영동을 수행하였다. 세포를 35 mm 배양접시에 동일 양을 분주하여 하루를 배양하고 UVB (200 J/n?)를처리한 후 다양한 농도의 fisetin을 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 모은 세포에 1% agarose (Sigma) 15 u1를 넣어 button을 만든 후 lysis buffer I (2.
- 세포주기의 진행에 관련되는 PCNA 단백질의 발현이 자외선에 의해 어느 정도 감소되고 이것이 fisetin 후처리에 의해 어느 정도 방어되는지 관찰하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다(Fig. 4). 세포에 fisetin 자체만을 48 시간 처리한 그룹 (Fig.
- 이는 UVB에의 한 세포고사를 fisetin이 저해하고 세포의 생존을 보호해주는 효과가 있음을 시사한다. 이러한 fisetin에 의한 세포 고사로부터의 보호효과는 fisetin이 DNA 회복에 관여하여 DNA 상해의 잔존 수준을 낮추는 효과가 있음이 추론되었고, 따라서 DNA 단사 절단 분석을 수행하게 되었다. 분석 결과 자외선 조사후 fisetin 처리는 정상배지 배양과 비교하여 DNA 크기의 평균값을 증가시키는데 공헌함을 알 수 있었는데(Fig.
- 자외선을 조사하거나 조사하지 않은 세포들을 대상으로 fisetin (Sigma)을 적정시간 처리한 후 세포를 모은 다음 phosphate buffered saline (PBS) 200 u1로 희석한 후 DAPI (Sigma)를 첨가하였다. DAPI를 첨가한 후 실온에서 2Q분간염색한 후에 핵의 분절 정도를 형광현미경(Zeiss Axioskop 2 Plus)을 사용하여 관찰하였다.
- 전기영동 (15 V/cmz 40-50 mA, 18 시간)을 실시한 후 바hidium bromide 로 염색하여 UV하에 관찰하였다. 전기 영동한 밴드들의 역상 필름을 densitometer스캔하여 각 레인의 밴드들이 보이는 DNA 단사의 평균 크기를 구하고 이의 상대적인 수치들을 그래프로 표시하였다.
- 4% agarose gel (gel buffer: 50 mM NaClz 4 mM EDTA)에 button을 넣고 4℃에서 12 시간 방치하였다. 전기영동 (15 V/cmz 40-50 mA, 18 시간)을 실시한 후 바hidium bromide 로 염색하여 UV하에 관찰하였다. 전기 영동한 밴드들의 역상 필름을 densitometer스캔하여 각 레인의 밴드들이 보이는 DNA 단사의 평균 크기를 구하고 이의 상대적인 수치들을 그래프로 표시하였다.
- DAPI를 첨가한 후 실온에서 2Q분간염색한 후에 핵의 분절 정도를 형광현미경(Zeiss Axioskop 2 Plus)을 사용하여 관찰하였다. 전체 세포 중 세포고사에 의한 핵의 분절을 보이는 세포의 빈도를 구하여 그래프로 제시하였다.
- WEST-ZOL™ puls (iNtRON biotechnology), substrate solution : enhancer siolution (1:1) 에서 1분간 반응시킨 후 암실에서 Hyper film (Amersham)을 얹어 3분에서 10분간 노출시킨 후 현상하였다. 현상 후 densitometer에 의해 스캔하여 밴드들의 양적 수준을 측정하고, 각 실험군에서 거의 일정하게 나타나는 beta actin의 수준(결과의 그림에서 생략함)에 대한 상대값들을 각각 구한 후, 이 값들을 대조군에 대한 상대적인 수준으로 변환하여 그래프로 제시하였다. 자외선 조사 후 다양한 시간동안 정상 배지로 배양한 실험군들과 자외선 조사 후 fisetin 처리군들 간의 단백질 수준에 대한 통계적 유의성은 Student's t test 방법에 의해 결정되었다.
대상 데이터
- 본 연구자 등은 다양한 천연물 재료들을 대상으로 알킬화제 상해 반응에 대한 검색 작업을 수행하여 왔고[8, 9], 자외선 상해 반응에 대한 변화를 유발하는 물질로는 옻의 아세톤 추출물 및 이 추출물의 성분 중 하나로 본 연구팀에 의해 규명된 fisetin이 선정되었다. 본 연구에서는 섬유아세포인 NIH3T3 세포에서 fisetin이 UVB에 의한 세포고사 과정 중 나타나는 핵분절과 DNA 상해를 회복하는 과정 중 나타나는 DNA사의 절단에 어떠한 효과가 있는지를 세포 고사 경로에 관련된 p53 단백질과 세포주기를 진행하는데 연관된 PCNA 단백질의 수준들의 변화와 관련하여 규명하고자 하였다.
- 실험에 사용한 세포주는 한국세포주은행에서 분양받은 mouse 섬유아세포인 NIH3T3 세포를 이용하였고, 이 세포들은 plastic petri dish 상에서 37℃, CO2 (5%) 배양기에서 10% fetal bovine serum (GIBCO, 미국), penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 Rg/ml)이 존재하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, 미국) 조건에서 배양하였고, exponential phase의 세포들을 0.025% trypsin-EDTA를 이용하여 계대배양하였다.
데이터처리
- 현상 후 densitometer에 의해 스캔하여 밴드들의 양적 수준을 측정하고, 각 실험군에서 거의 일정하게 나타나는 beta actin의 수준(결과의 그림에서 생략함)에 대한 상대값들을 각각 구한 후, 이 값들을 대조군에 대한 상대적인 수준으로 변환하여 그래프로 제시하였다. 자외선 조사 후 다양한 시간동안 정상 배지로 배양한 실험군들과 자외선 조사 후 fisetin 처리군들 간의 단백질 수준에 대한 통계적 유의성은 Student's t test 방법에 의해 결정되었다.
이론/모형
- DNA 상해의 .회복과정 중 절제 단계 에서 나타나는 DNA 단사 절단 경향을 알아보고자 Sawyer 등의 방법[21]에 의한 알칼리 겔 전기영동을 수행하였다. 세포를 35 mm 배양접시에 동일 양을 분주하여 하루를 배양하고 UVB (200 J/n?)를처리한 후 다양한 농도의 fisetin을 처리하였다.
성능/효과
- 2B). Fisetin 자체로도 어느 정도의 DNA 사 절단이 유발되는 효과가 관찰되었으나 자외선 조사후 정상 배지에서 48 시간 배양한 세포는 정상 대조군에 비해 약 10% 이하로 DNA 크기가 감소됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2B). 흥미롭게도 자외 선 조사 후 48 시간 배 양시 fi- setin이 다양한 농도로 포함되었을 경우 자외선과 fisetin이 독립적으로 작용하여 DNA 크기를 감소할 것으로 예상하는 수준(Fig.
- UVB를 조사한 fisetini- 후처리한 세포의 세포고사 과정 중 나타나는 핵의 분절은 정상 배지로만 배양하였을 경우보다 통계적으로 유의적인 감소를 보였다(Fig. 1). 이는 UVB에의 한 세포고사를 fisetin이 저해하고 세포의 생존을 보호해주는 효과가 있음을 시사한다.
- 4A, lane 5)에서 PCNA 단백질의 발현은 현저히 감소하였는데 이는 UVB에 의한 DNA 상해의 영향으로 인해 세포 주기의 진행의 방해 및 이에 연관된 세포분열의 감소에 기인한 것으로 보인다. 그러나 세포에 UVB를 조사한 후 fisetin을 농도별(50, 100, 300 μM)로 첨가하여 48 시간 반응시킨 세포 (Fig. 4A, lanes 6-8)에서의 PCNA 단백질의 발현은 UVB를 조사한 후 배양배지만을 처리한 세포보다 발현율이 2545% 정도 증가하는 것을 보았다(Fig. 4B). 이는 UVB 조사에 의한 DNA 상해 및 이에 의한 세포고사가 fisetin의 후처리에 의해 감소되어 세포들의 생존율 증가하고 DNA 복제 및 회복과 관련된 PCNA 단백질이 활성화되었기 때문이라 생각된다.
- 1의 fisetin 0 11M)은 세포고사의 특징적인 핵의 분절이 50% 정도로 측정되었다. 그러나 자외선 조사 후 fisetin을 여러 농도(50 - 500 uM)로 첨가하여 48 시간 배 양한 세포에서는 핵의 분절이 현저히 감소되었는데 특히 100 uM fisetin 처리군에서는 핵의 분절이 10% 정도로 감소되었다 (Fig. 1의 회색 막대). Fisetin 자체로도 농도증가에 따른 핵 분절의 증가(Fig.
- 3A, lane 5)에서는 p53 단백질이 뚜렷하게 발현한 것을 볼 수 있었다. 그러나 UVB를 조사한 후 fisetin을 농도별(50, 100, 300 pM)로 첨가하여 48 시간 반응시킨 세포(Fig. 3A, lanes 6-8)에서의 p53 단백질의 발현은 UVB를 조사한 후 배양배지만을 처리한 세포보다 15-35% 정도 감소되는 것을 보였다(Fig. 3 B). 이는 fi-setinol UVB에 의한 세포고사를 저해하는 효과를 보이는 것으로 생각된다.
- 1). 세포에 UVB를 조사한 후 48 시간동안 배양 배지에서만 배양한 세포(Fig. 1의 fisetin 0 11M)은 세포고사의 특징적인 핵의 분절이 50% 정도로 측정되었다. 그러나 자외선 조사 후 fisetin을 여러 농도(50 - 500 uM)로 첨가하여 48 시간 배 양한 세포에서는 핵의 분절이 현저히 감소되었는데 특히 100 uM fisetin 처리군에서는 핵의 분절이 10% 정도로 감소되었다 (Fig.
- 4). 세포에 fisetin 자체만을 48 시간 처리한 그룹 (Fig. 4A, lanes 1-4) 에서 PCNA 단백 질의 발현을 분석한 결과, fisetin을 고농도로 처리 하였을 때는 세포 독성의 영향으로 PCNA 수준이 점차 감소함을 알 수 있었다. 한편, 세포에 UVB를 조사한 훅 배양배지만을 처리한 세포(Fig.
- 흥미롭게도 배양 배지에 fisetin이 첨가될 경우 핵분절을 보이는 세포의 빈도는 상당한 감소를 보였다. 알칼리 아가로스 겔에 의한 DNA 단 사절단 분석에서 자외선 조사 후 fisetin 처리는 정상배지 배양 시보다 단사절단의 빈도를 감소시켜 DNA 크기의 증가를 유도하였는데 이는 fisetin이 UVB에 의한 DNA 상해의 회복에 긍정적 효과를 나타냄을 시사한다. Western blot 분석에 의해 fisetine 자외선 조사에 의해 활성화되는 p53의 수준을 유의한 수준으로 감소시키며 자외선 상해의 결과 세포주기의 정지에 수반되는 PCNA의 감소 경향을 다소 완화시켰다.
- 2B). 흥미롭게도 자외 선 조사 후 48 시간 배 양시 fi- setin이 다양한 농도로 포함되었을 경우 자외선과 fisetin이 독립적으로 작용하여 DNA 크기를 감소할 것으로 예상하는 수준(Fig. 2B의 점선)보다 유의한 수준 (p < 0.05)에서 더 큰 DNA 분포를 보였다. 이는 fisetin이 자외선 조사에 의해 발생된 DNA 상해를 효과적으로 회복하도록 작용하여 그 시간에 남아있는 DNA 단사절단의 빈도를 감소시켜 DNA 크기를 증가시킨 것으로 생각할 수 있었다.
후속연구
- Fisetin의 이러한 효과가 플라보노이드 중의 하나인 silibinin에 대해 보고되었는데, silibinin이 자외선 상해시 활성화되는 p53의 수준을 증가시키고, 그로 인해 pewAFi이 활성화되며 그 p21WAFie pcNA와 DNA 합성을 저해 시켜 결국은 세포의 증식을 저해시키고 UVB에 의한 피부종양을 억제한다고 제시되었다[15]. 본 연구에서는 단지 PCNA의 약간의 증가가 관찰되는데 이는 실험의 설계와 세포 유형의 차이에서 기인될 수도 있으며 보다 구체적인 기작에 대한 연구가 필요하다.
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