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미역 추출물로부터 충치 원인균, Streptococcus mutans에 대한 항균물질의 분리 및 동정

Isolation and Identification of an Antibacterial Substance from Sea Mustard, Undaria pinnatifida, for Streptococcus mutans

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.36 no.2, 2007년, pp.149 - 154  

윤소미 (경상대학교 해양생명과학부, 해양산업연구소) ,  장준호 (일본동북대학 대학원 농학연구과) ,  이종수 (경상대학교 해양생명과학부, 해양산업연구소)

초록
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건조 미역 10.4 kg을 acetone으로 추출, 여과한 다음 액-액 분배, 각종 크로마토그라피를 통하여 충치원인균, Streptococcus mutans에 대한 항균물질의 한 성분을 분리, 정제하고(160 mg, 수율 $1.5\times10^{-3}$%) 물질을 동정한 결과는 다음과 같다. 건조 미역 30 g 상당량의 추출액을 기준으로 용매 획분별 항균활성을 조사하였을 때, $CHCl_3$층이 73.2%로 가장 강하였고, hexane층이 62.0%이었으며, BuOH층이나 물층은 거의 없었다. 알루미나 칼럼에서는 산성 획분인 1% $NH_4OH:MeOH(1:1)$용매 획분이 81.0%의 항균활성을 나타내었으며, 실리카 칼럼에서는 $CHCl_3:MeOH(95:5)$용매에서 가장 높은 95.5%의 항균성을 나타내었고, ODS칼럼에서는 85% MeOH에서 96.4%의 항균성을 나타내었다. 최종적으로 ODS칼럼에서 95% MeOH를 이동상으로 하여 3개의 물질 S1(10 mg), S2(90 mg), S3(60 mg)을 분리 정제하였다. TLC에서 각 성분은 동일한 Rf값 0.42를 나타내어 동일한 물질로 추정되었으며, 이들을 메칠 유도체화한 성분들은 Rf값이 0.95로 바뀌어 이들 물질이 carboxyl기를 가지는 지방산으로 추정되었다. GC분석에서 표품 지방산과 비교한 결과, 이들은 $C_{18:4,n-3}$ 지방산과 retention time이 일치하였다. 또한, 메칠 유도체의 mass spectrum 분석 결과, m/z 290에 분자 이온 peak가 관측되어 $C_{18:4,n-3}$ 지방산의 methyl 유도체의 분자량과 일치하여, 이 물질을 3,6,9,12-octadecatetraenoic acid(stearidonic acid, $C_{18:4,n-3}$) 지방산으로 동정하였다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

An antibacterial substance to the Streptococcus mutans, a causative bacterium for decayed teeth, was isolated from the dried sea mustard, Undaria pinnatifida, and identified by GC and GC/MS. Acetone extract from the sea mustard (10.4 kg), was evaporated and partitioned to 4 fractions such as hexane,...

주제어

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제안 방법

  • GC 분석 에서 항균물질이 C18:4, n-3 지방산으로 동정되 었는바, 이를 다시 확인하기 위하여 이들의 methyl ester 유도체를 HPLC에서 분리하여 GC/MS로 분석하였다. GC/MS spectrum 상에서는 m/z 290 mass unit에 분자 이온 peak가관측되었다(Fig.
  • 건조 미 역 10.4 kg을 acetone으로 추출, 여과한 다음 액 -액 분배, 각종 크로마토그라피를 통하여 충치원인균, Streptococcus mutans에 대한 항균물질의한 성분을 분리, 정제하고(160 mg, 수율 1.5 X10-3%) 물질을 동정한 결과는 다음과같다. 건조 미역 30 g 상당량의 추출액을 기준으로 용매 획분별 항균활성을 조사하였을 때, CHCl3층이 73.
  • 95로 바뀌어 이들 물질이 carboxyl 기를 가지는 지방산으로 추정되었다 GC분석 에서 표품 지방산과 비교한 결과, 이들은 C18:4, n-3 지방산과 retention time이 일치하였다. 또한, 메칠 유도체의 mass spectrum 분석 결과, m/z 290에 분자 이온 peak가 관측되어 C18:4, n-3 지방산의 methyl 유도체의 분자량과 일치하여, 이 물질을 3, 6, 9, 12-octadecatetraenoic acid(stearidonic acid, C18:4, n-3) 지방산으로 동정하였다.
  • 분리, 정제한 항균물질 S-1, S-2, S-3을 각각 gas chromatography어〕서 분석하여 표품 혼합 지방산 methyl ester 화물과 용출 시간을 비교하였다. 비록 이들이 분리, 정제과정 중에 ODS column 상에서는 peak가 분리되어 용출되었으나, 세 성분 모두 동일한 15분대에 peak가 나타났으며, 불포화지방산의 C18:4, n-3과 용출 시간이 정확히 일치하여 이 성분들은 동일한 물질로서 불포화지방산인 3, 6, 9, 12-octadecatetraenoic acid(stearidonic acid, C18:4, n-3)로 동정하였다.
  • 분석기기는 supelcowax-320 capillary column(30 mx0.32 mm i.d.) 이 장착된 Shimadzu GC-17A(Shimadzu Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 FID로 검출하였다. 지방산 methyl ester 표준품은 진주조개 에서 분리한 지방산을 methyl ester화 한것을 사용하였다.
  • 8 cm의 paper disk(thick, Toyo Roshi, Japan) 에 흡습시킨 후건조시켜 각 시험관에 넣어 35oC 에서 72시간 배양하여 배양액의 흡광도를 660 nm에서 spectrophotometer(Shimadzu UV-160A, Shimadzu Inc, Japan)로 측정하였다. 이때 동일농도마다 3개의 시험구를 사용하였으며, S. mutans의 증식억제 여부는 대조구와 시험구의 흡광도 차이를 백분율로 환산하여 저해율을 표시하였다.
  • mutans의증식에 미치는 영향을 검색한 바, 다시마, 미역 등에서의 항충치활성을 보고하였다. 이에 다시마 및 미역의 아세톤 추출물로부터 S. mutanse 대한 항균활성을 재검토하고, 미역으로부터 항균활성물질을 분리, 정제하여 GC와 GC/MS에 의하여 동정하였다.
  • 정제된 항균물질의 methyl ester화물을 일반적인 지방산분석에 사용하는 승온 조건에서 GC로 분석하였다(22). 분석기기는 supelcowax-320 capillary column(30 mx0.
  • 정제한 항균물질 S-1, S-2 및 S-3 각각의 1/2량에 12% BF3/MeOH 용액 2 mL를 가하고 100oC에서 10분간 가열하} 여 methyl ester화 하였다. 여기에 포화식염수 5 mL를 가하고, 이어서 iso-octane 1 mL를 가하여 잘 흔들어 methyl ester 유도체들을 iso-octane 층으로 이행시켰다.
  • 잔사는 2배량의 acetone 으로 2회 더 추출하여 여액을 합한 다음 vacuum evaporator(Buchi R-114, Buchi, Switzerland)로감압 농축하여 점액성의 조추출액을 얻었다. 조추출액은 Fig. 1과 같이 1 L의 80% MeOH과 hexane으로 분배하여 hexane 획분을 분취하고, 80% MeOH 획분은 순차적으로 CHCls, BuOH, 수용성 획분으로 용매 극성별로 분획하였다. 이중 항균성이 강한 CHCl3 획분을 염기성 alumina column(60 x 1 cm, id.
  • 이때 각 column에서 사용한 용매는 column 부피의 3배 량으로각각 용출하였다. 최종적으로 Develosil ODS-7 column (20 x 1 cm, i.d., Nomura Chemical Co., Japan, 유속: 1 mL/min) 에서 90% MeOH을 용매로 UV 254 nm에서 monitoring 하면서 항균성 있는 3개의 물질 ST(10 mg), S-2(90 mg), S-3(60 mg)을 각각 분리하였다.
  • 4%의 항균성을 나타내었다. 최종적으로 ODS칼럼에서 95% MeOH를 이동상으로 하여 3개의 물질 S1(10 mg), S2(90 mg), S3(60 mg)을 분리 정제하였다. TLC에서 각 성분은 동일한 R값 0.
  • 지방산 methyl ester 표준품은 진주조개 에서 분리한 지방산을 methyl ester화 한것을 사용하였다. 한편, 항균물질의 methyl ester 유도체 약 30 mg을 항균물질 정제에 사용한 ODS column과 동일한조건하에서 재분리, 정제하여 GC/MS(Jeol JMS-700, Japan) 로 EI mode에서 분석하였다. 이때 columne DB-5 capillary column(60 mx0.
  • 항균물질 및 methyl ester 유도체들은 silica plate(Kiegelgel 60 F254, Merck, Germany)를 이용하여 hexane-diethyl ether-acetic acid(80:30:1) 혼합용매로 전개하였으며, 검출은 건조 후 50% sulfuric acid/EtOH을 분무하여 120oC로 가열하여 갈색 반점의 Rf값을 계산하였다. 대조 시료로서는대두유 및 대두유의 0.

대상 데이터

  • 건조 미 역 (Undaria pinnatifida)은 부산시 기 장군에서 양식하여 수확한 것을 자연 건조하여 시판중인 원형이 보존된특급 마른 미역을 구입하여 실험에 사용하였다.
  • 갈색 반점의 Rf값을 계산하였다. 대조 시료로서는대두유 및 대두유의 0.5 N NaOH로 가수분해하여 얻은 지방산 획분을 사용하였다.
  • 실험에 사용한 균주 Streptococcus mutans KCTC 3300 은 한국생명공학연구원 유전자 은행실에서 분양받았으며 , 세균 배 양 및 보존에는 brain heart infusion medium(BHI, Difco Lab., USA)을 사용하였다.
  • , Tokyo, Japan)를 이용하여 FID로 검출하였다. 지방산 methyl ester 표준품은 진주조개 에서 분리한 지방산을 methyl ester화 한것을 사용하였다. 한편, 항균물질의 methyl ester 유도체 약 30 mg을 항균물질 정제에 사용한 ODS column과 동일한조건하에서 재분리, 정제하여 GC/MS(Jeol JMS-700, Japan) 로 EI mode에서 분석하였다.

이론/모형

  • 미역의 acetone 추출물 및 각 용매 획분의 항균활성은 Lorian법(21)을 개량하여 측정하였다. 즉, BHI broth를 조제하여 5 mL씩 시험관에 분주하고 121oC에서 15분간 멸균시켰다.
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참고문헌 (28)

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