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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 초고속 PCR의 시간을 보다 단축하기 위하여, 합성 HIV-1 및 HIV-2 특이 염기서열을 주형으로 이단계 (two step) PCR법을 초고속 PCR에 적용하였고 이를 최적화하였으며, 이를 통하여 융점분석시간을 포함한 30회전의 HIV 특이 초고속 PCR검출법에서 최소 7분 24초의 검출시간을 기록하였기에 이를 보고하는 바이다.
- 본 연구에서 개발된 HIV 특이 유전자 검출을 위한 이단계 초고속 실시간 PCR의 정확성을 측정하기 위하여, 동일한 양의 초기 기질을 증폭대상으로 하여 HIV1 및 HIV2의 초고속 PCR을 반복 실험하였다. 사용된 초기 기질의 양은 HIV1 및 HIV2 각기 10 pg (2.
- 이단계 초고속 PCR에서 보다 검사시간을 단축하기 위하여, 정확한 PCR 증폭이 손상되지 않는 범위에서 가장 낮은 수준의 denaturation 온도를 측정하고자 하였다. 모든 조건은 이단계 초고속 PCR의 기본조건과 동일하게 수행하였으며 denaturation 온도를 88~94。(3까지 2℃ 간격으로 측정하며 비교하였다.
- 일반적 PCR에서 사용되고 있는 각 회전(cycle)의 3단계(step), 즉 denaturation, annealing, polymerization을, 2단계 PCR (two steps PCR), 즉 denaturation, annealing 및 polymerization으로 개선하고, 이를 초고속 PCR에 적용시키기 위하여, 본 연구에서는 annealing 온도 상승에 따른 초고속 삼단계 PCR에서 DNA 증폭효과를 측정하였다.
제안 방법
- 88~94。(3까지 2℃ 간격으로 측정하며 비교하였다.
- 3X105 copies의 pB/HIVaSi primer쌍으로 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HTV2-dF를 사용하고 나머지는 같은 조성으로 하였다. 반응 조건은 three step PCR의 경우 pre- denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 94℃ 1초, annealing 67℃ (HIV-1의 경우), 68。(:(111\乙2의 경우) 1초, extension 72℃ 3초 과정을 30회 반복하였으며, two step PCRe pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 94℃ 1 조, annealing 및 extension으로 67℃ (HIV1), 68℃ (HIV2) 3초 과정을 30회 반복하였다. Melting point analysis는 삼단계 PCR과 이단계 PCR 모두 75~85℃ 구간을 lamping rate 0.
- .이단계 초고속 실시간 PCR에서 denaturation 온도가 낮을 수록실험 소요 시간을 보다 단축할 수 있을 것으로 판단되었으며 , 이단계 초고속 PCR에서 denaturation 온도의 감소가 DNA 증폭에 미치는 효과를 측정하였다.
- HIV 특이 유전자 검출을 위한 이단계 초고속 실시간 PCR의 최적 온도 및 시간의 조건에서, primer 농도, MgCe 농도, laq polymerase 농도 등 제반 조성 조건의 영향을 측정하였다(Fig. 4).
- HIV 특이 유전자 검출을 위한 이단계 초고속 실시간 PCR의 최적 조건을 확립하기 위하여 primer 농도별, MgCl2 농도별, Taq polymerase 농도별 PCR에 미치는 영향을 측정하였다.
- HIVI 및 HIV2 특이 기질을 대상으로 anneaHng 온도를 최적화시킨 이단계 초고속 PCR과 3단계 초고속 PCR을 각각 수행하여 각 초고속 PCR의 특성을 비교하였다.
- HTV1 및 HTV2 특이 유전자를 1 pg (2.3X105 copies)에서 1 fg (2.3X102 copies)까지 단계별 희석하여 각기 PCR용액의 조성에 사용하였으며, 해당 primer쌍 각 10 pmole, 2x greenstar master mix를 첨가하여 최종 부피 6 μl가 되도록 조성하였다. 이 PCR용액에서 MgCL의 최종농도는 2.
- PCR 조성은 삼단계 PCR과 이단계 PCR 모두 최종 반응액 6 |X1 내에 HIV1의 template DNA인 pBX-HIVl (2.3X105 copies), 10 pmole의 HIVl-dF, 10 pmole 의 HTVl-dR, 2x greenstar master mix (Genetbio, Korea)로 조성하였으며 HIV2에 대하여는 template로 2.3X105 copies의 pB/HIVaSi primer쌍으로 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HTV2-dF를 사용하고 나머지는 같은 조성으로 하였다. 반응 조건은 three step PCR의 경우 pre- denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 94℃ 1초, annealing 67℃ (HIV-1의 경우), 68。(:(111\乙2의 경우) 1초, extension 72℃ 3초 과정을 30회 반복하였으며, two step PCRe pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 94℃ 1 조, annealing 및 extension으로 67℃ (HIV1), 68℃ (HIV2) 3초 과정을 30회 반복하였다.
- PCR의 조성은 최종 반응액 6 μ1 내에 HIV1에 대한 template DNA인 pBX-HIVl (2.3X1O5 copies), 10 pmole의 HTVl-dF primer, 10 pmole 의 HIVl-dR primer, 2x greenstar master mix (Genetbio, Korea)로 조성하였으며 HTV2에 대하여는 2.3X105 copies의 pBX-HIV2, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2- dR, 2X greenstar master mix로 조성하였다. Real-time PCR 기기는 Genspector™ TMC-1000 (Samsung, Korea)< 사용하였으며 , 차후 모든 real-time PCR 반응은 동일한 기기를 사용하였다.
- PCR의 조성은 최종 반응액 6 μ1 안에 HTV1의 특이 template DNA인 pBX-HIVl (2.3X105 copies), 10 pmole의 HIVl-dF, 10 pmole의 HTVl-dR, 2x greenstar master mix (Genetbio, Korea) 로조성하였으며 HIV2에 대하여는 2.3X105 copies의 pBX-HIV2, 10 pmole 의 HIV2-dF, 10 pmole의 HTV2-dR, 2X greenstar master mix로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30 초를 수행하고, denaturation 88~94℃ 1초, annealing 및 extension으로 67℃ (HIV-1의 경우), 68℃ (HIV-2의 경우) 각기 3초 과정을 30회 반복하였으며, 이후 융점분석은 앞의 실험과 같은 조건으로 수행하였다.
- PCR의 조성은 최종 반응액 6μ1 내에 10 pg (2.3X106 copies) 에서 10 fg (2.3X103 copies)까지의 pBX-HIVl DNA> 포함시켰고, 또한 10 pmole의 HIVl-dF, 10 pmole의 HIVl-dR, 2X greenstar master n血x로 조성하였으며 HIV-2에 대하여는 10 pg (2.3X106 copies)에서 1 fg (2.3X103 copies)의 pBX-HIV2를 각기 사용하였으며, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2-dR, 2X greenstar master n血x로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 90℃ 1 초, annealing- extension으로 67℃ (HIV-1), 68℃ (HTV-2) 3초 과정을 30회 반복하였으며, 융점분석은 전의 실험과 동일하게 하였고, 이를 3회 반복하여 Ct값 및 Tm값의 평균을 측정하였다.
- 농도별 PCR에 미치는 영향을 측정하였다.
- 각 실험은 Ct값을 기준으로 특이 DNA의 PCR 증폭 효과의 증감으로 판정하였다. 먼저 primer 농도에 따른 초고속 PCR의 DNA 증폭 효과는 10 pmole에서 40 pmole까지의 범위에는 큰차이가 없는 것으로 나타났으나, 30 pmole 이상의 primer 농도에서는 형광의 절대값, 즉 PCR 생성물의 양이 상대적으로 조금감소되는 결과를 보여 주었다.
- 또한 denaturation 온도 90~94℃에서 모든 초고속 PCR의 Ct 값 및 Tm값은 큰 차이를 보이지 않았기에, 최소의 PCR 소요 시간을 보여준, 가장 낮은 denaturation 온도인 90℃를 HIV1과 HIV2 특이 서열의 검출을 위한 초고속 이단계 PCR의 최적 denaturation 온도로 결정하였다.
- 또한, 얻어진 최적 primer 농도와 MgCl2 농도에서 최적 Taq polymerase 농도를 측정하기 위해 최종 부피 6μ1에 2.3x105 copies의 template DNA와 10 pmole 농도의 forward/reverse primer, 2x greenstar master mix로 조성하고, 각각의 반응액에 0.6 U, 1.0 U, 1.4 U, 1.8 U의 Taq polymerase가 포함되도록 하였으며 , 반응조건은 앞의 실험과 동일하게 수행하였다.
- 3X105 copies의 pBX-HIV2, 10 pmole 의 HIV2-dF, 10 pmole의 HTV2-dR, 2X greenstar master mix로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30 초를 수행하고, denaturation 88~94℃ 1초, annealing 및 extension으로 67℃ (HIV-1의 경우), 68℃ (HIV-2의 경우) 각기 3초 과정을 30회 반복하였으며, 이후 융점분석은 앞의 실험과 같은 조건으로 수행하였다.
- 3X105 copies의 template DNA와 2x greenstar master mix로 하여 동일 조건에서 초고속 PCR을 수행하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30 초를 수행하고, denaturation 90℃ 1초 annealing 및 extension으로 67℃ (HIV-1), 68℃ (HIV-2) 3초 과정을 30회 반복하였으며 융점 분석은 앞의 실험과 동일하게 수행하였다.
- 3X103 copies)의 pBX-HIV2를 각기 사용하였으며, 10 pmole의 HIV2-dF, 10 pmole의 HIV2-dR, 2X greenstar master n血x로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 90℃ 1 초, annealing- extension으로 67℃ (HIV-1), 68℃ (HTV-2) 3초 과정을 30회 반복하였으며, 융점분석은 전의 실험과 동일하게 하였고, 이를 3회 반복하여 Ct값 및 Tm값의 평균을 측정하였다.
- 6 U Taq polymerase가 포함되도록 master mix를 새롭게 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 90℃ 1초, annealing-extension으로 67℃ (HIV-1), 68℃ (HIV-2) 3초 과정을 30회 반복하였으며, 융점 분석은 75~85℃ 구간을 lamping rate 0.2℃/sec의 속도로 1℃ 간격으로 측정하여 Tm값을 결정하였다.
- Real-time PCR 기기는 Genspector™ TMC-1000 (Samsung, Korea)< 사용하였으며 , 차후 모든 real-time PCR 반응은 동일한 기기를 사용하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, denaturation 94℃ 1초, annealing 56~72℃ 1초, extension 72℃ 3초 과정을 30회 반복하였으며, 이후 융점분석 (melting point analysis)은 75~85℃ 구간을 lamping rate Ql℃/sec의 속도로 1℃ 간격으로 측정하여 Tm값을 결정하였다.
- 본 연구를 통하여 확립된 HIV 특이 유전자 검출을 위한 이단계 초고속 실시간 PCR의 최적조건을 사용하여 HTV-1 및 HIV-2 특이 유전자의 각 검출한계를 측정하였다. 초기 기질의 양은 각 특이 유전자의 분자량에 따른 분자의 수를 계산하였으며, 이 분자 수를 검출 한계의 단위로 사용하였다(Fig.
- 본 연구에서 확립한 이단계 초고속 실시간 PCR의 제반 최적 조건을 사용하여 HIV 특이 유전자를 검출할 수 있는 최소 한계를 측정하였다.
- 본 연구에서 확립한 이단계 초고속 실시간 PCR의 제반 최적 조건을 사용하여 HTV 특이 유전자의 농도별 재현성을 측정하였다.
- 실험하였다. 사용된 초기 기질의 양은 HIV1 및 HIV2 각기 10 pg (2.3X106 copies), 1 pg (2.3X105 copies), 100 fg (23X1(/ copies), 1 fg (2.3X103 copies)이었으며 이를 각기 삼반복 측정하여 그 오차를 계산하였다(Fig. 6).
- 우선 PCR 조성에서 최적의 primer 농도를 구하기 위하여 해당 primer쌍을 각각 10 pmole, 20 pmole, 30 pmole, 40 pmole 로 조정하고, primer를 제외한 나머지 조성은 2.3X105 copies의 template DNA와 2x greenstar master mix로 하여 동일 조건에서 초고속 PCR을 수행하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30 초를 수행하고, denaturation 90℃ 1초 annealing 및 extension으로 67℃ (HIV-1), 68℃ (HIV-2) 3초 과정을 30회 반복하였으며 융점 분석은 앞의 실험과 동일하게 수행하였다.
- 초고속 삼단계 실시간 PCR을 통하여 얻어진 최적의 annealing 온도에서 초고속 이단계 PCR의 결과와 초고속 삼단계 PCR의 결과를 비교하였다.
- 최적 MgCl2 농도를 구하기 위하여 primer 농도별 이단계 실시간 PCR을 통하여 얻어진 최적 primer 농도를 기준으로, 최종 부피 6 pl에 2.3X105 copies의 template DNA와 각 10 pmole의 forward/reverse primer, 2x greenstar master mix로 조성하고, 각각의 반응액에 최종농도 2.0 mM, 2.5 mM, 3.0 mM, 3.5 mM이되도록 MgCl2< 첨가하였다. 반응 온도조건은 primer 최적 조건을 구한 실험과 동일한 조건으로 수행하였다.
대상 데이터
- pBX-HIVl과 pBX-HIV2는 HIV가 다양한 유전적 변이를 일으키는 특성을 가지고 있기에 미국 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) 에 보고된 45종의 HIV1 env 유전자와 33종의 HTV2 env 유전자의 염기서열을 비교분석하여 가장 상동성이 높은 부분을 선정한 것이며, 이를 인공 유전자 합성법인 long-nucleotide extension법 (7)을 사용하여 제작하고 클론화한 것이다(9). 또한 상기의 HTV 특이 기질에 대한 검색용 primer들도 이 등의 연구(9)에서 사용한 primer들을 그대로 사용하였으며, 이들 primer에 대한 정보는 Table 1에 나타내었다.
- 본 연구에서 사용한 PCR 검사용 기질은 Lee 등⑼의 연구에서 설계 및 합성된 HIV1 및 HIV2 특이 기질인 pBX-HTWl과 pBX-HIV2를 사용하였다. pBX-HIVl과 pBX-HIV2는 HIV가 다양한 유전적 변이를 일으키는 특성을 가지고 있기에 미국 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) 에 보고된 45종의 HIV1 env 유전자와 33종의 HTV2 env 유전자의 염기서열을 비교분석하여 가장 상동성이 높은 부분을 선정한 것이며, 이를 인공 유전자 합성법인 long-nucleotide extension법 (7)을 사용하여 제작하고 클론화한 것이다(9).
성능/효과
- 68。(2로 나타났으며, 그 이상의 annealing 온도에서 초고속 PCRe PCR 산물의 생성량이 크게 감소되고 또한 Ct값이 크게 증가하여 초고속 PCR에 적합하지 아니한 것으로 판단되었다.
- 94。(2를 denaturation 온도로 적용한 동일 실험보다 40초 이상 소요시간 감소효과를 보였으며, 최종적으로 HIV1 을 증폭 대상으로 한 이단계 초고속 PCR의 경우 30회전의 PCR 실험과 융점 분석 시간을 포함하여, 7분 32초, HTV-2의 경우 7분 24초에 해당 특이 DNA 검출이 가능하였다(Fig. 3).
- 5±0.35。0로 측정되어 양자 모두에서 우수한 재현성을 보여 주었다.
- HIV-1 및 HIV-2 특이 유전자를 증폭시키는 30회전의 초고속 PCR에서 양자 모두 annealing 온도를 증가시킬수록 초고속 PCR 에 필요한 총 소요 시간은 크게 단축되는 것이 확인되었다. 그러나 HIV-1의 경우 70℃, 72P의 annealing 온도에서의 초고속 PCRe Ct값이 측정되지 아니하였으며, Tm값도 72。<2에서는 측정되지 아니하였다.
- HIV1 및 HIV2 특이서열을 각기 대상으로 한 실험 모두에서 이단계 초고속 PCR과 삼단계 초고속 PCR의 Ct값은 실험오차범위의 차이만을 보였으며, 이는 이단계와 삼단계 PCR간의 DNA 증폭효과에서는 차이가 없는 것으로 해석되었다.
- 크게 증가하는 것을 볼 수 있었다. HTV-2의 경우는 MgClj 의 농도를 2 mM에서 그 이상으로 증가시킬수록 Ct값이 증가하였으나, 그 증가의 정도가 HIV-1의 경우에 비하여 상대적으로 적게 나타났다. 따라서 일반 PCR의 경우와 같이 MgC&의 농도는 초고속 PCR에서도 성공적 PCR을 위한 중요 변수로 판단되었으며, 이는 template와 primer들의 염기서열에 따라 변화될 수 있음을 확인하였다.
- 반응시간을 2초에서 1초로 줄인 것이다. 결과적으로 초고속 PCR에 이단계 PCR법을 적용시킨 것은 삼단계 초고속 PCR 에서 보여준 Ct값과 Tm값의 변화 없이 총 실험시간만을 30초 줄일 수 있었던 것으로 나타났으며, 이는 이단계 초고속 PCR이 총 검색시간의 단축에서 보다 유리함이 확인된 것이다(Fig. 2).
- HTV-2의 경우는 MgClj 의 농도를 2 mM에서 그 이상으로 증가시킬수록 Ct값이 증가하였으나, 그 증가의 정도가 HIV-1의 경우에 비하여 상대적으로 적게 나타났다. 따라서 일반 PCR의 경우와 같이 MgC&의 농도는 초고속 PCR에서도 성공적 PCR을 위한 중요 변수로 판단되었으며, 이는 template와 primer들의 염기서열에 따라 변화될 수 있음을 확인하였다. 본 HTV 이단계 초고속 PCR에서 최적 MgCh의 농도는 모두 2 mM로 결정하였다(Fig.
- 먼저 primer 농도에 따른 초고속 PCR의 DNA 증폭 효과는 10 pmole에서 40 pmole까지의 범위에는 큰차이가 없는 것으로 나타났으나, 30 pmole 이상의 primer 농도에서는 형광의 절대값, 즉 PCR 생성물의 양이 상대적으로 조금감소되는 결과를 보여 주었다. 또한 30 pmole 이상의 primer 농도에서 Tm값들도 상대적으로 조금 낮아진 것이 관찰되었으며, 이는 상대적으로 적게 생성된 PCR 산물들이 과다 투여로 잔류 된 primer의 영향을 받아 Tm의 측정에서 상대적으로 낮게 나온 것으로 추론되었다. Primer의 과다 투여가 긍정적 영향을 보이지 아니하는 것을 감안하여 HIV 특이 유전자 검출을 위한 이단계 초고속 실시간 PCR의 최적 primer의 농도는 10 pmole로 결정하였다(Fig.
- 또한 MgCl2 농도에 따른 초고속 PCR의 Ct값, 즉 DNA 증폭효과는 MgCe 농도에 따라 Ct값이 크게 변화되는 것으로 관찰되었으며, 특히 HTV-1의 특이 염기서열을 증폭대상으로 하였을경우, MgCU의 농도를 2 曲에서 그 이상으로 증가시킬수록 Ct 값이 크게 증가하는 것을 볼 수 있었다. HTV-2의 경우는 MgClj 의 농도를 2 mM에서 그 이상으로 증가시킬수록 Ct값이 증가하였으나, 그 증가의 정도가 HIV-1의 경우에 비하여 상대적으로 적게 나타났다.
- 3X103 copies)에서 초고속 이단계 PCRe 각각의 유전자를 성공적으로 증폭할 수 있었으며, 각 초기기질의 양에 대한 각 Ct값의 비에서 매우 우수한 정량성을 보여 주었다. 또한 이 초고속 PCR에 소요된 총 검출시간도, 융점분석의 시간을 포함하여, 7분 24초에서 7분 35초로 측정되어 이단계 초고속 PCR의 우수성을 보여주었다. 그러나 HIVI 및 HTV2 각기 1 fg (2.
- 이러한 연구들은 우선 일반 PCR에 비하여 초고속 PCR이 실험에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있음을 보여 주었고, PCR 용액내의 분자들 또한 초고속에 상응하는 분자의 운동, 즉 DNA 및 primer의 denaturation, annealing, Taq polymerase에 의한 중합반응 등을 충분히 빠르게 수행할 수 있음을 추측하게 하였다. 또한 초고속 PCR을 보다 초고속으로 진보시키기 위하여 PCR 시간 단축을 위한 기기의 성능 개선 뿐 아니라 초고속에 걸맞은 최적 PCR 조건의 확립이 보다 긴요할 수 있음을 시사하였다. 병원체에 대한 유전자 검사로써 초고속 PCR법은 우선 병원체에 대한 즉석검사에 보다 근접할 수 있도록 보다 시간단축을 추구하여야 할 것이며, 정확성과 민감도를 보다 개선할 수 있도록 개발되어야 할 것이다.
- 판정하였다. 먼저 primer 농도에 따른 초고속 PCR의 DNA 증폭 효과는 10 pmole에서 40 pmole까지의 범위에는 큰차이가 없는 것으로 나타났으나, 30 pmole 이상의 primer 농도에서는 형광의 절대값, 즉 PCR 생성물의 양이 상대적으로 조금감소되는 결과를 보여 주었다. 또한 30 pmole 이상의 primer 농도에서 Tm값들도 상대적으로 조금 낮아진 것이 관찰되었으며, 이는 상대적으로 적게 생성된 PCR 산물들이 과다 투여로 잔류 된 primer의 영향을 받아 Tm의 측정에서 상대적으로 낮게 나온 것으로 추론되었다.
- 민감도 측정의 결과, HIV-1 또는 HIV-2 특이 유전자 1 pg (2.3X1O5 copies), 100 fg (2.3X104 copies), 10 fg (2.3X103 copies)에서 초고속 이단계 PCRe 각각의 유전자를 성공적으로 증폭할 수 있었으며, 각 초기기질의 양에 대한 각 Ct값의 비에서 매우 우수한 정량성을 보여 주었다. 또한 이 초고속 PCR에 소요된 총 검출시간도, 융점분석의 시간을 포함하여, 7분 24초에서 7분 35초로 측정되어 이단계 초고속 PCR의 우수성을 보여주었다.
- 본 연구는 12분 수준의 진단시간을 보여준 HIV 초고속 PCR 에 대한 기존 연구(9)에 새로이 이단계 PCR법을 적용하여 동등의 진단, 즉 융점분석을 포함한 30회전의 HIV 특이 DNA의 PCR 증폭이 7분대 수준에서 가능함을 보여 줄 수 있었다. 사실, 본 연구에서 보여준 7분 24초의 검색시간은 융점분석에 필요한 100초, 즉 1분 40초가 포함된 것이며, 따라서 pre-denaturation을 포함한 30회전의 PCR 증폭에 소요된 시간은 정확히 5분 44초에 불과한 것이다.
- 본 연구에서 보여준 7분대의 초고속 PCR 진단법은 PCR이 가지고 있는 높은 민감도를 크게 희생시키지 아니하며, rapid kit에서 보여준 15분대의 진단이라는 신속성을 앞지를 수 있는 가능성을 보여준 것이다. PCR 기기라는 특수기기를 필요로 한다는 단점은 차후 수요에 따른 PCR 기기의 소형화 개발 등의 노력으로 쉽게 극복될 수 있을 것이라 기대하며, 실시간 PCR이 가지고 있는 또 다른 장점인 정량성, 즉 병원체의 정량적 진단이 가능한 점을 감안한다면, 초고속 실시간 PCR 진단법은 간이 진단이 아닌 정밀 진단을 현장에서 바로 적용시킬 수 있는 민감하고도 신속한 진단방법이 될 수 있을 것이다.
- 3X102 copies)에 대한 30회전의 초고속 PCR에서는 Ct값이 측정되지 아니하였으며, 이는 본 실험의 초기기질의 양에 대한 정량성에 비추어 Ct값이 각기 30 회전 이후 나타나기 때문으로 해석되었다. 사실 본 연구의 초고속 이단계 PCR의 조건에서 PCR의 회전수만 40 회전으로 증가시켰을 경우, 총소요시간은 9분대로 증가되나 민감도는 각기 이등의 연구⑼와 같이 초기 기질 0.01 fg (2.3 copies)의 HIV1 및 HIV2의 유전자를 증폭시킬 수 있었으며, 각기 35회전 이내에서 Ct값이 형성되는 것을 볼 수 있었다(자료 미제시).
- 사실, 본 연구에서 보여준 7분 24초의 검색시간은 융점분석에 필요한 100초, 즉 1분 40초가 포함된 것이며, 따라서 pre-denaturation을 포함한 30회전의 PCR 증폭에 소요된 시간은 정확히 5분 44초에 불과한 것이다. 5분-PCR을 목표로 한 초고속 PCRe 우선 그 소요 시간으로 목표에 거의 근접하고 있으며 관련 기술들의 발전으로 더욱 빠른 초고속 PCR이 가능할 것으로 예상된다.
- 우선, 융점분석 (Melting-temperature analysis)과 30회전의 PCR 을 포함한 전체 검색시간에서 초고속 이단계 PCR이 초고속 삼단계 PCR보다 30초 내외의 시간을 단축할 수 있는 것으로 측정되었다. 한편, 반복된 실험에서 동일한 초고속 PCR에서도 총 검색 시간이 약 4초 수준의 차이가 나는 것이 발견되었으며, 이는 초고속 PCR 기기의 적정온도 보정과정에서 미세한 시간차가 증폭되기 때문에 발생되는 시간적 오차로 판단되었다.
- 한편, Ct값이 측정되지 아니한 HIV-1의 7CTC의 annealing 온도에서의 초고속 PCRe PCR 생성물의 양을 의미하는 형광강도 가동 실험의 25 cycle 부분에서부터 증가되는 것이 확인되었으나, 72 *>C에서의 같은 실험의 경우 30회전 이후에도 형광값의 변화를 확인할 수 없었다(자료 미제시). 이는 실험에 사용된 HIV-1 특이 염기서열과 HIVl-dF 및 HIVl-dR primer 쌍의 염기서열 간 annealing의 강도가 이 온도 및 초고속의 시간 조건에서 효과적인 anneaWg이 되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 해석되었다.
- 또한 avian influenza virus (AIW)를 대상으로 한 Kim 등(8)의 연구는 합성 AIV 특이염기서열 103개 DNA분자를 주형으로 하여, 최단 12분 28초 만에 AIV 특이 염기서열에 대한 30회전 PCR 증폭이 가능함을 보여주었다. 이러한 연구들은 우선 일반 PCR에 비하여 초고속 PCR이 실험에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있음을 보여 주었고, PCR 용액내의 분자들 또한 초고속에 상응하는 분자의 운동, 즉 DNA 및 primer의 denaturation, annealing, Taq polymerase에 의한 중합반응 등을 충분히 빠르게 수행할 수 있음을 추측하게 하였다. 또한 초고속 PCR을 보다 초고속으로 진보시키기 위하여 PCR 시간 단축을 위한 기기의 성능 개선 뿐 아니라 초고속에 걸맞은 최적 PCR 조건의 확립이 보다 긴요할 수 있음을 시사하였다.
- 한편 Taq polymerase 농도에 따른 초고속 PCR의 Ct값, 즉 DNA 증폭효과에 대한 실험결과는 HIV-1과 HIV-2 모두에서 Taq polymerase의 농도가 0.6 unit 이상으로 증가할수록 Ct값이 높아지는 것으로 나타났으며 , 결과적으로 PCR 산물의 생산량이 낮아지는 것으로 나타났다. 이는 본 연구에서 사용된 micro-chip based PCR의 반응액 총량이 6gl의 소량이기에, 0.
- 한편 Tm값에서도 HIV1과 HTV-2의 실험 모두, 이단계 초고속 PCR과 삼단계 초고속 PCRe 실험오차 범위의 작은 차이만을 보였으며, 이 역시 이단계 및 삼단계 초고속 PCR에서 DNA 증폭 효과에서는 별다른 차이가 없는 것으로 해석되었다.
- 해석되었다. 한편, Ct값이 측정되지 아니한 HIV-1의 7CTC의 annealing 온도에서의 초고속 PCRe PCR 생성물의 양을 의미하는 형광강도 가동 실험의 25 cycle 부분에서부터 증가되는 것이 확인되었으나, 72 *>C에서의 같은 실험의 경우 30회전 이후에도 형광값의 변화를 확인할 수 없었다(자료 미제시). 이는 실험에 사용된 HIV-1 특이 염기서열과 HIVl-dF 및 HIVl-dR primer 쌍의 염기서열 간 annealing의 강도가 이 온도 및 초고속의 시간 조건에서 효과적인 anneaWg이 되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 해석되었다.
- 한편, 반복된 실험에서 동일한 초고속 PCR에서도 총 검색 시간이 약 4초 수준의 차이가 나는 것이 발견되었으며, 이는 초고속 PCR 기기의 적정온도 보정과정에서 미세한 시간차가 증폭되기 때문에 발생되는 시간적 오차로 판단되었다.
후속연구
- 보여준 것이다. PCR 기기라는 특수기기를 필요로 한다는 단점은 차후 수요에 따른 PCR 기기의 소형화 개발 등의 노력으로 쉽게 극복될 수 있을 것이라 기대하며, 실시간 PCR이 가지고 있는 또 다른 장점인 정량성, 즉 병원체의 정량적 진단이 가능한 점을 감안한다면, 초고속 실시간 PCR 진단법은 간이 진단이 아닌 정밀 진단을 현장에서 바로 적용시킬 수 있는 민감하고도 신속한 진단방법이 될 수 있을 것이다.
- 본 연구에서 사용된 primer들은 염기의 길이, GC% 및 amplicon의 크기가 모두 일정한 prHmer들이며(Table 1), 이런 primer들도 초고속 PCR에서 HIV-1과 HTV-2의 경우와 같이 다른 amealing 강도를 보이는 것은 primer 쌍의 염기서열간의 차이로 해석되며, 초고속 PCR에 적합한 primer의 염기서열은 더 연구될 필요가 있을 것으로 판단되었다.
- 본 연구에서는 초고속 실시간 PCR법의 개발에 집중하여 RNA virus인 HIV의 진단에 필요한 과정인 초고속 역전사 반응 (reverse transcription)을 제시하지 아니하였으며, 임상시료를 사용한 검출실험 등의 결과를 보여주지는 못하였다. 이러한 후속실험들은 본 연구의 주제인 HIV에 대한 초고속 PCR 진단법의 현장 적용에 꼭 필요한 과정이며 향후 상기 연구의 정립으로 HIV의 임상진단에 초고속 PCR법이 활용되기를 기대하며 더 나아가 많은 RNA virus에 의한 진단법에도 초고속 실시간 PCR법이 적용되기를 기대한다.
- 검출실험 등의 결과를 보여주지는 못하였다. 이러한 후속실험들은 본 연구의 주제인 HIV에 대한 초고속 PCR 진단법의 현장 적용에 꼭 필요한 과정이며 향후 상기 연구의 정립으로 HIV의 임상진단에 초고속 PCR법이 활용되기를 기대하며 더 나아가 많은 RNA virus에 의한 진단법에도 초고속 실시간 PCR법이 적용되기를 기대한다.
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