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문제 정의
- 腎陰虛證의 대표적인 처방인 六味地黃丸은 陰虛 陽亢과 陽强易擧하여 나타나는 性機能의 虛弱性 興 奮으로 인한 遺精 증상의 치료에 사용되어왔다询 六 味地黃丸의 君藥으로서 용량이 가장 많은 구성 약물이며 滋陰補腎, 塡精益髓하는 效能으로 遺精陽痿, 不 育不孕의 치료에 활용되어 온 熟地黃이 남성 불임에 미치는 기전을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 숙지황 추출물의 농도별 희석액이 DPPH radial 소거 효과가 있는지의 여부를 관찰하기 위하여 대표적인 항산화 물질인 ascorbic acid의 활성과 숙지황의 농도에 따른 DPPH radical 소거 활성을 비교하였다.
- 이에 補血滋陰, 益精塡水의 효능으로 활용되고 있는 熟地黃이 남성불임에 미치는 기전을 확인하기 위해 생식세포의 일종인 GC-1 spg cell에 미치는 항산화 작용을 DPPH radial 소거활성, GC-1 spg cell에 대한 MTT assay, hydrogen peroxide 에 의한 LPO 생성에 미치는 변화에 대한 실험을 수행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- DPPH에 의한 radical scavenging activity를 알아보기 위하여 동결건조 된 시료를 증류수에 녹여서 1, 5, 10, 50, 100, 1000 昭/mL의 농도로 시액을 조제하였다. 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였고 시료와 같은 농도로 조제하였다.
- GC-1 spg cell에 대한 cell viability 결과에 근거하여 hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity 를 측정하였다. 숙지황의 농도는 10, 50, 100 pg/ml 의 범위에 대하여 측정하였다.
- GC-1 spg cell에 대한 cell viability 결과에 근거하여 숙지황이 GC-1 spg cell의 산화적 손상을 보호할 수 있는가를 관찰하기 위하여 hydrogen peroxide 에 의해 유도된 cytotoxicity를 측정하였다. Hydroge n peroxide에 의해 유도된 GC-1 spg ceHe 정상군에 비하여 60.
- 532 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다. malondiadehyde (MDA) 농도는 free MDA로 표준선을 구하여 계산하였다.
- 수행하였다. 숙지황 추출물의 농도별 희석액이 DPPH radial 소거 효과가 있는지의 여부를 관찰하기 위하여 대표적인 항산화 물질인 ascorbic acid의 활성과 숙지황의 농도에 따른 DPPH radical 소거 활성을 비교하였다. Aascorbic acid와 숙지황은 모두 농도 의존적으로 DPPH radical 소거 활성이 증가하였다.
- 측정하였다. 숙지황의 농도는 10, 50, 100 pg/ml 의 범위에 대하여 측정하였다. Hydrogen peroxide에 의해 유도된 GC-1 spg celle 정상군에 비하여 60.
- 수행하였다. 숙지황의 농도는 5, 10, 50, 100 μg/ml의 범위에 대하여 측정하였다. 숙지황의 5, 10, 50, 100 ng/ml의 농도에서 GC-1 spg cell 의 생존율은 각각 109.
- 시료의 hydrogen peroxide의해 유도된 cytotox icity에 대한 보호효과를 알아보기 위해 Mosmannd 983), Kotnik(1990) 등의 MTT test를 응용하여 다음과 같이 실험하였다6). 96 well plate에 1><104 cells/well 의 cell을 100 M 씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS, Sigma) 용액으로 씻어주었다.
- 척도로도 활용되어진다. 지질과산화 억제 활성을 측정하기 위하여 hydrogen peroxide에 의하여 산화가 용이하게 일어나 지질과산화물인 MDA를 잘 생성하는 GC-1 cell의 protein을 분리하여 사용하였다. GC-1 cell에 대한 hydrogen peroxide에 의해 유도된 LPO의 지표물질인 MDA 함량을 측정한 결과 숙지황에 의해 농도 의존적으로 MDA 함량이 감소하였으며, 특히 숙지황 100 呢/ml의 농도 처리 군에서 가장 유의성 있는 항산화 효과를 나타내었다.
대상 데이터
- 구입하였다. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)과 Fetal Bovine Serum (FBS) 및 trypsine-EDTA 등은 GIBCO BRL사 (USA)에서 구입되어 사용되었으며, 2, 2-Diphenyl-l-picryl-hydrazyl (DPPH) (Sigm, USA), ascorbic acid (Sigma, USA), ethanol (Duks an, Korea), tetrazolium salt 3, [4, 5-dimethylthiazol- 2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Si gma, USA), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA), hydrogen peroxide (Sigma, USA), sodium d odecyl sulfate (SDS), 2-thiobarbituric acid (TBA), malondiadehyde (MDA), n-butanol, pyridine 등이 Sigma (USA에서 구입되어 사용되었다.
- 실험에 사용된 세포주는 생쥐의 Spermatogonia (GC-1 spg)로서 ATCC (America)에서 구입하였다. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)과 Fetal Bovine Serum (FBS) 및 trypsine-EDTA 등은 GIBCO BRL사 (USA)에서 구입되어 사용되었으며, 2, 2-Diphenyl-l-picryl-hydrazyl (DPPH) (Sigm, USA), ascorbic acid (Sigma, USA), ethanol (Duks an, Korea), tetrazolium salt 3, [4, 5-dimethylthiazol- 2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Si gma, USA), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA), hydrogen peroxide (Sigma, USA), sodium d odecyl sulfate (SDS), 2-thiobarbituric acid (TBA), malondiadehyde (MDA), n-butanol, pyridine 등이 Sigma (USA에서 구입되어 사용되었다.
- 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였고 시료와 같은 농도로 조제하였다. 96 well microplate (Coming, USA) 에 동량의 ethanol 에 녹인 0.
- LIBOSCH. 한국산으로 서울특별시 동대문구 제기동 경동약령시장의 원광약업사를 통하여 구입하여, 경희대학교 처방제형학 교실에서 외부형태를 비교 조사하여 확인한 후 사용하였으며, 일부는 보관하였다.
데이터처리
- 실험성적은 평균치±표준오차 (Mean ± SE)로 나타내었으며, 대조군과 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 검정하여 p값이 0.05 미만일 때를 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 부유된 cell을 -70℃에서 5분간, 371 에서 5분간 방치 후 vortexing하는 과정을 4번 반복하는 freezing-thawing의 방법으로 cell< lysis 시켰다. 그 후 cell을 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 “1를 취해 Bradford's Method®로 단백질을 정량하였다. 15 mL comical tube에 각 농도별 시료를 넣고 0.
- 5 mL의 eppendorf tube에 담아 12, 000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 potassium phosphate buffer (PPB)를 첨가하여 cell 을 풀어주었다. 부유된 cell을 -70℃에서 5분간, 371 에서 5분간 방치 후 vortexing하는 과정을 4번 반복하는 freezing-thawing의 방법으로 cell< lysis 시켰다. 그 후 cell을 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 “1를 취해 Bradford's Method®로 단백질을 정량하였다.
- 숙지황이 GC-1 cell의 성장 및 증식에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 숙지황의 농도는 5, 10, 50, 100 μg/ml의 범위에 대하여 측정하였다.
- 숙지황이 GC-1의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 Mosmann(1983), Kotnik(1990) 등의 방법을 응용하였다6). 96 well plate에 1시04 cells/well의 cell을 100 心씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS, Sigma) 용액으로 씻어주었다.
성능/효과
- nmol/mg protein 인데 비흐!.여, hydrogen peroxide 에 의해 산화가 유도된 대조군은 7.53 nmol/mg protein으로 유의성 있게 과산화지질이 증가하였음을 확인하였다 (p < 0.05). Hydrogen peroxide와 숙지황의 동시처리군은 50, 100 pg/ml 의 농도에서 MDA가 각각 6.
- 지질과산화 억제 활성을 측정하기 위하여 hydrogen peroxide에 의하여 산화가 용이하게 일어나 지질과산화물인 MDA를 잘 생성하는 GC-1 cell의 protein을 분리하여 사용하였다. GC-1 cell에 대한 hydrogen peroxide에 의해 유도된 LPO의 지표물질인 MDA 함량을 측정한 결과 숙지황에 의해 농도 의존적으로 MDA 함량이 감소하였으며, 특히 숙지황 100 呢/ml의 농도 처리 군에서 가장 유의성 있는 항산화 효과를 나타내었다.
- Hydroge n peroxide에 의해 유도된 GC-1 spg ceHe 정상군에 비하여 60.6%로 유의하게 cell viability가 감소하였다. Hydrogen peroxide 에 의해 유도된 GC-1 spg cell 에 대하여 숙지황 처리군은 H2O2-induced cytstoxicity에 대한 항산화 효과가 농도의존적으로 증가되었으며, 특히 숙지황 100 ng/ml의 농도처리 군에서 H2O2-induced cytotoxicity에 대하여 가장 유의성 있는 항산화 효과를 나타내었다.
- 6%로 유의하게 cell viability가 감소하였다. Hydrogen peroxide 에 의해 유도된 GC-1 spg cell 에 대하여 숙지황 처리군은 H2O2-induced cytstoxicity에 대한 항산화 효과가 농도의존적으로 증가되었으며, 특히 숙지황 100 ng/ml의 농도처리 군에서 H2O2-induced cytotoxicity에 대하여 가장 유의성 있는 항산화 효과를 나타내었다.
- 01). Hydrogen peroxide 에 의해 유도된 GC-1 spg cell에 대하여 숙지황 처리군은 10, 50, 100 u g/ml 의 농도에서 각각 84.1, 90.3, 91.5%로 H2O2-induced cytotoxicity에 대한 항산화 효과가 농도 의존적으로 증가되었다. 특히 숙지황 100 ug/ml 의 농도처리군에서 H2O2-induced cytotoxicity에 대하여 가장 유의성 있는 항산화 효과를 나타내었다 (p < 0.
- 5%로 유의성 있게 증가하였다. 숙지황 100 pg/ml의 농도에서 GC-1 spg cell의 생존율은 136.5%로서 가장 높았다 (Fig. 2).
- 숙지황의 농도에 따른 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과 ascorbic acid와 숙지황은 모두 농도 의존적으로 DPPH radical 소거 활성이 증가하였다. 숙지황은 50 职/ml의 농도에서 20.
- 숙지황이 GC-1 spg cell의 성장 및 증식에 미치는 영향을 측정한 결과 숙지황 추출물은 GC-1 spg cell에 대하여 농도 의존적으로 생존율을 증가시켰음이 관찰되었다. 숙지황의 5, 10, 50, 100 pg/ml의 농도에서 GC-1 spg cell 의 생존율은 각각 1094 117.
- 이상의 실험결과 熟地黃은 GC-1 cell에 대한 생존율을 증가하는 효과가 있으며, DPPH radical 소거 활성과 hydrogen peroxide에 의해 유발된 GC-1 cell 의 산화 스트레스에 대한 항산화효과에서 유의한 결과가 나타났으며, hydrogen peroxide에 의한 LPO 함량에 미치는 변화에서 지질과산화물의 생성을 억제하였다. 이로써 熟地黃은 산화물질로부터 남성 생식세포를 보호하는 기전을 통하여, 남성 불임의 치료에 응용될 수 있는 약물임이 확인되었다.
후속연구
- 이로써 熟地黃은 산화물질로부터 남성 생식세포를 보호하는 기전을 통하여, 남성 불임의 치료에 응용될 수 있는 약물임이 확인되었다.
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