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문제 정의
- 항생제에 대한 내성을 가진 병원균이 점차 늘어가고 있는 현실에서 천연물질을 치의학분야에서도 구강위생제품이나 임상에 이용할 수 있다면 매우 바람직 할 것으로 사료된다. 본 연구는 대표적 구강질환인 치아우식증과 치주질환의 원인균들에 대한 편백 피톤치드의 항균효과를 관찰하였다.
- 최근 천연 추출물의 활용성에 대한 이해가 넓어지고 연구가 활성화 되면서 결과물의 이용방안을 다양하게 모색하고 있다. 본 연구는 편백나무에서 추출한 휘발성 정유인 피톤치드를 치의학분야에 활용하고자 치아우식증 원인균인 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus, 급진성 치주염에 관련된 Actinobacillus actinomycetemcomitans에 대한 항균 효과를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 그러나 아직 구강미생물에 대한 편백 피톤치드의 항균효과는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 편백 피톤치드를 치과영역에 활용할 수 있는 지에 대한 가능성을 타진하기 위하여, 치아우식증 원인균인 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus, 급진성 치주염에 특이적으로 관련된 세균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans에 적용시킴으로써 피톤치드의 항균효과를 관찰하였다.
제안 방법
- 각 실험균주에 관한 피톤치드의 항균효과가 살균작용에 의한 것인지를 확인하고, 최소살균농도(minimum bactericidal concentration; MBC)를 결정하기 위하여 생균수를 측정하였다. 즉, 위에서와 같이 배양된 실험균주(흡광도 0.
- 각 실험균주에 대한 피톤치드의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)를 측정하기 위해, 우선 실험균주를 24시간 배양한 후 배양 균액의 일정액을 새 BHI 액체배지에 접종하여 McFarland #1 흡광도의 1/2 농도, 즉 10 ㎖ 액체배지의 흡광도가 0.1(600 ㎚)이 되도록 균액 농도를 조정한 후 피톤치드를 0～1.0%(vol/vol) 첨가하였다. 실험 균주가 접종된 BHI 액체배지를 각 실험균주의 배양 조건에 따라 24시간 배양한 후 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 항생제 감수성 검사에 앞서 예비실험을 통해 disc 환산법으로 나타난 억제환(inhibition zone)의 크기가 20～40 ㎜ 정도가 되어 관찰하고 측정하기 용이하도록 항생제 농도를 미리 결정하였다. 다음, 멸균된 8 ㎜직경의 paper disc에 항생제 용액을 20 ㎕씩 적하하여각 paper disc 당 항생제 농도가 위에서 결정한 적정농도, 즉 amoxicillin 5 ㎍, ampicillin 5 ㎍, cefotaxime 15 ㎍, penicillin 5 ㎍, tetracycline 15 ㎍이 되도록 최종농도를 조절하였다. 항생제 용액이 적하된 paper disc는 50℃ 배양기에서 무균상태로 건조시켰다.
- 집락이 200개 정도로 나타난 한천배지를 선택하여 집락수를 센 다음, 이 배지에 도말했던 균액의 희석배수를 역산하여 균액 원액 100 ㎕당 생균수를 계산하였다. 생균수를 측정하여 대조군에 비해 사멸된 균수가 99.9%를 넘는 피톤치드의 최소 농도를 MBC로 결정하였다.13-b)
- 1로 나타난 실험군을 항생제 감수성 검사 대상으로 선택하였다. 선택된 실험군의 배양 균액을 100 ㎕씩 BHI 한천배지에 도말한 다음 적정농도의 항생제 disc를 올려놓은 상태로 37℃에서 48시간 배양한 후 항생제 disc 주변에 형성된 억제환의 직경을 측정하였다. 한편, 피톤치드가 첨가되지 않은 상태로 각 실험균주를 24시간 배양한 후 새 BHI 액체배지를 혼합하여 배양 균액의 흡광도를 0.
- 0%(vol/vol) 첨가하였다. 실험 균주가 접종된 BHI 액체배지를 각 실험균주의 배양 조건에 따라 24시간 배양한 후 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 0.
- BHI 한천배지에 희석균액 100 ㎕를 적하하고나서 무균처리된 삼각유리막대로 한천배지 위에 균일하게 도말한 후 각 실험균주의 배양조건에 따라 24시간 배양하였다. 집락이 200개 정도로 나타난 한천배지를 선택하여 집락수를 센 다음, 이 배지에 도말했던 균액의 희석배수를 역산하여 균액 원액 100 ㎕당 생균수를 계산하였다. 생균수를 측정하여 대조군에 비해 사멸된 균수가 99.
- 편백 피톤치드가 세포막에 변화를 초래할 수 있는지를 알아보고, 임상적으로는 피톤치드에 의해 항생제의 항균효과가 상승할 수 있는 지를 항생제 감수성 검사로 관찰하였다(Table 5, 6, 7). S.
- 편백 피톤치드에 노출된 실험균주들을 BHI 한천배지에 도말하여 생균수를 측정함으로써 편백 피톤치드가 살균작용을 하는 지 관찰하였다. S.
- 피톤치드를 첨가하고 배양한 실험균주를 대상으로 하여 disc 확산법으로 항생제 감수성 검사를 시행한 후 형성된 항생제 disc의 억제환 크기를 피톤치드를 첨가하지 않고 배양한 대조군 실험균주를 사용했을 때에 형성된 억제환 크기와 비교함으로써 피톤치드가 실험균주의 항생제 감수성에 변화를 유도하는 지 관찰하였다. 피톤치드가 첨가되어도 S.
- 피톤치드와 함께 배양한 각 실험균주를 BHI 한천배지에 도말한 다음 형성된 생균수를 측정함으로써 피톤치드의 MBC를 결정하였다. 피톤치드를 첨가하지 않고 24시간 배양한 대조군 S.
- 피톤치드와 함께 배양한 실험균주를 BHI 액체배지에 접종하고 배양한 다음 배양 균액의 흡광도를 측정해 피톤치드의 항균효과를 관찰하였다(Table 1). S.
- 선택된 실험군의 배양 균액을 100 ㎕씩 BHI 한천배지에 도말한 다음 적정농도의 항생제 disc를 올려놓은 상태로 37℃에서 48시간 배양한 후 항생제 disc 주변에 형성된 억제환의 직경을 측정하였다. 한편, 피톤치드가 첨가되지 않은 상태로 각 실험균주를 24시간 배양한 후 새 BHI 액체배지를 혼합하여 배양 균액의 흡광도를 0.1로 조정한 다음 100 ㎕씩 도말한 BHI 한천배지를 항생제 감수성 검사를 위한 대조군으로 사용하였다.
- 피톤치드에 노출된 실험균주의 항생제에 대한 감수성 변화, 즉 피톤치드에 의한 항생제의 항균상승효과를 관찰하기 위하여 disc 확산법을 시행하였다. 항생제 감수성 검사에 앞서 예비실험을 통해 disc 환산법으로 나타난 억제환(inhibition zone)의 크기가 20～40 ㎜ 정도가 되어 관찰하고 측정하기 용이하도록 항생제 농도를 미리 결정하였다. 다음, 멸균된 8 ㎜직경의 paper disc에 항생제 용액을 20 ㎕씩 적하하여각 paper disc 당 항생제 농도가 위에서 결정한 적정농도, 즉 amoxicillin 5 ㎍, ampicillin 5 ㎍, cefotaxime 15 ㎍, penicillin 5 ㎍, tetracycline 15 ㎍이 되도록 최종농도를 조절하였다.
- 실험 균주가 접종된 BHI 액체배지를 각 실험균주의 배양 조건에 따라 24시간 배양한 후 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 0.050 이하로 측정되는 균 배양액에 첨가된 피톤치드의 농도를 그 실험균주에 대한 MIC로 결정하였다.13-a)
- 희석 균액을 다시 100 ㎕ 취하여 인산완충생리식염수가 900 ㎕ 담긴 새 1.5 ㎖ microcentrifuge tube에 넣고 vortex하는 과정을 반복하여 10-0∼10-8까지 단계희석하였다.
대상 데이터
- 항생제 용액이 적하된 paper disc는 50℃ 배양기에서 무균상태로 건조시켰다. MIC 측정실험에서 피톤치드를 첨가하고 24시간 배양한 후 각 실험균주의 배양 균액의 흡광도가 0.1로 나타난 실험군을 항생제 감수성 검사 대상으로 선택하였다. 선택된 실험군의 배양 균액을 100 ㎕씩 BHI 한천배지에 도말한 다음 적정농도의 항생제 disc를 올려놓은 상태로 37℃에서 48시간 배양한 후 항생제 disc 주변에 형성된 억제환의 직경을 측정하였다.
- S. mutans GS5와 S. sobrinus 6715는 brain heart infusion (BHI; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 액체배지와 Micro agar (DUCHEFA BIOCHEMIE, Netherlands)가 첨가된 BHI 한천배지에 37℃에서 혐기적(85% N2, 10% CO2, 5% H2)으로 배양하였다. A.
- 실험에 사용할 균주로 S. mutans GS5, S. sobrinus 6715, A. actinomycetemcomitans Y4를 사용하였다. 항균실험에 사용된 피톤치드는 편백나무(Chamaecyparis obtusa Sieb.
- actinomycetemcomitans Y4를 사용하였다. 항균실험에 사용된 피톤치드는 편백나무(Chamaecyparis obtusa Sieb. et Zucc.)에서 추출한 정유로서 (주)SH제약에서 구입하였다.
이론/모형
- 피톤치드에 노출된 실험균주의 항생제에 대한 감수성 변화, 즉 피톤치드에 의한 항생제의 항균상승효과를 관찰하기 위하여 disc 확산법을 시행하였다. 항생제 감수성 검사에 앞서 예비실험을 통해 disc 환산법으로 나타난 억제환(inhibition zone)의 크기가 20～40 ㎜ 정도가 되어 관찰하고 측정하기 용이하도록 항생제 농도를 미리 결정하였다.
성능/효과
- 1) 치주염은 치태를 구성하고 있는 복잡한 세균군, 즉 혼합감염에 대한 치아 주변조직의 반응에 따른 염증진행에 의하여 야기된다.2) 모든 성인의 약 70～80%가 치주염으로 고통 받고 있으며, 만성 치주염은 이 모든 치주질환의 약 59%를 차지하고 있다.
- 1. Streptococcus mutans GS5에 대한 피톤치드의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC)는 0.5%, Streptococcus sobrinus에 대해서는 1%, Actinobacillus actinomycetemcomitans에 대해서는 0.2%였다.
- 1) 치주염은 치태를 구성하고 있는 복잡한 세균군, 즉 혼합감염에 대한 치아 주변조직의 반응에 따른 염증진행에 의하여 야기된다.2) 모든 성인의 약 70～80%가 치주염으로 고통 받고 있으며, 만성 치주염은 이 모든 치주질환의 약 59%를 차지하고 있다. 발현빈도와 심도는 연령증가에 따라 커지고, 급진성 치주염의 유년형은 사춘기의 시작과 함께 나타나 활성기와 휴지기를 거치면서 비교적 급속하게 진행된다.
- 2. Streptococcus mutans GS5에 대한 피톤치드의 최소살균농도(minimum bactericidal concentration; MBC)는 0.5%, Streptococcus sobrinus 6715는 2%로 측정되었고, Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4에 대한 피톤치드의 MBC는 0.2%로 측정되었다.
- 3) 급진성 치주염환자 중 많은 사람들이 화학주성 자극에 대한 반응이 약한 다형핵백혈구를 가지고 있다. 이러한 결핍은 혐기성 그람음성 구간균인 A.
- actinomycetemcomitans가 특이적으로 관련되어 있는 것으로 보인다.3,25) 본 연구에서 편백 피톤치드는 A. actinomycetemcomitans에 대해 항균효과가 있는 것으로 관찰되었고 MIC와 MBC는 모두 0.2%로 S. mutans와 S. sobrinus에 대한 항균효과보다 높게 나타났다(Table 1, 2). 정유는 광범위한 항균효과를 갖고 있는데 일반적으로 그람음성 세균보다는 그람양성 세균에 대해 효과가 큰 것으로 알려져 있다26,27).
- 3. 피톤치드에 노출된 실험균주에 대한 항생제 감수성 실험에서 피톤치드를 적용했을 경우, Streptococcus mutans GS5와 Streptococcus sobrinus 6715는 ampicillin에 대한 감수성이 유의성 있게 증가하였다. Streptococcus sobrinus 6715의 경우는 penicillin과 amoxicillin에 대한 감수성도 피톤치드에 의해 유의성 있게 증가하였다.
- 24%였다. MIC 농도인 0.2%로 피톤치드가 첨가되면 생균수가 크게 감소하여 100 ㎕당 94개에 불과하여 거의 모두 사멸(99.9% 이상)한 것으로 나타남으로써 0.2%를 MBC 농도로 결정하였다. 피톤치드의 농도를 높여 0.
- 편백 피톤치드에 노출된 실험균주들을 BHI 한천배지에 도말하여 생균수를 측정함으로써 편백 피톤치드가 살균작용을 하는 지 관찰하였다. S. mutans와 S. sobrinus 모두 편백 피톤치드에 사멸되었으며 MBC는 각각 0.5, 2%로 결정되었다(Table 2). MIC의 경우와 마찬가지로 편백 피톤치드는 Takarada 등13-a) 이 사용한 정유 중에서 manuka 정유를 제외한 나머지 정유와 같거나 보다 강한 살균력을 갖고 있는 것으로 나타났다.
- sobrinus 6715를 대상으로 관찰하였다. 그 결과, manuka 정유를 제외한 정유들은 1% 이상의 농도에서 MIC가 결정되었기 때문에 직접적인 비교는 불가능하지만 편백 피톤치드는 이들 정유보다 훨씬 강한 항균효과를 갖는 것으로 판단된다.
- Nguefack 등38)도 일부 정유들이 Listeria, Staphylococcus의 세포막 투과성을 높여준다고 보고하였다. 본 연구결과는 피톤치드를 첨가하고 24시간 배양한 균액의 일부를 항생제 감수성 검사용 한천배지에 도말한 상태에서 항생제 disc를 올려놓고 추가로 48시간 배양해서 얻은 것이기 때문에 피톤치드에 의해 이미 사멸된 균은 항생제 감수성 검사에서 배제된 상태였다. 따라서 억제환의 크기가 증가하였다는 것은 살아있는 세균이지만 이미 세포막에 변화가 있었기 때문에 나타난 결과라고 볼 수 있다.
- 본 연구결과로 미루어 볼 때, 편백 피톤치드의 항균력은 구강감염질환에 중요한 그람 양성세균과 그람 음성세균에 모두 유효하게 작용하며, 편백 피톤치드를 이용한 직접적인 살균작용 뿐만 아니라 항생제의 항균효과를 상승시킬 수 있음을 보여주었다. 따라서 천연물질인 피톤치드를 이용하여 구강질환을 일으키는 원인균에 대한 직접적인 항균작용을 기대할 수 있는 항균제 개발이 가능할 것으로 보인다.
- 이상의 결과로, 편백 피톤치드 정유는 치아우식증 원인균인 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus, 급성 치주염 원인균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans에 대한 살균효과가 있을 뿐만 아니라 이들 균의 항생제 감수성을 높이는 것으로 판단된다.
- 피톤치드 첨가량이 1%일 때 생균수는 2.90 × 106 이었고 2%일 때 생균수는 100 ㎕에 945개로 거의 모두 사멸(99.9% 이상)하였다.
- 피톤치드가 없을 때 억제환의 크기가 33.7 ㎜이었으나 피톤치드와 함께 배양했을 때 형성된 억제환의 크기는 35.3 ㎜로 유의성(P<0.025)이 있는 증가를 보였다(Table 6).
- 피톤치드를 첨가하지 않고 24시간 배양한 대조군 A. actinomycetemcomitans Y4의 생균수는 100 ㎕당 8.19 × 108 이었고, 피톤치드의 첨가량이 0.05%일 때 생균수가 5.93 × 107로 생존율은 7.24%였다.
- 피톤치드를 첨가하지 않고 24시간 배양한 대조군 S. mutans GS5의 생균수는 100 ㎕당 4.14 × 107이었으나, 피톤치드와 함께 배양했을 때는 생균수가 크게 줄어 피톤치드 첨가량이 0.5%일 때 생균수는 100 ㎕에 단지 75개로 거의 완전히 사멸(99.9% 이상)하였다.
- 피톤치드를 첨가하지 않고 배양한 대조군 S. sobrinus에 대한 penicillin 억제환의 크기는 26.0 ㎜, 피톤치드를 첨가하고 배양한 S. sobrinus를 사용했을 때는 28.7 ㎜로 유의성이 있는 증가를 보였다(P<0.017).
- 22,23) 따라서 사람의 치아우식증에 중요한 원인인 이들 두 세균에 대해 피톤치드가 항균효과가 있다는 것은 고무적인 결과이다. 피톤치드에 대한 감수성은 S. sobrinus보다는 S. mutans가 높게 나타났다. 같은 S.
- 826이었다. 피톤치드의 첨가량을 증가시키면 점차적으로 흡광도가 감소하여 피톤치드가 0.2% 첨가되었을 때 흡광도는 0.035로 나타나 A. actinomycetemcomitans Y4에 대한 피톤치드의 MIC는 0.2%로 결정되었다.
후속연구
- 그러므로 본 연구는 천연물질인 피톤치드가 구강질환 유발균에 대한 항균효과를 나타내었으며, 향후 본 연구에서 관찰된 유효 농도를 세분화하여 추가적인 연구를 시행하고 독성검사와 임상검사를 거쳐 천연물질의 장점을 살린 인체에 부작용이 없는 약제의 개발에 도움이 될 것으로 사료된다.
- 본 연구결과로 미루어 볼 때, 편백 피톤치드의 항균력은 구강감염질환에 중요한 그람 양성세균과 그람 음성세균에 모두 유효하게 작용하며, 편백 피톤치드를 이용한 직접적인 살균작용 뿐만 아니라 항생제의 항균효과를 상승시킬 수 있음을 보여주었다. 따라서 천연물질인 피톤치드를 이용하여 구강질환을 일으키는 원인균에 대한 직접적인 항균작용을 기대할 수 있는 항균제 개발이 가능할 것으로 보인다. 한편, 화학적 항생제의 장기간 사용으로 인해 자주 출현하는 항생제 내성 병원균들에 대해서도 피톤치드를 사용함으로써 직접적인 항균효과를 기대하거나 항생제를 소량 투여하는 대신 피톤치드를 병용하여 충분한 항균효과를 얻어 결과적으로 항생제 사용을 감소시키는 방법도 가능해질 것으로 생각된다.
- 35,36,37) 그러나 정유가 세균 세포의 생활력에 관련된 물질 또는 과정을 억제하여 균이 사멸함으로써 생기는 일련의 현상으로 세포막이 손상되고 용해현상이 나타날 수 있는 가능성도 배제할 수 없다. 사멸에 따른 용해현상과 세포막에 직접적인 손상이 온 다음에 사멸되고 결과적으로 세포질 내용물이 유리되면서 용해되는 현상을 구별하기는 쉽지 않기 때문에 앞으로 보다 면밀히 피톤치드의 항균기전, permeabilizing 효과에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 천연물질인 피톤치드를 이용하여 구강질환을 일으키는 원인균에 대한 직접적인 항균작용을 기대할 수 있는 항균제 개발이 가능할 것으로 보인다. 한편, 화학적 항생제의 장기간 사용으로 인해 자주 출현하는 항생제 내성 병원균들에 대해서도 피톤치드를 사용함으로써 직접적인 항균효과를 기대하거나 항생제를 소량 투여하는 대신 피톤치드를 병용하여 충분한 항균효과를 얻어 결과적으로 항생제 사용을 감소시키는 방법도 가능해질 것으로 생각된다.
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