돼지의 내인성 레트로 바이러스인 PERV의 존재는 돼지의 무균 사육을 통해서도 제거할 수 없으며, 장기 이식 시 인수 공통 감염의 위험성을 내포하고 있으므로, 이종 간 장기 이식 시 면역 거부 반응과 더불어 해결해야 할 가장 큰 문제점 중의 하나이다. 본 연구에서는 국내에서 사육되고 있는 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire 종을 비롯하여 국내 미니 돼지 및 제주도 토종 흑돼지에서 PERV의 존재 유무 및 종류에 대하여 확인 및 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기반 기법을 확립하였다. 사용된 모든 공시 돼지의 genomic DNA로부터 PERV- A 및 PERV-B가 모두 검출되었으며, PERV-C의 경우 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 검출되었다. 또한 PERV-A와 PERV-B의 경우 특이적 primer와 제한효소 BamHI을 이용한 PCR- RFLP를 통하여 확인할 수 있었다. 본 연구의 PERV 검출법은 이종 간 장기 이식 시 PERV에 대한 안전 검정 및 PERV의 분류 방법으로서 활용가능할 것으로 사료된다.
돼지의 내인성 레트로 바이러스인 PERV의 존재는 돼지의 무균 사육을 통해서도 제거할 수 없으며, 장기 이식 시 인수 공통 감염의 위험성을 내포하고 있으므로, 이종 간 장기 이식 시 면역 거부 반응과 더불어 해결해야 할 가장 큰 문제점 중의 하나이다. 본 연구에서는 국내에서 사육되고 있는 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire 종을 비롯하여 국내 미니 돼지 및 제주도 토종 흑돼지에서 PERV의 존재 유무 및 종류에 대하여 확인 및 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기반 기법을 확립하였다. 사용된 모든 공시 돼지의 genomic DNA로부터 PERV- A 및 PERV-B가 모두 검출되었으며, PERV-C의 경우 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 검출되었다. 또한 PERV-A와 PERV-B의 경우 특이적 primer와 제한효소 BamHI을 이용한 PCR- RFLP를 통하여 확인할 수 있었다. 본 연구의 PERV 검출법은 이종 간 장기 이식 시 PERV에 대한 안전 검정 및 PERV의 분류 방법으로서 활용가능할 것으로 사료된다.
Pigs have been considered as an ideal source of donor organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities to the human in xenotransplantation. However, for the public health risks associated with the potential for porcine endogenous retrovirus(PERV) ...
Pigs have been considered as an ideal source of donor organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities to the human in xenotransplantation. However, for the public health risks associated with the potential for porcine endogenous retrovirus(PERV) infection through xenograft from pig to human, the investigation of methods for elimination and/or control of PERV has been required. In this study we developed the detection and classification methods for PERV based on PCR using specific primers. PERV-A and PERV-B were found in all pigs including Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire, miniature pig, and Korean native black pig from Jeju by PCR with type-specific primers for PERV. However, PERV-C was detected only from Duroc, miniature pig, and Korean native black pig from Jeju. PERV-A and PERV-B could be distinguished by PCR-RFLP with BamHI. These methods for PERV will be useful in rapid screening of safe organ for xenograft, furthermore, helpful in monitoring of PERV during and after xenotransplantation.
Pigs have been considered as an ideal source of donor organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities to the human in xenotransplantation. However, for the public health risks associated with the potential for porcine endogenous retrovirus(PERV) infection through xenograft from pig to human, the investigation of methods for elimination and/or control of PERV has been required. In this study we developed the detection and classification methods for PERV based on PCR using specific primers. PERV-A and PERV-B were found in all pigs including Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire, miniature pig, and Korean native black pig from Jeju by PCR with type-specific primers for PERV. However, PERV-C was detected only from Duroc, miniature pig, and Korean native black pig from Jeju. PERV-A and PERV-B could be distinguished by PCR-RFLP with BamHI. These methods for PERV will be useful in rapid screening of safe organ for xenograft, furthermore, helpful in monitoring of PERV during and after xenotransplantation.
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문제 정의
문제점 중의 하나이다. 본 연구에서는 국내에서 사육되고 있는 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire 종을 비롯하여 국내 미니 돼지 및 제주도 토종 흑돼지에서 PERV의 존재 유무 및 종류에 대하여 확인 및 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기반 기법을 확립하였다. 사용된 모든 공시 돼지의 genomic DNA로부터 PERV- A 및 PERV-B가 모두 검출되었으며, PERV-C의 경우 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 검출되었다.
바 있다. 본 연구에서는 국내에서 사육되고 있는 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire 종을 비롯하여 국내 미니 돼지 및 제주도 토종흑돼지에서 PERV의 존재 유무 및 종류에 대하여 확인 및 검출하는 중합효소 연쇄반응(Poly- merase chain reaction; PCR) 기반 기법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
The abbreviations are: SD, splicing donor; PBS, primer binding site; SA, splicing acceptor; ppt, polypurine tract. Arrows indicate primer sets used in this study: closed arrows in pro/pol region for PERV detection(N-pol1, N-pol3, N-pol4, N-pol2 in order); closed arrows in env region for type-specific detection for PERV-A(A6F & A6R), PERV-B(B2.5F & B2R), and PERV-C(Cenv3 & Cenv4), respectively; open arrows in env region for PCR-RFLP(PERV-F &PERV-R).
3.Detection of PERV by PCR with type-specific primer sets(A6F & A6R for PERV-A, B2.5F & B2R for PERV-B, and Cenv3 & Cenv4 for PERV-C) and pol primer set (N- pol3 & N-pol4) from genomic DNA of miniature pig, Berkshire breed, and Korean native black pig from JeJu.
5mM MgCl2, 1mM dNTPs, primer는 각각 10 pmole, 2 unit Taq (Super-Bio, Korea)을 사용하였다. PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer, USA) 을 이용하여 94 3분으로 1회 반응을 수행한 후, 94 에서 10초 간 변성반응, 45 에서 10초간 결합반응, 그리고 72 에서 10초 간 신장반응을 30회 반복하여 실시하고, 72 에서 30초간 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 증폭된 산물은 3차 멸균수를 이용하여 1,000배 희석한 후, 2ul를 취하여 2차 PCR 시 주형으로 이용하였다.
PCR에 사용된 반응물 조성은 pol 유전자 단편의 증폭의 경우와 동일하게 사용하였으며, PCR 조건은 94 3분으로 1회 반응을 수행한 후, 94 에서 10초 간 변성반응, 55 에서 10초간 결합반응, 그리고 72 에서 10초 간 신장반응을 30회 반복하여 실시하고, 72 에서 30초간 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 증폭된 산물은 3% 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
제작된 primer의 염기서열은 Table 1과 같다. PCR에 사용된 반응물의 조성은 pol 유전자 단편의 증폭의 경우와 동일하게 사용하였으며, PCR 조건은 94 3분으로 1회 반응을 수행한 후, 94 에서 10초 간 변성반응, PERV-A와 PERV-B의 경우는 55 에서, PERV-C의 경우는 58 에서 10초 간 결합반응, 그리고 72 에서 10초 간 신장반응을 30회 반복하여 실시하고, 72 에서 30초 간 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 증폭된 산물은 3% 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
pol 유전자 단편의 증폭에서와 마찬가지로, PK15 세포에서 추출한 genomic DNA와 PK15 세포 배양액에서 분리한 바이러스의 RNA를 이용하여 각각의 PCR을 통한 PERV 분류의 가용성을 측정하였다.
각각의 공시 시료 내에 PERV 존재 여부를 확인하기 위하여 PERV의 유전자 염기서열 중 가장 높은 상동성을 보이는 pol 유전자를 이용하여 primer를 제작하여 시험하였다(Fig. 1). 증폭의 특이성 및 효율성을 높이기 위하여 nested PCR을 수행하였으며, 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다.
돼지의 genomic DNA로부터 provirus 상태로 존재하는 PERV를 검출하기 위하여, PERV의 유전자 염기 서열 중 가장 보존이 잘 되어 있는 pol 유전자 부위를 선정하여 이에 특이적인 primer를 제작하였으며, 또한 특이성을 높여서 위양성(false positive)을 배제하기 위하여 nested PCR을 수행하였다. 선정된 primer의 가용성을 측정하기 위하여 PERV가 발현되는 세포주로 알려진 돼지 신장 유래 PK15 세포주(Patience 등, 1997)를 이용하여 실험을 수행하여 본 결과, 본 연구에서 사용한 primer로 PK15에서 PERV를 검출할 수 있음을 확인하였다(Fig.
증폭의 특이성 및 효율성을 높이기 위하여 nested PCR을 수행하였으며, 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다. 먼저 N-pol1과 N-pol2 를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후, N-pol3와 N-pol4를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 각 PCR 반응에는 50ng genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, 1차 PCR 반응에 사용된 반응물은 반응 완충액 내 1.
미니 돼지와 제주 토종 흑돼지는 혈액을 채취하여 Ficoll gradient 방법 (이 등, 2004)에 의하여 Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)를 분리하고, 이를 국내 돼지에서 사용한 방법과 동일하게 genomic DNA를 추출하여 실험에 사용하였다.
본 연구에서는 PERV-A, PERV-B 및 PERV-C 각각에 특이적인 primer를 작성하여, 각 종류를 구분할 수 있는 최적의 PCR 조건을 수립하였다. pol 유전자 단편의 증폭에서와 마찬가지로, PK15 세포에서 추출한 genomic DNA와 PK15 세포 배양액에서 분리한 바이러스의 RNA를 이용하여 각각의 PCR을 통한 PERV 분류의 가용성을 측정하였다.
조사된 각 PERV의 특이적인 염기서열들을 이용하여 RFLP에 의한 PERV 분류법을 구축하였다. PERV-A와 PERV-B를 모두 증폭할 수 있는 primer(PERV-F 및 PERV-R)를 이용하여 PCR 반응을 수행 한 후 제한효소 BamHI에 의한 RFLP 결과, PERV-A는 절단이 일어나서 81 bp와 420 bp로 나눠지게 되고, PERV-B는 절단이 일어나지 않아 557 bp를 유지하였다(Fig.
2차 반응의 PCR 조건은 94 에서 10초 간 변성반응, 68 에서 10초간 결합반응, 그리고 72 에서 10초 간 신장반응을 30회 반복하여 실시하고, 72 에서 30초간 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 증폭된 산물은 3% 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
증폭된 산물은 3% 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. 증폭된 산물은 PCR clean-up kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 정제 한 후, 5 unit 의 BamHI(Takara, Japan)을 37 에서 6시간 처리 한 후, 3% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
1). 증폭의 특이성 및 효율성을 높이기 위하여 nested PCR을 수행하였으며, 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다. 먼저 N-pol1과 N-pol2 를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후, N-pol3와 N-pol4를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다.
대상 데이터
먼저 N-pol1과 N-pol2 를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후, N-pol3와 N-pol4를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 각 PCR 반응에는 50ng genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, 1차 PCR 반응에 사용된 반응물은 반응 완충액 내 1.5mM MgCl2, 1mM dNTPs, primer는 각각 10 pmole, 2 unit Taq (Super-Bio, Korea)을 사용하였다. PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer, USA) 을 이용하여 94 3분으로 1회 반응을 수행한 후, 94 에서 10초 간 변성반응, 45 에서 10초간 결합반응, 그리고 72 에서 10초 간 신장반응을 30회 반복하여 실시하고, 72 에서 30초간 반응시킨 후 반응을 종결하였다.
같다. 경기도 K 종돈 농장에서 사육되고 있는 York- shire종 5두와 Landrace종 5두 그리고, 충남 C 종돈장에서 사육하고 있는 Duroc종 5두 그리고 Berkshire종 5두를 이용하였으며, 국내 미니 돼지는 경기도 평택 소재 PWG Genetics Korea 회사로부터 제공 받은 두 종류의 무균 돼지 (M149, T1111)를, 제주 토종 흑돼지는 제주 농가에서 10두를 선정하여 이용하였다.
국내 재래 돼지는 모발을 채취하여 4 저온 상태로 유지하여 실험실로 운송 한 후, QIAamp Mini Kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하고 종별로 pooling하여 실험에 이용하였다. 미니 돼지와 제주 토종 흑돼지는 혈액을 채취하여 Ficoll gradient 방법 (이 등, 2004)에 의하여 Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)를 분리하고, 이를 국내 돼지에서 사용한 방법과 동일하게 genomic DNA를 추출하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
PERV env 유전자 염기서열에서 PERV의 각 종류 별 특이적인 염기서열 부분이 있는데, 이 부분은 모두 숙주 세포의 수용체와 결합하는 receptor binding domain에 위치함을 알 수 있었다. 조사된 각 PERV의 특이적인 염기서열들을 이용하여 RFLP에 의한 PERV 분류법을 구축하였다.
PERV pol 유전자 특이적인 primer를 이용한 PCR을 통하여 본 연구에서 사용된 공시 돼지 모두에서 PERV가 검출됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 이는 사용된 primer와 방법은 다르지만, 기존에 본 연구실에서 보고한 국내 돼지에 존재하는 PERV의 분포에서 모든 돼지에서 PERV를 발견할 수 있었던 것과 동일한 결과로서, 돼지 내에 PERV가 광범위하게 존재함을 알 수 있다(김 등, 2004).
조사된 각 PERV의 특이적인 염기서열들을 이용하여 RFLP에 의한 PERV 분류법을 구축하였다. PERV-A와 PERV-B를 모두 증폭할 수 있는 primer(PERV-F 및 PERV-R)를 이용하여 PCR 반응을 수행 한 후 제한효소 BamHI에 의한 RFLP 결과, PERV-A는 절단이 일어나서 81 bp와 420 bp로 나눠지게 되고, PERV-B는 절단이 일어나지 않아 557 bp를 유지하였다(Fig. 5). 본 연구에서 사용한 모든 공시 동물의 genomic DNA에서 이러한 방법으로 PERV-A와 PERV-B 가 존재함을 확인할 수 있었다.
3에서 보는 바와 같이 무균돼지에서는 세 가지 종류의 PERV가 모두 검출됨을 확인할 수 있었다. PERV에 대한 보다 정확한 정량 분석을 위해서는 real time PCR 등의 측정 방법이 필요하나, 본 연구에서 정성적인 분석을 통하여서는 PERV-A가 가장 강하게 검출되었으며, 그 다음으로 PERV-B였으며, 상대적으로 PERV-C는 매우 약하게 검출됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 연구진이 PERV env 유전자의 클로닝 실험을 통하여 분포도를 조사해 본 결과, PERV-A: PERV-B:PERV-C의 비율이 53:46:1로 나온 결과와 부합하는 것으로 사료된다(Lee 등, 2006).
각 종류의 PERV에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 수행한 결과, PK15 세포에서는 PERV-A와 PERV-B만 검출되고, PERV-C는 검출할 수 없었다(Fig. 2). 본 결과는 기존 Clemen- ceau 등(2002)에 의하여 보고된 바와 동일한 것으로 사료된다.
2). 검출의 감수성(sensitivity)을 확인하기 위하여 PK15 세포 각각 1, 3, 5, 10개를 직접 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과, 세포 1개부터 PERV 의 존재를 검출 할 수 있음을 확인 하였다(data not shown).
국내 돼지에서의 PERV 분류 결과는 Fig. 3에서 보는 바와 같이 무균돼지에서는 세 가지 종류의 PERV가 모두 검출됨을 확인할 수 있었다. PERV에 대한 보다 정확한 정량 분석을 위해서는 real time PCR 등의 측정 방법이 필요하나, 본 연구에서 정성적인 분석을 통하여서는 PERV-A가 가장 강하게 검출되었으며, 그 다음으로 PERV-B였으며, 상대적으로 PERV-C는 매우 약하게 검출됨을 확인할 수 있었다.
사용된 모든 공시 돼지의 genomic DNA로부터 PERV- A 및 PERV-B가 모두 검출되었으며, PERV-C의 경우 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 검출되었다. 또한 PERV-A와 PERV-B의 경우 특이적 primer와 제한효소 BamHI을 이용한 PCR- RFLP를 통하여 확인할 수 있었다. 본 연구의 PERV 검출법은 이종 간 장기 이식 시 PERV에 대한 안전 검정 및 PERV의 분류 방법으로서 활용 가능할 것으로 사료된다.
이는 사용된 primer와 방법은 다르지만, 기존에 본 연구실에서 보고한 국내 돼지에 존재하는 PERV의 분포에서 모든 돼지에서 PERV를 발견할 수 있었던 것과 동일한 결과로서, 돼지 내에 PERV가 광범위하게 존재함을 알 수 있다(김 등, 2004). 또한 새로이 도입된 primer는 reverse transcriptase (RT)-PCR을 통하여 돼지 PK15 세포 배양액 또는 혈액 속에 존재하는 RNA 상태의 바이러스 또한 검출할 수 있었다(Fig. 2).
본 연구에서 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire, 국내 미니돼지 및 제주 토종 흑돼지의 genomic DNA를 시료로 하여, PERV-C에 특이적인 primer를 이용하여 PERV-C의 존재 여부를 확인한 결과, 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Berkshire, Landrace, Yorkshire에서는 PCR 산물이 나타나지 않았으나, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 확인되었다(Fig. 4). 이와 같은 차이가 품종 간의 차이인지, 아니면 개체 간의 차이인지에 대해서는 본 연구를 통해서는 확인할 수 없었으며, 이를 위해서는 각 품종에 대하여 보다 많은 개체에 대한 실험과 분석이 필요하리라 사료된다.
5). 본 연구에서 사용한 모든 공시 동물의 genomic DNA에서 이러한 방법으로 PERV-A와 PERV-B 가 존재함을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 국내에서 사육되고 있는 Berkshire, Duroc, Landrace, Yorkshire 종을 비롯하여 국내 미니 돼지 및 제주도 토종 흑돼지에서 PERV의 존재 유무 및 종류에 대하여 확인 및 검출하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기반 기법을 확립하였다. 사용된 모든 공시 돼지의 genomic DNA로부터 PERV- A 및 PERV-B가 모두 검출되었으며, PERV-C의 경우 음성대조구인 PK15 세포에서의 결과와 비교했을 때, Duroc종에서 매우 낮은 양의 PCR 산물이, 국내 미니돼지와 제주 토종 흑돼지에서는 상대적으로 높은 양의 PCR 산물이 검출되었다. 또한 PERV-A와 PERV-B의 경우 특이적 primer와 제한효소 BamHI을 이용한 PCR- RFLP를 통하여 확인할 수 있었다.
수행하였다. 선정된 primer의 가용성을 측정하기 위하여 PERV가 발현되는 세포주로 알려진 돼지 신장 유래 PK15 세포주(Patience 등, 1997)를 이용하여 실험을 수행하여 본 결과, 본 연구에서 사용한 primer로 PK15에서 PERV를 검출할 수 있음을 확인하였다(Fig. 2). 검출의 감수성(sensitivity)을 확인하기 위하여 PK15 세포 각각 1, 3, 5, 10개를 직접 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과, 세포 1개부터 PERV 의 존재를 검출 할 수 있음을 확인 하였다(data not shown).
후속연구
PERV-C의 정량적 분석을 위해서는 real time PCR 등의 방법이 도입되어야 할 것으로 사료되나, 본 연구에서 사용된 PERV-C 특이적인 primer를 사용하여 정성적으로 PERV-C의 존재 여부를 확인하는 데는 어려움이 없을 것으로 사료된다.
또한 PERV-A와 PERV-B의 경우 특이적 primer와 제한효소 BamHI을 이용한 PCR- RFLP를 통하여 확인할 수 있었다. 본 연구의 PERV 검출법은 이종 간 장기 이식 시 PERV에 대한 안전 검정 및 PERV의 분류 방법으로서 활용 가능할 것으로 사료된다.
현재진행 되고 있는 PERV 제어 방법에는 siRNA에의한 PERV의 제어(Karlas 등, 2004; Miyagawa 등, 2005), PERV가 적은 돼지 품종을 육종을 통하여 제거 하는 법 등 다양한 방법으로 접근이 이루어지고 있다. 본 연구진이 개발한 PCR 을 이용한 PERV의 검출 및 각 종류(PERV-A, PERV-B 및 PERV-C) 별 검출 방법은 효율적으로 PERV를 제어하는 시스템 개발 및 PERV 감염의 검색 등에 있어서 기본적인 방법으로 활용될 수 있으리라 사료된다.
4). 이와 같은 차이가 품종 간의 차이인지, 아니면 개체 간의 차이인지에 대해서는 본 연구를 통해서는 확인할 수 없었으며, 이를 위해서는 각 품종에 대하여 보다 많은 개체에 대한 실험과 분석이 필요하리라 사료된다.
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