퇴행성 뇌질환의 하나인 알츠하이머는 가벼운 기억력의 장애에서부터 전반적인 인지기능의 장애를 나타내는 질환으로 해마 (hippocampus)를 포함한 신경세포에서 세포사와 관련이 있는 것으로 보고 되어왔다. AP의 자체 독성과 산화 스트레스, $A{\beta}$ plaque에서 나오는 free radical은 세포내 $Ca^{2+}$를 높이고 이로 인해 calpain이 활성화되어 신경 세포사가 촉진되며 microtubule과 같은 cytoskeleton을 파괴시킨다. 이러한 ROS와 $A{\beta}$에 의해 유도되는 세포사멸을 보호하는 물질을 해바라기 씨 추출물을 이용하여 실험을 실시하였다. 우선 추출물이 항산화 효과 (DPPH, FRAP assay), acetylcholinesterase(AChE)의 활성 및 SH-SY5Y cell의 세포사멸에 미치는 영향을 검토하였다. 항산화 활성과 AChE에 대한 억제활성은 해바라기 씨 추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. $H_2O_2$와 $A{\beta}$에 의해 유도된 SH-SY5Y에 대한 세포사멸 억제효과 실험(MTT assay)에서 해바라기 씨 추출물이 모두 높은 활성을 나타내었으므로 이의 성분분리는 뇌세포 보호를 위한 좋은 식품재료가 될 수 있다.
퇴행성 뇌질환의 하나인 알츠하이머는 가벼운 기억력의 장애에서부터 전반적인 인지기능의 장애를 나타내는 질환으로 해마 (hippocampus)를 포함한 신경세포에서 세포사와 관련이 있는 것으로 보고 되어왔다. AP의 자체 독성과 산화 스트레스, $A{\beta}$ plaque에서 나오는 free radical은 세포내 $Ca^{2+}$를 높이고 이로 인해 calpain이 활성화되어 신경 세포사가 촉진되며 microtubule과 같은 cytoskeleton을 파괴시킨다. 이러한 ROS와 $A{\beta}$에 의해 유도되는 세포사멸을 보호하는 물질을 해바라기 씨 추출물을 이용하여 실험을 실시하였다. 우선 추출물이 항산화 효과 (DPPH, FRAP assay), acetylcholinesterase(AChE)의 활성 및 SH-SY5Y cell의 세포사멸에 미치는 영향을 검토하였다. 항산화 활성과 AChE에 대한 억제활성은 해바라기 씨 추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. $H_2O_2$와 $A{\beta}$에 의해 유도된 SH-SY5Y에 대한 세포사멸 억제효과 실험(MTT assay)에서 해바라기 씨 추출물이 모두 높은 활성을 나타내었으므로 이의 성분분리는 뇌세포 보호를 위한 좋은 식품재료가 될 수 있다.
To develop an anti-dementia agent with potential therapeutic value in the protection of neuronal cells, we selected a water extract of Helianthus annuus seed for analysis. We measured acetylcholinesterase inhibitory activity in the extract, and analyzed the protective effect of the extract on neuron...
To develop an anti-dementia agent with potential therapeutic value in the protection of neuronal cells, we selected a water extract of Helianthus annuus seed for analysis. We measured acetylcholinesterase inhibitory activity in the extract, and analyzed the protective effect of the extract on neuronal cell death induced by hydrogen peroxide, or amyloid ${\beta}-peptide$, of SH-SY5Y neuroblastoma cells. The result showed that the extinct exerted protective effects of 83%, 72% and 53% respectively, on cell death induced by 100M, 200M, and 500M hydrogen peroxide. Also, when 50M of amyloid ${\beta}-peptide$ was added to the cells, the extract showed a protective effect (up to 80%) on cell death. Overall, the results showed that the H. annuus extract inhibited acetylcholinesterase activity in a dose-dependent manner, and the extract also strongly protected against cell death induced by hydrogen peroxide or amyloid ${\beta}-peptide$.
To develop an anti-dementia agent with potential therapeutic value in the protection of neuronal cells, we selected a water extract of Helianthus annuus seed for analysis. We measured acetylcholinesterase inhibitory activity in the extract, and analyzed the protective effect of the extract on neuronal cell death induced by hydrogen peroxide, or amyloid ${\beta}-peptide$, of SH-SY5Y neuroblastoma cells. The result showed that the extinct exerted protective effects of 83%, 72% and 53% respectively, on cell death induced by 100M, 200M, and 500M hydrogen peroxide. Also, when 50M of amyloid ${\beta}-peptide$ was added to the cells, the extract showed a protective effect (up to 80%) on cell death. Overall, the results showed that the H. annuus extract inhibited acetylcholinesterase activity in a dose-dependent manner, and the extract also strongly protected against cell death induced by hydrogen peroxide or amyloid ${\beta}-peptide$.
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문제 정의
2%의 저해 활성을 나타내고 있었으나, 그 외 추출물에서는 10% 이하의 활성을 나타내거나 또는 활성을 전혀 나타내지 않았다 (28). 따라서 해바라기 씨 추출물의 AChE 활성에 미치는 영향을 분석해 보았다. 그 결과 추출물의 첨가 농도가 높을수록 AChE 억제활성이 유의적으로 증가하였다(Fig.
(1920). 본 연구는 이러한 알츠하이머병의 억제를 위한 천연물질을 스크리닝하는 과정 중 해바라기 씨 추출물이 활성이 있음을 알았고 본 연구에서는 이의 활성에 초점을 맞추었다,
본 연구에서는 기존에 영양학적인 측면 이외에 이의 기능적인 측면에서의 활성을 찾을 목적으로, 먼저 해바라기 씨 추출물을 이용하여 뇌 속의 콜린성 신경전달물질인 acetylcholine의 수준을 조절하는 acetylcholinesterase 활성 억제 효과를 검토하고, H2O2 와 A0로부터 유도된 SH-SY5Y 의 세포사멸 억제 효과를 검토하였다.
더욱이 AP를 rat의 뇌에 중격 막이나 확대세포성 핵에 주사하였을 경우 신경 퇴행성을 일으키고, 콜린 작동성 표식 인자 (cholinergic marker)의 수준을 감소시킨다. 이러한 A0에 의해 유도되는 세포사멸의 회복을 조사하기 위해 본 실험에서는 인간 유래의 뇌종양세포인 SH-SY5Y에 Ap (25-35)를 농도별 MTT assay를 실시하여 해바라기 씨 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과 Aβ-35) 의 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 유의적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 Aβ를 처리했을 때 대조군에 비해 약 50%의 세포 사멸율을 나타내었다.
제안 방법
Amyloid P- peptide에 의해서 유도되는 세포 사멸을 억제할 수 있는지 상기에서 설명한 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 배 양 세포들을 96 well plate에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후 amyloid P-peptide(25-35) 단독처리와 추출물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다 배 양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay 에 의하여 측정하였다.
DPPH (l, l-Diphenyl-2-picryIhydrazyI)를 methanol에 400 11M의 농도로 녹인 DPPH solution에 추출물을 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도(Victor3, Wallac, Finland)* 측정하였다. DPPH radical 소거활성 비율 (% inhibition)은 다음과 같이 계산 (% inhibition = [人皿細- Asample / Acontrol] X 100)'을 아였 다.
MIT (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium) assay 에서 세 포 수 측정 은 cell proliferation kit I (Roche)를 사용하여 실험하였다. 이 kit는 수용성의 tetrazolium salt 를 포함하고 있으며 2-(2-methoxy-4- nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)는 살아 있는 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소 (dehydrogenases)에 의해서 크리스탈 모양의 보라색 산물 (formazan crystal)로 환원되 는데 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례하여 생성되는 formazan의 양을 560 nm에서 측정함으로써 세포의 생존율을 관찰할 수 있다.
또 superoxide 등의 radical이 생체막을 통과하지 못하는 반면 이들은 생체막을 통과할 수 있으며 , transition metal (Fe2+, Gu*)이 존재 할 때는 Fenton 반응에 의해서 반응성이 매우 큰 hydroxyl radical로 환원될 수 있으며 이러한 이유로 H2O2는 ROS로 분류된다(16). SH-SY5Y 에 대한 농도별 H2O2 따른 흐M 바라기 씨 추출물의 세포 사멸 억제를 알아보기 위해 H2O2를 농도별로 처리하여 MTT assay를 실시하였다. 먼저 농도별H2O2에 따른 세포사멸 정도를 알아보았다.
SH-SY5Y 에 대한 농도별 H2O2 따른 흐M 바라기 씨 추출물의 세포 사멸 억제를 알아보기 위해 H2O2를 농도별로 처리하여 MTT assay를 실시하였다. 먼저 농도별H2O2에 따른 세포사멸 정도를 알아보았다. 그 결과 100 yM, 200 pM, 500 pM 농도별로 H2O2를 처리한 군에서는 대조군에 비해 세포가 각각 57%, 37%, 28%의 생존율을 보여 HQz 농도가 증가함에 따라 세포사멸율도 증가한다는 것을 볼 수 있었다.
이 kit는 수용성의 tetrazolium salt 를 포함하고 있으며 2-(2-methoxy-4- nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)는 살아 있는 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소 (dehydrogenases)에 의해서 크리스탈 모양의 보라색 산물 (formazan crystal)로 환원되 는데 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례하여 생성되는 formazan의 양을 560 nm에서 측정함으로써 세포의 생존율을 관찰할 수 있다. 본 실험에서는 H2O2로 산화 스트레스를 주어서 세포사멸을 유도한 다음 세포의 생존율을 이용하여 해바라기 씨 추출물이 가지는 항산화 활성을 측정하였다. 배양 세포들을 96 well plate 에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24 시간 후 H2O2 단독처 리와 추출물을 함께 처 리하여 24 시간 동안 배양하였다.
일반 가정용 분쇄기 (blender, Sanyo, Japan)로 잘게 갈아 가루를 만든 후 분말 1 g당 증류수 1 mL를 넣고 60'C에서 24 시간 동안 추출(DWP-1800T, Separable Glass Pot, Seoul, Koiea)하였다. 추출물을 원심 분리하여 상등액만을 실험 에사용하였다.
응용하였다. 즉 96 well-plate 에 37 ℃로 보온한 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) 140 pL 가하고, 기질 용액 0.03 m acetylthiocholine iodide 10 pL, 0.01 M diothio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB)/phosphate buffer (pH 8.0) 20 11L를 각각 가하여 잘 혼합한 다음 적정 농도의 시료를 첨가하고 acetylcholinesterase를 첨가하여 효소반응을 시작하였으며 효소활성 도는 450 nm 에서 효소반응초기부터 5분 간의 흡광도 변화를 측정하여 산출하였다. 시료의 AChE 억제활성도는 시료를 가하지 않은 상태의 효소 활성도로부터 환산하였다.
항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH와 FRAP assay를 실시하였다. 먼저 DPPH (l, l-Diphenyl-2-piciylhydrazyl) 는자체가 free radical로서 517 nm에서 특징 적 인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다.
반응액 에 추출물을 혼합한 후 40분 동안 10분 간격으로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 상대비교를 하였다.
대상 데이터
Human neuroblastoma SH-SY5Y cell linee American Type Culture Collection (RockviUe, MD, USA)에서 구입하였으며, RPMI- 1640, fetal bovine serum, streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시 약들은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서, 배양조는 Coming (Rochester, NY, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 시약 중 acetylcholinesterase, acetylthiocholine iodide, diothio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), hydrogen peroxide (H2O2), P-amyloid protein(25-35)는 Sigma사(St.
본 실험에 사용된 재료인 해바라기 씨는 시내 대형 농산물 전문 유통단지(전남 함평, 국산)에서 구입하였다. Human neuroblastoma SH-SY5Y cell linee American Type Culture Collection (RockviUe, MD, USA)에서 구입하였으며, RPMI- 1640, fetal bovine serum, streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시 약들은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서, 배양조는 Coming (Rochester, NY, USA)에서 구입하였다.
Human neuroblastoma SH-SY5Y cell linee American Type Culture Collection (RockviUe, MD, USA)에서 구입하였으며, RPMI- 1640, fetal bovine serum, streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시 약들은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서, 배양조는 Coming (Rochester, NY, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 시약 중 acetylcholinesterase, acetylthiocholine iodide, diothio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), hydrogen peroxide (H2O2), P-amyloid protein(25-35)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입 하였고, cell proliferation kit Ie Roche Diagnostics Korea(Seoul, Korea)로부터, CCK-8 kit는 DOJINDO(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 실험에서의 모든 시약들은 분석용 등급 (analytical grade) 이상으로 사용하였다.
이론/모형
Acetylcholinesterase (ACaE) 의 활성은 Ellman 등의 방법 (25)을 응용하였다. 즉 96 well-plate 에 37 ℃로 보온한 0.
배 양 세포들을 96 well plate에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후 amyloid P-peptide(25-35) 단독처리와 추출물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다 배 양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay 에 의하여 측정하였다. 세포의 생존율 (%)은 상기의 계산식을 이용하여 계산하였다.
배양 세포들을 96 well plate 에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24 시간 후 H2O2 단독처 리와 추출물을 함께 처 리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 즉, 각 well에 solution I을 가해주고 다시 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazan crystal을 현미경으로 관찰하고 solution II를 가하여 37 ℃ 에서 다시 overnight 하여 용해시킨 후 microplate reader를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
배 양 세포들을 96 well plate에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후 amyloid P-peptide(25-35) 단독처리와 추출물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다 배 양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay 에 의하여 측정하였다. 세포의 생존율 (%)은 상기의 계산식을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
먼저 농도별H2O2에 따른 세포사멸 정도를 알아보았다. 그 결과 100 yM, 200 pM, 500 pM 농도별로 H2O2를 처리한 군에서는 대조군에 비해 세포가 각각 57%, 37%, 28%의 생존율을 보여 HQz 농도가 증가함에 따라 세포사멸율도 증가한다는 것을 볼 수 있었다. 다음으로 농도별 H2O2에 따른 해바라기 씨 추출물의 세포보호 능을 살펴보았다 100 11M의 H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨는 87%의 세포생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다.
이러한 A0에 의해 유도되는 세포사멸의 회복을 조사하기 위해 본 실험에서는 인간 유래의 뇌종양세포인 SH-SY5Y에 Ap (25-35)를 농도별 MTT assay를 실시하여 해바라기 씨 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과 Aβ-35) 의 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 유의적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 Aβ를 처리했을 때 대조군에 비해 약 50%의 세포 사멸율을 나타내었다. 또한 대조군의 정상 세포들이 신경돌기를 가지고 있는 것과는 이들은 부정형이었으며 세포들이 well 중앙으로 모여 엉기는 모습이 관찰되었고 처리 농도가 높을수록 이러한 경향이 뚜렷하게 나타났다.
따라서 해바라기 씨 추출물의 AChE 활성에 미치는 영향을 분석해 보았다. 그 결과 추출물의 첨가 농도가 높을수록 AChE 억제활성이 유의적으로 증가하였다(Fig. 3). Berberine 및 관련 protoberine계 화합물이 acetylcholine 수용체 Ml subtype (mAChR-Mi)에 대하여 유의성 있는 친화력을 나타내었으며(29), 별도로 시행한 여러가지 약리학적 연구결과에서도 이들 alkaloid들이 acetylcholinesterase°]| 대한 저해효과 및 각종 cholinergic recejrtor에 대하여 효능이 있는 것으로 알 수 있다30).
다음으로 농도별 H2O2에 따른 해바라기 씨 추출물의 세포보호 능을 살펴보았다 100 11M의 H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨는 87%의 세포생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 그리고 200 PM H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨 추출물은 72%의 생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 마지막으로 500 A의 H2O2를 처 리했을때는 해바라기 씨 추출물은 29%의 세포생존율을 보여 낮은 농도의 H2O2를 처리했을 때보다는 세포보호능이 적게 나타났다(Fig.
그 결과 100 yM, 200 pM, 500 pM 농도별로 H2O2를 처리한 군에서는 대조군에 비해 세포가 각각 57%, 37%, 28%의 생존율을 보여 HQz 농도가 증가함에 따라 세포사멸율도 증가한다는 것을 볼 수 있었다. 다음으로 농도별 H2O2에 따른 해바라기 씨 추출물의 세포보호 능을 살펴보았다 100 11M의 H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨는 87%의 세포생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 그리고 200 PM H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨 추출물은 72%의 생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다.
다음으로 50 pM A(3와 추출물을 함께 처 리 하여보았다. 두 추출물 중 해바라기 씨 추출물을 처리한 군에서 세포 생존율이 약 90%를 나타내어 AJP를 단독처리한 군이 50%정도의 생존율을 보이는 것이 비해 높은 사멸율 억제 효과를 나타내었다 (Fig. 5). 한편, 비교군에 사용한 melatonine Aβ에 의한 oxidative damage 와 in vitro에서 amyloid fibrils의 형성을 억제한다고 보고(31)된 바 있으며 해바라기 씨 주줄물을 처리 했을 시 melatonin을 처리 했을 때보다 더 높은 생존율을 나타내는 것을 보아 세포보호 활성이 더 높은 것을 알 수 있었다.
그 결과 Aβ-35) 의 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 유의적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 Aβ를 처리했을 때 대조군에 비해 약 50%의 세포 사멸율을 나타내었다. 또한 대조군의 정상 세포들이 신경돌기를 가지고 있는 것과는 이들은 부정형이었으며 세포들이 well 중앙으로 모여 엉기는 모습이 관찰되었고 처리 농도가 높을수록 이러한 경향이 뚜렷하게 나타났다. 다음으로 50 pM A(3와 추출물을 함께 처 리 하여보았다.
그리고 200 PM H2O2를 처리했을 때 해바라기 씨 추출물은 72%의 생존율을 보여 H2O2 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 마지막으로 500 A의 H2O2를 처 리했을때는 해바라기 씨 추출물은 29%의 세포생존율을 보여 낮은 농도의 H2O2를 처리했을 때보다는 세포보호능이 적게 나타났다(Fig. 4). 이는 너무 높은 농도의 H2O2를 쳐리했을 때는 보호하지 못하였다.
항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의해서 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 방법이다. 실험 결과, 기존의 알려진 항산화 물질인 BHT (butylated hydroxytolune, Sigma)의 DPPH radical 소거 활성 은 72%로 나타났으며, 해바라기 씨 추출물의 소거활성은 각각 43%, 47%, 54%로 나타났다. Kang 등이 밤꽃 추출물의 전자공여능을 비교한 결과 17.
6의 낮은 pH에서 ferric tripyridyltriazine (Fem-TPTZ) 복합체가 환원제에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine (Fen-TPTZ) 복합체로 될 때 흡광도를 측정하여 검색하고자 하는 화합물에 대한 환원력을 보는 것이다(26). 실험결과, 추출물 처리 농도가 높을수록, 시간이 지날수록 환원력이증가되는 것을 볼 수 있으며, BHH보다 환원력이 더 좋은 것으로 나타났다(Fig. 2).
후속연구
Tacrine, Donepezil, Rivasiigmine 등의 AChE inhibitor를 인지기능이 손상된 환자에게 투여함으로써 뇌중의 acetylcholine 함량을 증가시켰고, 이는 곧알츠하이 머 병 환자들에 게서 인지기 능과 학습 기 능의 개 선이 있었다는 많은 연구 보고가 있다. 이러한 점에서 볼 때 해바라기 씨 추출물도 in vitro에서 AChE 억제작용이 있다고 판단되나 더 자세한 성분 등은 추후 분석이 필요하다.
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