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문제 정의
- , 1991). 본 실험은 이러한 사실을 이용해 M11C 로 단구를 자극했을 때 단구로부터 TNF-α가 분비하는 지 알아보기 위해, M11C로 자극 처리한 단구의 배양액을 L929 세포와 같이 8시간 동안 배양하면서 L929 독성정도를 검사하였다. 실험결과 여러 농도 (0-2000㎍/㎖)의 M11C로 처리한 단구 배양액들을 L929세포와 배양했을 때, M11C 농도 (0- 2000㎍/㎖)에 따라 얻은 MCM이 M11C 농도증가에 따라 L929 세포의 사멸이 점점 증가하다가 M11C 200㎍/㎖로 자극해서 얻은 MCM이 최대의 L929 사멸효과를 보였다 (Fig.
- 있다는 것으로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 한국산 겨우살이 추출물 M11C (비렉틴 구성물질)가 사람의 말초혈액 단구를 활성화시켜 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)를 생산 분비하게 하는지를 규명하기 위해 실험에 이용되었다. 단구로부터 TNF-α의 생산에 있어 M11C의 효과를 알기 위해 단구를 여러 농도 (0-2000㎍/㎖)의 M11C로 0.
- 이에 본 연구는 겨우살이가 일부 한약탕제에 사용되고 있다는 점을 감안하여, 한국산겨우살이로부터 열에 약한 단백질 성분이 아닌 강한 열에 의해서도 약리효능을 지니는 물질들을 분리하여 면역학적 효능을 밝히고자 하였다. 이 목적을 위한 연구 접근 중 하나가 겨우살이 열탕추출물인 M11C가 단구세포로부터 TNF-α 분비효과를 가지고 있는지를 알기 위한 것이었다. 한국산 겨우살이 렉틴인 KML이 적혈구 응집반응을 보이는데 반해 한국산 겨우살이를 열탕 추출 후 일부 용출된 지용성 물질을 제거한 추출물인 M11C는 겨우살이 렉틴이 가지는 적혈구 응집작용을 가지지 않았다 (장 등, 2001).
- 1-5)에서 밝혔다. 이러한 TNF- α 분비가 TNF-α mRNA 유전자 발현과 어떠한 상관관계를 가지고 있는지 알기 위해 실험을 수행하였다. 실험한 결과 M11C로 단구세포를 자극했을 때 M11C 20㎍/㎖가 최대의 TNF-α mRNA 발현을 보이다가 M11C 200㎍/㎖에서는 plateau 경향을 보였다 (Fig.
- , 2003). 이에 본 연구는 겨우살이가 일부 한약탕제에 사용되고 있다는 점을 감안하여, 한국산겨우살이로부터 열에 약한 단백질 성분이 아닌 강한 열에 의해서도 약리효능을 지니는 물질들을 분리하여 면역학적 효능을 밝히고자 하였다. 이 목적을 위한 연구 접근 중 하나가 겨우살이 열탕추출물인 M11C가 단구세포로부터 TNF-α 분비효과를 가지고 있는지를 알기 위한 것이었다.
- , 1991). 이에 본 연구는 한국산 겨우살이가 오래 전부터 한방탕제 약제로 이용되고 있음을 감안해 열탕추출물인 M11C의 면역 활성 여부를 검증코자, 사람 말초혈액 단구세포에 M11 C를 처리하여 TNF-α 전사 및 분비에 미치는 영향을 검사하였다.
가설 설정
- , 1991), 이러한 결과는 M11C가 단구를 자극해 TNF-α를 분비하게 한다고 다분히 추측할 수 있었다. 이러한 추측이 사실이라면 anti-TNF-α 항체가 M11C로 단구를 자극해 얻은 MCM의 L929 세포독성 효과를 완전히 억제해야 한다고 가정했다. 이 가정을 확인하기 위해 TNF-α neutralization 실험을 하였다.
제안 방법
- 45㎛; Millipore, Bedford, MA 01730, USA)을 통과한 후 동결건조하여 갈색분말을 얻었다 (이하 M11C 이라 칭함). M11C내의 LPS 잔유량 검사는 Limulus ES II kit (Wako, Osaka, Japan)로 검사하였으며, 잔유량은 42 endotoxin units (EU)/㎖이였다 (data not shown). 유럽국가에 있어 시약에 LPS 잔유량 허용범위는 350 EU/㎖인데 (장 등, 2001), 본 M11C는 허용범위의 1/8 이하에 불가해 추후 실험에 아무런 문제가 없었다.
- 이는 M11C로 단구를 자극해 얻은 MCM에 TNF-α가 존재함을 말해 주고 있다. MCM에 TNF- α가 존재하는 것이 사실인지 재확인하기 위해 immunoblotting 기법을 이용해 MCM에 존재하는 TNF-α를 분석하였다. 분석 결과 MCM에 존재하는 TNF-α의 량은 단구를 자극한 M11C 의 농도와 자극시간에 의존적이었다 (Fig.
- TRISOL (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 total RNA의 추출하였다. Total RNA를 역전사 반응액과 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 TNF-α와 β-actin의 cDNA를 합성하였다.
- TRISOL (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 total RNA의 추출하였다. Total RNA를 역전사 반응액과 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 TNF-α와 β-actin의 cDNA를 합성하였다. 합성한 각각의 cDNA를 중합연쇄 반응액과 혼합하여 TNF-α와 β-actin의 RT-PCR 증폭 산물을 얻었다.
- 건강한 남자로부터 말초혈액을 채취한 후 헤파린 (Sigma, St Louis, MO, USA)으로 처리한 다음 Ficoll- Hypaque (Pharmacia, Sweden)에 의한 밀도구배 원심분리에 의해 중간층에 있는 모든 단형핵세포 (mononeuclear cell) 들을얻었다. 오염된 적혈구는 저장액 소금용액으로 분해한 후 제거하였다.
- 그 후 ECL (peroxidase substrate, Amersham, USA)을 NC에 잘 섞은 후 배양하였다. 그 후, 암실 (10W safety lamp; Kodak; USA)에서 NC가 들어있는 cassette에 X-ray film을 넣고 감광시킨 후 X-ray film을 developing, washing, fixing, washing 순서과정을 거친 후 TNF-α band의 크기와 강도를 분석하였다 (장 등, 2001).
- 그 후 배양 상등액은 모두 제거하고 침전되어 있는 불용성 formazan을 녹이기 위하여 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma, USA)를 각 well당 100㎕씩 첨가한 후 15분 동안 혼합하였다. 그리고 난 후, ELISA reader (Pharmasia, Sweden) 540 ㎚의 파장에서 흡광도 (O.D)를 측정하여 % cytotoxicity (O.D control−O.D test)×100/O.D control) 혹은 % viability (O.D test×100/O.D control)를 측정했다 (강 등, 2000).
- 본 연구에서는 한국산 겨우살이 추출물 M11C (비렉틴 구성물질)가 사람의 말초혈액 단구를 활성화시켜 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)를 생산 분비하게 하는지를 규명하기 위해 실험에 이용되었다. 단구로부터 TNF-α의 생산에 있어 M11C의 효과를 알기 위해 단구를 여러 농도 (0-2000㎍/㎖)의 M11C로 0.5-24시간 동안 자극한 후 배양액 MCM을 수거했다. 수거한 배양액 MCM을 TNF-α에 민감한 L929 세포에 첨가한 후 L929 세포의 독성 정도를 MTT 기법으로 검사하였는데, 배양액 MCM이 L929 독성효과를 가졌으며, 이 MCM의 L929 세포 독성효과는 TNF-α 항체에 의해 거의 완전하게 억제되었다.
- 단구세포로부터 역전사 중합 연쇄 반응 (reverse transcrip- tion-polymerase chain reaction; RT-PCR)은 역전사 kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 및 중합연쇄반응 kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 이용하여 실시하였다 (장 등, 2001). TRISOL (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 total RNA의 추출하였다.
- 이러한 추측이 사실이라면 anti-TNF-α 항체가 M11C로 단구를 자극해 얻은 MCM의 L929 세포독성 효과를 완전히 억제해야 한다고 가정했다. 이 가정을 확인하기 위해 TNF-α neutralization 실험을 하였다. 실험 결과, 가정처럼 anti-TNF-α 항체가 MCM의 L929 세포독성 효과를 완전히 억제했다 (Fig.
- 즉, M11C 농도가 증가함에 따라 TNF-α가 증가하다가 M11C 200㎍/㎖ 농도에서 최대량의 TNF-α가 분비함을 시사했다. 이러한 L929 독성결과가 MCM이 아니라 M11C의 직접적인 세포독성효과 때문인 지 알아보기 위해, M11C 2000 ㎍/㎖으로 이 L929세포를 24시간 배양하면서 L929사멸 여부를 검사하였는데, M11C에 의한 L929 세포독성을 전혀 관찰할 수 없었다 (data not shown).
- 4a, 4b, 5a, 5b). 이러한 M11C의 효과가 TNF-α mRNA 발현에는 어떠한 작용을 하는지를 알기 위해 RT-PCR 기법을 이용해 M11C의 여러 농도와 자극시간에 따라 단구를 자극한 후, TNF-α mRNA 발현을 검사하였다. 검사결과, M11C의 여러 농도가 증가함에 따라 단구로부터 TNF-α mRNA 발현이 증가하다가 자극 시간 4시간에서 최고의 TNF-α mRNA 발현을 보여 주었다 (Fig.
- 1-3)에서 M11C가 단구를 자극해서 TNF-α를 분비함을 확인하였다. 이를 다른 실험 기법인 immunoblotting을 이용해 MCM에 TNF-α 존재를 재확인하기로 하였다. 이를 위해 여러 농도 (0 -200㎍/㎖)로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 MCM를 재확인 했다.
- 이를 다른 실험 기법인 immunoblotting을 이용해 MCM에 TNF-α 존재를 재확인하기로 하였다. 이를 위해 여러 농도 (0 -200㎍/㎖)로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 MCM를 재확인 했다. 그 결과, TNF-α 생산 분비를 위한 단구자극 최대효과적인 M11C 농도가 200㎍/㎖이였으며 농도에 따라 증가함을 보여주었다 (Fig.
- 1, 2)를 분석해 볼 때, MCM 내에 TNF-α가 존재할 가능성을 강하게 시사했었다. 이를 재확인하기 위하여 TNF-α antibody (10㎍/㎖)를 L929에 대해 최대의 독성효과가 있는 MCM (M11C 200㎍/㎖로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 배양액)에 투여하여 2시간 동안 반응시킨 후, 이 MCM을 L929 세포에 처리하여 L929 세포 사멸을 검사했었다. 그 결과 MCM에 의한 L929 세포에 대한 독성효과가 TNF-α antibody에 의해 완전히 억제됨을 보였다 (Fig.
- Total RNA를 역전사 반응액과 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 TNF-α와 β-actin의 cDNA를 합성하였다. 합성한 각각의 cDNA를 중합연쇄 반응액과 혼합하여 TNF-α와 β-actin의 RT-PCR 증폭 산물을 얻었다. 이 증폭 산물은 1% agarose gel 전기영동에서 분석하였다.
대상 데이터
- RT-PCR을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan) 회사로부터 구입했다. Chloroform, hexane, methanol, ethanol, isoprophanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany) 회사로부터 구입했다. 세포독성검사를 위한 Trypan Blue와 각종 시약은 Sigma 회사로부터 구입했다.
- TNF-α 검사를 위한 항체는 Chemicon (Temecula, CA, USA) 회사로부터 구입했다. RT-PCR을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan) 회사로부터 구입했다. Chloroform, hexane, methanol, ethanol, isoprophanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany) 회사로부터 구입했다.
- TNF-α 검사를 위한 항체는 Chemicon (Temecula, CA, USA) 회사로부터 구입했다. RT-PCR을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan) 회사로부터 구입했다.
- TNF-α를 위한 독성검사는 TNF-α에 민감한 세포주인 생쥐 섬유아세포 L929를 사용하였다 (Mary et al., 1991). 세포는 실험 직전 Trypsin-EDTA를 처리하여 플라스크에서 분리한 후, 96 well plate에 각 well 당 4×104 cells/100㎕의 세포 밀도로 plating 한 후 6시간 동안 37℃에서 배양하였다.
- 그래서 M11C를 겨우살이 비 렉틴 구성물질로 칭하기로 하였다 (강 등, 2000; 장 등, 2001). 본 실험에 사용된 비렉틴 (non-lectin) 성분인 M11C가 쥐의 복강 대식세포를 활성화해 TNF-α와 IL-1β를 분비한다는 것을 우리 실험실 연구원들이 발표하였다 (강 등, 2000; 장 등. 2001). 또한 단구가 활성화할 때 TNF-α를 비롯한 IL-1β, IL- 6, IL-12 등 여러 cytokine들이 분비된다는 것이 잘 알려져있는 사실이다 (Johnston, 1988; Dinarello, 1989; Metlay et al.
- 세포독성검사를 위한 Trypan Blue와 각종 시약은 Sigma 회사로부터 구입했다. 본 실험에 사용된 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA)으로부터 분양받은 L929 (ATCC CCL 1)이었다.
- Chloroform, hexane, methanol, ethanol, isoprophanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany) 회사로부터 구입했다. 세포독성검사를 위한 Trypan Blue와 각종 시약은 Sigma 회사로부터 구입했다. 본 실험에 사용된 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA)으로부터 분양받은 L929 (ATCC CCL 1)이었다.
- 세포의 배양을 위하여 배양액 RPMI-1640과 fetal bovine serum (FBS), L-glutamine acid, penicillin-streptomycine Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA) 회사로부터 구입하였으며, 배양용 플레이트, 플라스크, 그리고 튜브는 Falcon (Franklin Lakes, NJ, USA) 회사로부터 구입하였다. TNF-α 검사를 위한 항체는 Chemicon (Temecula, CA, USA) 회사로부터 구입했다.
데이터처리
- 실험성적은 평균 또는 mean±S.E.M으로 나타냈으며, 각 group간의 통계학적 검정에는 PC-SAS 혹은 Excel 프로그램을 이용하여 T-검정하였다. p값이 0.
이론/모형
- 배양한 후, 각각의 100㎖를 L929 (105 cells/well)가 있는 각 well에 주입했다. 그리고 37℃ 에서 12시간 동안 배양 한 뒤 MTT 방법 (Francosis & Rita, 1986)에 의하여 L929들의 사멸 정도를 검사했다.
- 세포는 실험 직전 Trypsin-EDTA를 처리하여 플라스크에서 분리한 후, 96 well plate에 각 well 당 4×104 cells/100㎕의 세포 밀도로 plating 한 후 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양종료 후 각 well 속의 배양 상등액을 제거하고, 무혈청 배양액과 M11C로 자극한 배양액 MCM을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후 16시간 동안 5% CO 37℃에서 배양하고 MTT법2(Francosis & Rita, 1986)에 의해 세포독성을 검사하였다. MTT solution (1㎎/㎖, Sigma, St Louis, USA)을 각 well 당 50㎕씩 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 다시 배양했다.
- , 1989). 본 연구에서는 M11C로 사람 말초혈액에서 분리한 단구세포를 자극했을 때 TNF-α가 생산 분비되는 지를 검사하기 위해 TNF-α sensitive L929 세포 독성검사, TNF-α neutralization, immunoblotting, RT-PCR 기법들을 이용하였다.TNF-α sensitive L929 세포의 독성검사에서 단구를 자극한 M11C 농도가 증가함에 따라 얻은 배양액 MCM이 L929 세포의 독성을 점점 증가시켰으며 (Fig.
- 사람의 단구세포 (monocyte)는 허와 이 (1997)의 방법을 이용하였다. 건강한 남자로부터 말초혈액을 채취한 후 헤파린 (Sigma, St Louis, MO, USA)으로 처리한 다음 Ficoll- Hypaque (Pharmacia, Sweden)에 의한 밀도구배 원심분리에 의해 중간층에 있는 모든 단형핵세포 (mononeuclear cell) 들을얻었다.
- 이러한 결과는 배양액 MCM에 TNF-α가 존재함을 지적했으며, 또한 M11C가 단구를 자극해 TNF-α를 생산하리라고 암시했었다. 이러한 암시를 확인하기 위해 immunoblotting 기법을 사용해 배양액 MCM에 존재하는 TNF-α을 검사를 수행했다. 검사 결과 배양액 MCM에 많은 량의 TNF-α가 검출되었다.
- 채취 후 곧 바로 냉동실에 보관된 겨우살이로부터 M11C 추출은 장 등 (2001)의 방법을 이용하였다. 냉동 보관된 겨우살이 500g을 증류수에 넣고 약한 불로 6시간 동안 끓인 후, 믹서기 (솔잎 82A, 대구)로 분쇄한 후 교반기 (제일과학, 서울)를 사용해 저속으로 교반하였다.
성능/효과
- 그리고 난 뒤 8시간부터는 점차 감소하는 것을 보여 주었다. M11C의 TNF-α mRNA 전사유도 최적효과 시간이 TNF-α 단백질생산 분비 최적효과 시간보다 4시간 앞서 있다는 것을 보여주었다 (Fig. 5, 7).
- TNF-α mRNA 전사를 위한 최적 자극시간을 알기 위한 실험 결과에 있어서, M11C 최적 농도인 20㎍/㎖으로 단구를 자극했을 때, 1시간 동안의 자극에서 전사의 효과를 확실하게 보이다가 4시간에서 최대의 TNF-α mRNA 전사 유도효과를 보였다 (Fig. 7a, 7b). 그리고 난 뒤 8시간부터는 점차 감소하는 것을 보여 주었다.
- 본 연구에서는 M11C로 사람 말초혈액에서 분리한 단구세포를 자극했을 때 TNF-α가 생산 분비되는 지를 검사하기 위해 TNF-α sensitive L929 세포 독성검사, TNF-α neutralization, immunoblotting, RT-PCR 기법들을 이용하였다.TNF-α sensitive L929 세포의 독성검사에서 단구를 자극한 M11C 농도가 증가함에 따라 얻은 배양액 MCM이 L929 세포의 독성을 점점 증가시켰으며 (Fig. 1), 또한 M11C로 단구 자극 시간 증가에 따라 얻은 MCM이 L929 세포의 독성을 점점 증가시켰다 (Fig. 2). L929 세포 독성이 TNF-α 의존성이라는 것을 고려할 때 (Mary et al.
- TNF-α-sensitive L929를 이용한 실험 결과 (Fig. 1-3)에서 M11C가 단구를 자극해서 TNF-α를 분비함을 확인하였다. 이를 다른 실험 기법인 immunoblotting을 이용해 MCM에 TNF-α 존재를 재확인하기로 하였다.
- 이러한 암시를 확인하기 위해 immunoblotting 기법을 사용해 배양액 MCM에 존재하는 TNF-α을 검사를 수행했다. 검사 결과 배양액 MCM에 많은 량의 TNF-α가 검출되었다. 이러한 TNF-α 검출량은 단구를 자극한 M11C의 농도와 자극 시간에 비례해서 증가했다.
- 이러한 M11C의 효과가 TNF-α mRNA 발현에는 어떠한 작용을 하는지를 알기 위해 RT-PCR 기법을 이용해 M11C의 여러 농도와 자극시간에 따라 단구를 자극한 후, TNF-α mRNA 발현을 검사하였다. 검사결과, M11C의 여러 농도가 증가함에 따라 단구로부터 TNF-α mRNA 발현이 증가하다가 자극 시간 4시간에서 최고의 TNF-α mRNA 발현을 보여 주었다 (Fig. 6a, 6b, 7a, 7b). 이는 TNF-α mRNA 전사가 TNF- α 단백질 생산보다 4시간 정도 빨리 정점에 도달했다가 서서히 감소함을 보여 주었다.
- 이는 단구세포가 M11C의 자극을 받아 TNF-α를 분비하기까지 전사에 관련된 신호전달 시간이 필요함을 말해 주고 있다. 결론적으로 본 연구는 겨우 살 이를 열탕 추출해서 얻은 M11C가 사람의 말초혈액 단구로부터 TNF-α를 전사, 생산 분비하는 효과를 가지고 있음을 확인하였으며, 이는 겨우살이가 면역 활성효능을 얻기 위한 한 약탕 제로 이용할 수 있음을 시사하는 실험결과였다.
- 이러한 M11C의 농도와 자극시간의 의존적 효과는 단구로부터 TNF-α mRNA 발현에도 같은 경향을 보였다. 결론적으로 한국산 겨우살이로부터 열탕 추출한 M11C가 면역활성제로 작용할 수 있음을 시사함과 동시에 한방탕제로 사용되는 한국산 겨우살이가 면역학적 효능을 가지고 있음을 말해주고 있다.
- 이를 재확인하기 위하여 TNF-α antibody (10㎍/㎖)를 L929에 대해 최대의 독성효과가 있는 MCM (M11C 200㎍/㎖로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 배양액)에 투여하여 2시간 동안 반응시킨 후, 이 MCM을 L929 세포에 처리하여 L929 세포 사멸을 검사했었다. 그 결과 MCM에 의한 L929 세포에 대한 독성효과가 TNF-α antibody에 의해 완전히 억제됨을 보였다 (Fig. 3). 이는 MCM에 TNF-α가 존재하고 있으며, 또한 L929가 TNF-α에 의해 사멸됨을 보여 주었다.
- 이를 위해 여러 농도 (0 -200㎍/㎖)로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 MCM를 재확인 했다. 그 결과, TNF-α 생산 분비를 위한 단구자극 최대효과적인 M11C 농도가 200㎍/㎖이였으며 농도에 따라 증가함을 보여주었다 (Fig. 4a, 4b). 이러한 결과는 TNF-α-sesitive L929를 이용한 실험결과와 일치했었다 (Fig.
- 단구를 M11C 최고농도 200㎍/㎖로 자극했을 때, M11 C에 의한 자극시간의 효과를 알기 위한 실험에서 자극 1시간부터 증가하기 시작해서 8시간 동안 자극에서 최대의 TNF-α가 분비됨을 보여주었다 (Fig. 5a, 5b). 그리고 난 뒤 자극 16시간에서는 plateau에 이르렀다 (Fig.
- MCM에 TNF- α가 존재하는 것이 사실인지 재확인하기 위해 immunoblotting 기법을 이용해 MCM에 존재하는 TNF-α를 분석하였다. 분석 결과 MCM에 존재하는 TNF-α의 량은 단구를 자극한 M11C 의 농도와 자극시간에 의존적이었다 (Fig. 4a, 4b, 5a, 5b). 이러한 M11C의 효과가 TNF-α mRNA 발현에는 어떠한 작용을 하는지를 알기 위해 RT-PCR 기법을 이용해 M11C의 여러 농도와 자극시간에 따라 단구를 자극한 후, TNF-α mRNA 발현을 검사하였다.
- 상기 실험결과 (Fig. 1, 2)를 분석해 볼 때, MCM 내에 TNF-α가 존재할 가능성을 강하게 시사했었다. 이를 재확인하기 위하여 TNF-α antibody (10㎍/㎖)를 L929에 대해 최대의 독성효과가 있는 MCM (M11C 200㎍/㎖로 12시간 동안 단구를 자극해서 얻은 배양액)에 투여하여 2시간 동안 반응시킨 후, 이 MCM을 L929 세포에 처리하여 L929 세포 사멸을 검사했었다.
- 5-24시간 동안 자극한 후 배양액 MCM을 수거했다. 수거한 배양액 MCM을 TNF-α에 민감한 L929 세포에 첨가한 후 L929 세포의 독성 정도를 MTT 기법으로 검사하였는데, 배양액 MCM이 L929 독성효과를 가졌으며, 이 MCM의 L929 세포 독성효과는 TNF-α 항체에 의해 거의 완전하게 억제되었다. 이러한 결과는 배양액 MCM에 TNF-α가 존재함을 지적했으며, 또한 M11C가 단구를 자극해 TNF-α를 생산하리라고 암시했었다.
- 이 가정을 확인하기 위해 TNF-α neutralization 실험을 하였다. 실험 결과, 가정처럼 anti-TNF-α 항체가 MCM의 L929 세포독성 효과를 완전히 억제했다 (Fig. 3). 이는 M11C로 단구를 자극해 얻은 MCM에 TNF-α가 존재함을 말해 주고 있다.
- 본 실험은 이러한 사실을 이용해 M11C 로 단구를 자극했을 때 단구로부터 TNF-α가 분비하는 지 알아보기 위해, M11C로 자극 처리한 단구의 배양액을 L929 세포와 같이 8시간 동안 배양하면서 L929 독성정도를 검사하였다. 실험결과 여러 농도 (0-2000㎍/㎖)의 M11C로 처리한 단구 배양액들을 L929세포와 배양했을 때, M11C 농도 (0- 2000㎍/㎖)에 따라 얻은 MCM이 M11C 농도증가에 따라 L929 세포의 사멸이 점점 증가하다가 M11C 200㎍/㎖로 자극해서 얻은 MCM이 최대의 L929 사멸효과를 보였다 (Fig. 1). 그리고 M11C 2000㎍/㎖로 자극으로 얻은 MCM으로 L929를 처리했을 때 L929 사멸 plateau 현상을 보였다 (Fig.
- 이러한 TNF- α 분비가 TNF-α mRNA 유전자 발현과 어떠한 상관관계를 가지고 있는지 알기 위해 실험을 수행하였다. 실험한 결과 M11C로 단구세포를 자극했을 때 M11C 20㎍/㎖가 최대의 TNF-α mRNA 발현을 보이다가 M11C 200㎍/㎖에서는 plateau 경향을 보였다 (Fig. 6a, 6b). 이는 최대 TNF-α mRNA 유전자발현을 위한 M11C의 농도가 TNF-α 최대 분비를 위한 농도보다 훨씬 적은 농도였다 (Fig.
- 5-24시간으로 단구를 자극을 했어 얻은 여러 시간대의 배양액으로 L929를 처리했다. 이때 얻은 결과는 처리 1시간 MCM에서 L929 독성효과를 보이다가 12시간 동안 단구를 처리한 배양액 MCM이 최고 L929 독성효과를 보였다. 그리고 24시간 이후 배양시간부터는 plateau 경향을 보였다(Fig.
- 수거한 배양액 MCM을 TNF-α에 민감한 L929 세포에 첨가한 후 L929 세포의 독성 정도를 MTT 기법으로 검사하였는데, 배양액 MCM이 L929 독성효과를 가졌으며, 이 MCM의 L929 세포 독성효과는 TNF-α 항체에 의해 거의 완전하게 억제되었다. 이러한 결과는 배양액 MCM에 TNF-α가 존재함을 지적했으며, 또한 M11C가 단구를 자극해 TNF-α를 생산하리라고 암시했었다. 이러한 암시를 확인하기 위해 immunoblotting 기법을 사용해 배양액 MCM에 존재하는 TNF-α을 검사를 수행했다.
- 1). 즉, M11C 농도가 증가함에 따라 TNF-α가 증가하다가 M11C 200㎍/㎖ 농도에서 최대량의 TNF-α가 분비함을 시사했다. 이러한 L929 독성결과가 MCM이 아니라 M11C의 직접적인 세포독성효과 때문인 지 알아보기 위해, M11C 2000 ㎍/㎖으로 이 L929세포를 24시간 배양하면서 L929사멸 여부를 검사하였는데, M11C에 의한 L929 세포독성을 전혀 관찰할 수 없었다 (data not shown).
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