[논문]달걀 단백질 분석을 위한 HPLC 연구

전영주; 이은; 김인호

달걀 단백질 분석을 위한 HPLC 연구
HPLC Study for Egg White Analysis 원문보기

한국생물공학회지 = Korean journal of biotechnology and bioengineering, v.22 no.2, 2007년, pp.119 - 122

전영주 (충남대학교 화학공학과) , 이은 (충남대학교 화학공학과) , 김인호 (충남대학교 화학공학과)

초록
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RP-HPLC에서 주요 변수인 이동상의 조성과 컬럼의 종류를 변화시켜 난백 단백질을 실험하였다. C4, C8 C18 컬럼을 비교 실험하여 C18 컬럼에서 가장 많은 피크를 보여 C18 컬럼을 선택하였다. 등용매 용리에서 ACN : water의 조성이 50 : 50에서 가장 많은 피크를 보여 이 결과를 토대로 기울기 용리를 하여 실험하였다. 기울기 용리에서 얻어진 4가지 피크를 확인하기 위하여 단일성분인 lysozyme와 ovalbumin의 체류시간을 측정하여 확인하였고 논문을 통해 2가지 피크를 예측할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Since egg white contains various protein, it is important to research the protein distribution of egg white. Specially, lysozyme and ovalbumin important proteins, are used in medicine and food industry. Reversed phase high performance liquid chromatography has been used for separation of egg white, and column of RP-HPLC is available in variety. We have used C4, C8 and C18 columns to obtain chromatograms by varying carbon chain length of stationary phase. Long carbon chain length of stationary phase has good separation of egg white. Also, we have changed the composition of mobile phase (acetonitrile, water, and trifluoroacetic acid) to find optimum chromatograms. Acetonitrile and water composition of 50 : 50 show many peaks from egg white. Isocartic and gradient elution in RP-HPLC were used to compare the chromatography of egg white.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 난백 단백질 내의 lysozyme와 ovalbumin 분석을 목표로 하였다' 우선, 단백질 분리에 사용하는 C4, C8, C₁₈ 컬럼을 비교하여 분리도가 좋은 컬럼을 선택하였고, 선택된 컬럼에 이동상의 조성을 바꾸어가며 등용매 용리를 하였다. 여러 등 용매 용리 조성을 통하여 최적의 이동상 조성을 찾았으며, 이 조건을 토대로 기울기 용리 조성을 선택하여 난백을 분석하였다.

제안 방법

1%을 첨가하여 HPLC 분석하여 크로마토그램을 비교하였다. C₈ 컬럼의 분리도가 좋아 C₁₈ 컬럼과 같은 이동상에서 비교하였다. 최적의 등 용매 용리 조건을 찾기 위해 가장 많은 피크를 보인 C₁₈ 컬럼을 이용하여 이동상으로 ACN과 증류수의 조성을 각각 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 60 : 40으로 비교 실험하였다.
RP-H預LC에서 주요 변수인 이동상의 조성과 컬럼의 종류를 변화시켜 난백 단백질을 실험하였다. C₄, C₈ C₁₈ 컬럼을 비교 실험하여 C₁₈ 컬럼에서 가장 많은 피크를 보여 C18 컬럼을 선택하였다.
가장 많은 피크를 보인 C₁₈ 컬럼을 이동상인 ACN과 증류수의 조성을 각각 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 60 : 40으로 비교 측정하였다(Fig. 3). Fig.
3에서 보듯이 50 : 50 조건에서 가장 많은 피크를 보이고 있다. 그러나 난백에 들어 있는 많은 단백질들의 피크가 분리되지 않고 서로 겹쳐 있기 때문에 이 결과를 토대로 난백을 ACN의 조성이 50% 근처에 분리가 잘되도록 기울기 용리 HPLC 실험을 계속하였다.
난백 분리에 사용할 컬럼을 선택하기 위해 C₄와 C₈ 컬럼을 비교하였다(Fig. 1). 비교 결과 C₈ 컬럼이 더 좋은 분리도를 보이고 있다.
등용매용리와 달리 희석이 많이 되어 흡광도가 낮기 때문에 난백의 농도는 등 용매 용리와 다르게 3 g/1을 하였다. 난백에 함유되어 있는 lysozyme 와 ovalbumin 단백질을 확인하기 위하여 단일 성분인 lysozyme 와 ovalbumin 의 HPLC chromatogram을 얻었다. 1 g/1의 농도를 사용하였고 주입량은 100 瓯 유량은 1 ml/n血으로 하였다.
C₄, C₈ C₁₈ 컬럼을 비교 실험하여 C₁₈ 컬럼에서 가장 많은 피크를 보여 C18 컬럼을 선택하였다. 등 용매 용리에서 ACN : water의 조성이 50 : 50에서 가장 많은 피크를 보여 이 결과를 토대로 기울기 용리를 하여 실험하였다, 기울기 용리에서 얻어진 4가지 피크를 확인하기 위하여 단일성분인 lysozyme 와 ovalbumin의 체류시간을 측정하여 확인하였고 논문을 통해 2가지 피크를 예측할 수 있었다.
본 실험도 C₁₈에서 더 많은 피크를 보였기 때문에 C18 컬럼이 난백 단백질 분리에 좋은 컬럼으로 확인하였고 이컬럼으로 실험을 계속하였다.
22 ㈣의 필터를 사용하였기 때문에 5가지가 아닌 4가지의 피크를 확인할 수 있었다. 분리된 성분을 확인하기 위하여 lysozyme 와 ovalbumin를 같은 조건의 기울기 용리를 하여 분석하여 Lysozyme 은 Fig. 5에서 2분의 체류시간을 확인하였고 ovalbumin의 체류시간을 측정하였는데(Fig. 6) 2분 30초였다, 난백 크로마토그램에서 같은 체류 시간의 피크를 확인 하역 Fig. 7과 같이 난백 크로마토그램에서 2개의 피크를 확인하였다. 난백 단백질의 50%를 차지하는 ovalbumin의피크가 상대적으로 작게 나온 이유는 Abalo 등⑺에서 분자량이 크고 강한 소수성인 ovalbumin이 용출 후에도 30% 가 컬럼에 남았기 때문이다.
하였다. 여러 등 용매 용리 조성을 통하여 최적의 이동상 조성을 찾았으며, 이 조건을 토대로 기울기 용리 조성을 선택하여 난백을 분석하였다.
C₈ 컬럼의 분리도가 좋아 C₁₈ 컬럼과 같은 이동상에서 비교하였다. 최적의 등 용매 용리 조건을 찾기 위해 가장 많은 피크를 보인 C₁₈ 컬럼을 이용하여 이동상으로 ACN과 증류수의 조성을 각각 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 60 : 40으로 비교 실험하였다. 난백의 농도는 1 g/1, 시료는 100 111 주입하였으며 유량은 1 ml/min으로 하였다.
컬럼 선택을 위해 C₄, C₈ 컬럼과 이동상으로 ACN과 증류수의 비율을 50 : 50, pH 조정을 위해 TFA 0.1%을 첨가하여 HPLC 분석하여 크로마토그램을 비교하였다. C₈ 컬럼의 분리도가 좋아 C₁₈ 컬럼과 같은 이동상에서 비교하였다.

대상 데이터

변화시켜 난백 단백질을 실험하였다. C₄, C₈ C₁₈ 컬럼을 비교 실험하여 C₁₈ 컬럼에서 가장 많은 피크를 보여 C18 컬럼을 선택하였다. 등 용매 용리에서 ACN : water의 조성이 50 : 50에서 가장 많은 피크를 보여 이 결과를 토대로 기울기 용리를 하여 실험하였다, 기울기 용리에서 얻어진 4가지 피크를 확인하기 위하여 단일성분인 lysozyme 와 ovalbumin의 체류시간을 측정하여 확인하였고 논문을 통해 2가지 피크를 예측할 수 있었다.
기울기 용리를 하기 위해서 이 펌프를 master로 같은 모델의 또 하나의 펌프를 slave로 사용하였다. UV detector는 model 720 (Young-lin, Korea)을 사용하였고 파장은 280 n血으로 고정하였으며 데이터 수집은 Autochro-2000 (Young4in, Korea)을 사용하였다. 모든 실험은 상온에서 실험하였다'
재료 및 시약

시료는 시중에서 구입한 egg white와 lysozyme, ovalbumin (Sigma, USA)을 사용하였다. 시료는 증류수와 이동상에 잘 녹지 않기 때문에 원심분리기를 이용하여 30분간 2000 rpm 으로 분리한 후 멤브레인 필터 (0.
6 mm이다. 이 동상은 Acetonitrile (ACN, 99.9% Duksan, Korea) 와 Trifluoroacetic acid (TFA, 99% Aldrich, USA), 증류수를 사용하였다. 특히 ACNe 0.
22 ㎛ GVPP, Millipore, USA)를 통한 여과 과정을 거친 후 시료로서 사용하였다. 컬럼 비교를 위해 사용된 컬럼은 BioBasic C₄, C₈, C18 (ThermoHypersil-Keystone, USA)이며 크기는 150 x 4.6 mm이며 기울기 용리에 사용된 컬럼은 Luna C₁₈(Phenomenex, USA) 크기는 250 x 4.6 mm이다. 이 동상은 Acetonitrile (ACN, 99.

참고문헌 (8)

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