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문제 정의
- 관찰하였다. 또한 洗心湯 열수추출물 및 초미세 분말을 시료로 0A로 유도된 AD 병태 생쥐의 행동변화를 Morris water maze를 통해 측정하였고, 역시 βA로 유도된 AD 병태 생쥐의 뇌세포를 분석하여 microglial cell에서의 IL-lβ TNF-a 발현과 뇌조직에서의 지질과산화도(MDA), CD68과 CDllb의 발현 세포 수, 혈청 내 AChE의 변화 및 뇌조직의 허혈상태 및 조직손상의 변화 및 hippocampus에서의 tau protein, GFAP, presenilin-1, 2 의 변화를 관찰한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- -6, TNF-a,NO의 생성을 관찰하였다. 또한 洗心湯 열수추출물 및 초미세 분말을 시료로 βA로 유도된 AD 病態 생쥐의 행동변화를 Morris water maze를 통해 측정하였으며, 역시 0A로 유도된 AD 病態 생쥐의 뇌세포를 분석하여 microglial cell에서의 L-1β, TNF-a 발현과 뇌조직에서의 지질과산화도 (MDA), CD68 과 CDUb의 발현 세포수, 혈청 내 AChE의 변화를 관찰하였고, 뇌 조직의 허혈상태 및 조직손상의 변화 및 hippocampus에서의 tau protein, GFAP, presenilin-1, 2의 변화를 관찰한 바, 유의 한결 과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 洗心湯 열수추출물과 초미세분말 제형의 AD에 대한 효과를 실험적으로 규명하고자 洗心湯의 열수추출물을 시료로 mLFC에서 細胞毒性을 관찰하고, LPS를 처리한 BV2 microglial cell에서 L-1β, IL-6, TNF-a, NOS-Ⅱ, COX-2의 mRNA 발현과 BV2 microglial cell line의 배양상층액에서 IL-lβ Ⅱ.-6, TNF-a,NO의 생성을 관찰하였다.
- 이에 저자는 洗心湯의 열수추출물과 초미세분말 제형이 AD 에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 洗心湯의 열수추출물을 시료로 mLFC(mouse lung fibrast cells)에서 세포독성을 관찰하고, LPS(lipopolysacchride)를 처리한 BV2 microglial cell line 에서 IL-1β IL-6, TNF-a, NOS-Ⅱ, COX-2의 mRNA 발현과 BV2 microglial cell line의 배양상층액에서 IL-1β IL-6, TNF-a, NO의 생성량을 관찰하였다. 또한 洗心湯 열수추출물 및 초미세 분말을 시료로 0A로 유도된 AD 병태 생쥐의 행동변화를 Morris water maze를 통해 측정하였고, 역시 βA로 유도된 AD 병태 생쥐의 뇌세포를 분석하여 microglial cell에서의 IL-lβ TNF-a 발현과 뇌조직에서의 지질과산화도(MDA), CD68과 CDllb의 발현 세포 수, 혈청 내 AChE의 변화 및 뇌조직의 허혈상태 및 조직손상의 변화 및 hippocampus에서의 tau protein, GFAP, presenilin-1, 2 의 변화를 관찰한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 癲狂痴织》에서는 呆病의 병인으로 "#" 라 하였고 병리로 "脈㎕惑弦惑數 惑大惑小 變易不常 此其逆氣在心 惑肝膽二經 氣有不淸而然"을 제시하였고 증상은 "言辭顚倒, 擧動不經, 或多汗, 或善愁, 其症則千奇萬怪, 無所不至"이라 하였다. 치법으로 "但察其形體强壯 飮食不感別無虛脫等證… …而致失神昏亂者 此當㎕速扶正氣爲主 宜匕福飮 惑大補元煎主之"를 제시하였다. 淸代의 陳' 등은 치매와 유사한 개념으로 '呆病' 대해 상세히 서술하고 있는데, 원인으로 "此等症雖有祟凭之 實亦胸腹之中無非痰氣故治呆無奇法治痰卽治呆也""呆病內鬱抑不 舒 憤怒而㎕者有之 羞恚而㎕者有之"를 제시하였고 "呆腐如癡 而默默不言也如饑而悠悠如失也意慾癲而不能心欲狂而不敢有時 睡數日不醒有時將己身衣服密密縫補有時將他人物件深深藏藏掩 與人言則煎語而神遊背人言則低聲而泣訴與之食則厭薄而不呑 不與食則吞炭而若快" 등의 증상을 제시하고 치법으로 "#"이라 하였다.
- 배양 후 PBS로 약 2회 1500 rpm에서 원심분리하여 세척한 후 anti-CD14 단일항체를 넣고 얼음에서 1시간 다시 배양하였다. 3 회 인산완충생리식염수로 세척하고 Cellection Pan anti-mouse IgG-bead로 미세아교세포를 분리한 다음 세포 release buffeer로 anti-CD14+ 세포만 포집하였다.
- 8주간의 洗心湯 열수추출물(615 ㎎/㎏)과 초미세분말(615 mg /kg) 투여가 종료된 생쥐의 두개골을 열고 뇌를 꺼낸 다음 2회 D-PBS로 세척하였다. Brain을 작은 조각으로 절단한 후 conical tube(15 ㎖)에 넣어 1400 rpm에서 5분간 원심분리하고, tube에 RPMH640을 넣고 37℃ CO2 배양기에서 2시간 동안 배양한 후 0.
- AChE 활성도는 cholinesterase kit로 측정하였다. 혈청 중 AChE 활성도를 측정하기 위하여 test tube와 blank tube를 표시하고, test tube에 sodium chloride solution(cat.
- AD 병태 생쥐는 8주간 洗心湯을 경구투여하면서 Morris water maze에서 1주 1회 반복학습 훈련을 실시하였다. Morris water maze란 직경이 90 cm이고 높이가 약 30 cm인 수조로 수온이 28℃인 수돗물을 2/3정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10 cm인 원통형 platform을 설치한 것이다.
- AD 유발생쥐를 마취한 후 후두부에서 전두부 방향으로 두 개를 열어 그 안에 있는 뇌를 꺼내어 생리식염수에 씻은 후 brain matrix를 이용하여 2 mm의 두께로 자른 후 2% TTC 용액을 가하여 20분간 염색하였다. TTC 용액에 의하여 정상조직은 적색으로 염색이 되고, 허혈 된 부분은 염색이 되지 않는다.
- BV2 microglial cel1 linee Tong H. Joh(Burke Institute, Cornell University, USA)으로부터 공급 받아 24 wells plate에 2×105세포를 각각 분주한 후 12시간 이상 우태아 혈청 결핍 DMEM배지에서 배양한 후 洗心湯 열수추출물(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 10 ㎍/㎖)을 첨가하고 1시간 후 LPS 0.1 ㎍/㎖를 처리하여 6시간 동안 동시 배양하였다.
- Effects of SST hot water extract & 니tra-fine powder on the Memory Impairment of pA-induced Alzheimer's Mice in the stop-through type of Morris water maze test. C57BL/6 mice were trained once a day during 1 week, then they were divided into each group and treated by PA. And the retention training was carried out once a day during 1 wk.
- Primary mouse GFAP Ab(l:400)와 preserillin 1, 2 Ab(l:50)로 희석하여 30분간 slide를 염색하고, 2회 PBST로 수세하였다. 다시 mouse post primary Ab를 8분간 염색하고 3회 PBST로 수세한 후, polynw-HRP로 8분간 염색하고 다시 2회 수세하였다.
- Primary mouse Tau Ab를 1:500으로 희석하여 30분간 slide 를 염색하고, 2회 PBST 로 수세하였다. 다시 mouse IgG~secondary Ab를 15분간 염색 후 3회 Tris-buffered saline with 0.
- 수행하였다. Proinflammatory cytokine 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)틀 사용하였고, internal standard로 mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다 Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation은 2 min 50℃, 10 min 94℃, 그리고 40 cycles는 0.15 min 95℃, lmin 60℃에서 수행하였다. 각 군의 quantitative PCRe 다음과 같이 계산하여 relative quantitative(RQ)를 측정하였다.
- Real time quantitative PCRe Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system 을 이용하여 수행하였다. Proinflammatory cytokine 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)틀 사용하였고, internal standard로 mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다 Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation은 2 min 50℃, 10 min 94℃, 그리고 40 cycles는 0.
- 사용하였다. mLFC 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 2.0×104개의 세포를 96 wells plate에 분주하고 배양기(37℃, 5% CO2)에서2시간 배양한 후 洗心湯 열수추출물(최종 농도 200 ㎍ /㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖)을 48시간 동안 처리하였다. 배양종료 후에 배양액을 버리고 PBS로 2회 세척하였고각 well에 50% TCA(trichloroacetic acid) 50 ㎕를 가하고 1시간 동안 4℃에 방치한 후 증류수로 5회 세척한 다음 well plate를 공기 중에서 건조하였다.
- βA(10 11M)를 준비하고 생쥐를 ketamine과 xylazine으로 마취하고 stereotaxic frame에 고정한 후 생쥐뇌의 피부를 박리하였다. 그 다음 AD 병태 생쥐 모델을 만들기 위하여 βA(10 μM)를 Hippocampus에 주입하는 데, 그 위치는 bregma(두개골 계측점) 에서 caudal(꼬리쪽으로) 1.
- 열수추출물(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후 LPS(0.1 ㎍/㎖)를 각각의 well에 첨가하였다. 6시간 후 DMEM 배양액으로 각 well을 세척한 다음, 새로운 배양액으로 48시간 동안 CO2 조직 배양기에서 배양하였다.
- 洗心湯 1첩 분량(140 g)에 증류수 1300 ㎖을 가하여 열탕 주출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농축하고, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조하여 얻은 洗心湯 열수추출물(12.3 g)을 냉동(-84℃) 보관하면서 615 ㎎/㎏의 농도로 희석하여 사용하였다.
- 02% sodium azaide in PBS)으로 3회 수세하고, FACS 완충용액 284 ㎕와 동량의 인산완충용액(2% paraformaldehyde)을 넣고 혼합한 후 얼음에서 15분간 고정하였다. 고정 후 세포는 icecold FACS 완충용액으로 수세하고, permeabilization 완충용액 (0.1 % saponin, 0.05% sodium azide) 으로 얼음에서 15분간 방치한 후 FITC-anti-IL-1β와 FITC-anti-TNF-ci를 30분간 얼음에서 배양하였다 배양 후 permeabilization 완충용액으로 3회 수세하고 세포를 FACS 완충용액으로 섞은 후 유세포 형광분석기로 microglial cell내 IL-lβ 와 TNF-a의 발현량을 CellQuest 프로그램으로 분석하였다
- 그 다음 AD 병태 생쥐 모델을 만들기 위하여 βA(10 μM)를 Hippocampus에 주입하는 데, 그 위치는 bregma(두개골 계측점) 에서 caudal(꼬리쪽으로) 1.2 mm, midline에서 right로 0.7 mm, 그리고 pial 표면에서 깊이 1.1mm로 microinjector의 injection speed 0.1)㎕/min와 total volume 0.5 ㎕의 조건으로 수행하였다.
- 1% Tween 20 용액으로 수세하고, HRP로 15분간 염색 후 다시 2회 수세하였다. 그리고 DAB로 2분간 염색한 후 2회 수세하고 hematoxylen으로 5분 염색 후 2회 수세하여 per mount를 수행하고 광학현미경으로 관찰하였다 .
- 다시 mouse post primary Ab를 8분간 염색하고 3회 PBST로 수세한 후, polynw-HRP로 8분간 염색하고 다시 2회 수세하였다. 그리고 DAB로 5분간 염색 후 2회 수세하고 hematoxylen로 5분 염색 후 2회 수세하여 permount를 수행하였다. 형광위상차현미경(contrast fluoroseince microscope)을 사용하여 ×100 배율로 관찰하였다.
- 기기는 spectrophotometer(shimazue, Japan), 원심분리기(한일과학, Korea), Bio-freezer(sanyo, Japan), 열탕추출기 (DWT-1800T, 대웅, Korea), 감압 증류장치 (Rotary evaporator, BUCHI B-480z Switzerland), 동결 건조기(Freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan), histidin affinity column을(Invitrogen, USA), Windows ID main program(AAB, USA), stereotaxic frame (Adamec, USA), CELLection Pan anti-mouse IgG-bead(Dynal, USA), brain matrix(ASI instruments, Warren, USA), Primus 96 thermocycler system (MWG Biotech., Germany), icemaker(비전과학, Korea), ELISA reader(Molecular device, USA), CO2 incubator(Lepcoz USA), Cytometry(BD, USA), Microscope(Nikonz Japan), Cooling microtome(Serotec., USA), VIDEOTRACK(animal and human being behaviour analysis system, Viewpoint, France) 및 homogenizer(OMNI, USA등의 것을 사용하였다.
- 6, 750rpm으로 분쇄하였다. 미분쇄된 시료를 공기분급 장치에서 분급휠 속도(air classifying wheel speed) 5,000~7,500rpm으로 공기 분급을 실시하였다. 이와 같이 얻은 초미세 분말을 냉동(-84℃) 보관하면서 처방용량에 따라 혼합하여 615 ㎎/㎏의 농도로 희석하여 사용하였다.
- 분리된 뇌세포에 ACK용액을 처리하여 적혈구를 제거하고 4℃에서 면역형광염색을 실시하였고, 각각에 PE-anti-CD68, FITGanti-CDHb를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3 회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CDllb/CD68 세포수를 분석하였다.
- 6시간 후 DMEM 배양액으로 각 well을 세척한 다음, 새로운 배양액으로 48시간 동안 CO2 조직 배양기에서 배양하였다. 배양 종료 후 전체 배양액을 2000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 회수하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-a 생성량을 ELISA readei로 측정하였다. 즉, 각 well 에 배양상층액을 100 ㎕씩 분주한 후 antibody cytokine-biotined conjugated 100㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
- 분리된 AD 병태 생쥐 모델의 뇌를 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정, 파라핀 블록을 만든 후, 조직절편을 4 ㎛ 두께로세 절하고 probe~on plus slide에 부착시켜 건조시켰다. 탈 파라핀 한 후 함수시키고 0.
- 분리된 AD 병태 생쥐의 뇌를 10% formaldehyde 용액에 고정하고 세절한 후 흐르는 물에 8시간 수세한 다음, 이것을 microtome으로 절편을 만들어 Hematoxylin & eosin 염색을 실시하고 광학 현미경상에서 관찰하였다.
- 얻어진 부유액을 1% FBS의 FACS 완충용액에 넣어 뇌세포를 분리하였다. 분리된 뇌세포에 ACK용액을 처리하여 적혈구를 제거하고 4℃에서 면역형광염색을 실시하였고, 각각에 PE-anti-CD68, FITGanti-CDHb를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3 회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CDllb/CD68 세포수를 분석하였다.
- 1일 1회 학습 시 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, 양성대조군(tacrine), 洗心湯 열수추출물 실험군(615 mg/kg)과 洗心湯 초미세분말 실험군(615 ㎎/㎏)로 분류하였고 2주 경과(1주경과시점에 βA 투여) 후, 8주간 1일 1회 약물 투여와 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다. 훈련과 약물투여 완료 후 각 군 생쥐를 water maze에 한 마리씩 넣고, VIDEOTRACK으로 행동을 측정하였고 videotrack software로 분석하였다
- 세포독성 측정방법은 SRB assay법14)을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. mLFC 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 2.
- 2시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 antibody avidin-HRP conjugated 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30 분간 방치한 후 100 ㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA readeer로 450 run에서 홉광도를 측정하였다.
- 역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍ 을 DNase I (10 U/㎕) 2 U/tube와 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎖ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides(25 pmole,25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor(20 U/ ㎕), 1 ㎕ 100 mM DTTZ 4.5 ㎕ 5xRT buffer(250 mM Tris-HClz pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl2)를 가하고, 다시 1 ㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 가한 다음 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
- 있다. 이는 동물이 주변에 있는 단서들을 사용하여 기억하는 능력, 즉 공간준거기억을 측정하는 것으로37), 이 방법을 이용하여 6A로 유도된 AD 병태 생쥐에 대한 洗心湯 열수추출물 및 洗心湯 초미세분말의 기억력 감퇴 억제효과를 측정하였다.
- 이와 같은 관점에서 BV2 microglial cell line을 LPS를 처리한 후, 각각 다른 농도의 洗心湯의 열수추출물(100㎍/㎖ 50 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖)을 투여한 후, IL-lβ, IL-6, TNF-a, COX-2, NOS-Ⅱ 의 \mRNA 발현을 관찰하였다. 그 결과, 모든 실험군에서 proinflammatory cytokine IL-lβ, IL-6, TNF-a, COX-2, NOS-D 의 mRNA의 발현이 억제되었음을 볼 수 있다.
- 0)를 이용해 microwave oven에서 15분간 전 처리하였다. 조직 내 과산화효소의 작용을 억제하기 위하여 3% H2O2에 10분간 처리한 후, 조직 내의 항원과 비특이적 단백결합을 억제하기 위해 정상 혈청으로 단백질을 차단시켰다.
- 초미세 분말의 제작과 입도분석은 (주)허브월드에서 실시 · 협조하였으며, 白茯神, 酸棗仁, 半夏, 神曲, 陳皮, 人蔘, 附子炮, 石菖蒲, 甘草 적당량을 세척 건조한 후, Pin mill을 이용하여 직경 1 mm내외로 조분쇄한 다음, Turbo mill에서 비터(beater) 회전속도 6, 750rpm으로 분쇄하였다. 미분쇄된 시료를 공기분급 장치에서 분급휠 속도(air classifying wheel speed) 5,000~7,500rpm으로 공기 분급을 실시하였다.
- 포집한 미세아교세포를 ice-cold FACS 완충용액(0.05% BSA, 0.02% sodium azaide in PBS)으로 3회 수세하고, FACS 완충용액 284 ㎕와 동량의 인산완충용액(2% paraformaldehyde)을 넣고 혼합한 후 얼음에서 15분간 고정하였다. 고정 후 세포는 icecold FACS 완충용액으로 수세하고, permeabilization 완충용액 (0.
- 허혈 크기의 측정은 Michael의 방법16) 으로 수행하였다. 허혈의 크기(AT)는 [(Al / STI) + (A2 / ST2) + (A3 / ST3) + (A4 / ST4)]이고, A는 사진 상에 나타난 허혈 면적, ST 는 각각 section(2 ㎖)의 전체 면적, BH(brain Hipocampus)는 뇌의 hipocampus부분의 면적이며, risk에 대한 허혈 크기는 전체 면적의% 로 표현하였다 즉 BH부위의 허혈 면적(LV)은 (AT of area at risk/ST of B베 x 100로 분석하였다
- AChE 활성도는 cholinesterase kit로 측정하였다. 혈청 중 AChE 활성도를 측정하기 위하여 test tube와 blank tube를 표시하고, test tube에 sodium chloride solution(cat. no. 150-3) 0.2 ㎖ 와 serum 0.2 ㎖를 넣고 혼합하였다. Blank tube와 test tube에 3.
- 그리고 DAB로 5분간 염색 후 2회 수세하고 hematoxylen로 5분 염색 후 2회 수세하여 permount를 수행하였다. 형광위상차현미경(contrast fluoroseince microscope)을 사용하여 ×100 배율로 관찰하였다.
- 선별된 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, 양성대조군(tacrine), 洗心湯 열수추출물 실험군(615 mg/kg)과 洗心湯 초미세분말 실험군(615 ㎎/㎏)로 분류하였고 2주 경과(1주경과시점에 βA 투여) 후, 8주간 1일 1회 약물 투여와 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다. 훈련과 약물투여 완료 후 각 군 생쥐를 water maze에 한 마리씩 넣고, VIDEOTRACK으로 행동을 측정하였고 videotrack software로 분석하였다
대상 데이터
- Morris water maze란 직경이 90 cm이고 높이가 약 30 cm인 수조로 수온이 28℃인 수돗물을 2/3정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10 cm인 원통형 platform을 설치한 것이다. 1일 1회 학습 시 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, 양성대조군(tacrine), 洗心湯 열수추출물 실험군(615 mg/kg)과 洗心湯 초미세분말 실험군(615 ㎎/㎏)로 분류하였고 2주 경과(1주경과시점에 βA 투여) 후, 8주간 1일 1회 약물 투여와 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다.
- Taq. polymerase, DNase, RNase, 그리고 Deoxynucleotide triphosphate(dNTP)는 TaKaRas사 (Japan) 제품을, Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)와 RNase inhibits는 Promega사 (USA) 제품을, RNAzolB는 Tel-Test사(USA) 제품을, fetal bovine serum(FBS)은 Hyclone사 (USA) 제품을, 그리고 Agarose는 FMC사(USA) 제품을 사용하였고, β-amyloid peptide(Calbiochemz USA), anti-CD14 (Pharmingenz USA), anti-mouse IgG-bead(Dynalz USA), anti-IL-1β와 anti-TNF-a(Pharmingenz USA), 그리고 anti-CD44-PE(Pharmingen, USA), anti-CD68-FITC(Pharmingen, USA), anti-CDllb-FITC(Pharmingen, USA), anti-GFAP-FITC(Phariningen, USA), anti-mouse Ig HRP-conjugated secondary Ab(l:4000z Amersham, USA)와 ECL-Hybond film(Amersham, USA) 및 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
- βA는 Calbiochem 회사에서 공급받아 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 洗心湯(Sesimtang, SST)의 처방구성은 《辨證奇門》7)을 기준으로 하였고, 사용한 약제는 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 처방 1첩의 내용과 용량은 Table 1과 같다.
- 본 실험을 위하여 사용된 암컷 C57BL/6생쥐와 BALB/c 생쥐는 한국생명과학연구원에서 분양받아 1주 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였으며 실험당일까지 고형사료(조단백질 22.1%이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이라, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4%이상, 삼양사, Korea)와 물을 충분히 공급하고 실온 22±2℃를 계속 유지하고 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Tot기 IL-6 levels were measured by a sandwich E니SA using an ELISA kit. Data are represented as means士SD * Statistically significant value compared with control group by ANOVA test and Duncan's method(p<0.05).
- o). Data represent means+S.D. * Statistically significant value compared with control group by ANOVA test and Duncan's methcd(p(0.05).
- o). Data represent means±S.D. * Statistically significant value compared with control group by ANOVA test and Duncan's method(p<0.05).
- , number of CD14 positive c에s in the mouse brain cf control and the other groups were submitted during the stereotaxic procedures to PA-induced Alzh이disease model. Data represent means±S.D. * Statistic지ly significant value compared with control group by ANOVA test and Duncan's method(p<0.05).
- M기ondialdehyde(MDA) value were MDA-TBA activity measured by spectrophotometry. Tissue in the mouse brain of control and the other groups were submitted during the stereotaxic procedures to pA-mduced Alzheimer's disease model Data represent means+S.D. * Statistically significant value compared with control group by ANOVA test and Duncan's method(p<0.05).
- 각 군의 유의성은 일원배치분산분석(ANOVA test)로 평가하였고, p<0.05 수준에서 Duncan's method로 사후 검정하였다.
이론/모형
- MDA측정은 Suematsu 등의 방법15)에 따라 clean test tube 에 뇌조직 현탁액 200 ㎕를 넣고, 8.1% sodium dodesyl sulfate(SDS) solution 225 ㎕를 가하고 5초 동안 vortex mixer로 mixing한 후, 20% acetic acid 1.5 ng을 가하고 75 ㎕ 증류수를 넣고 5초 동안 다시 vortex mixer로 mixing했다. 이후 1.
- Acetylcholine chloride solution을 첨가하고 시간을 정확히 기록하여 25℃ 수조에서 정확히 30분간 배양시킨 후 ELISA reader로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과로 ΔA= ABLANK - ATEST 공식에 의하여 활성도를 측정하였다.
- 실험에서 얻은 결과는 mean±standard deviation으로 기록하였다. 각 군의 유의성은 일원배치분산분석(ANOVA test)로 평가하였고, p<0.
- TTC 용액에 의하여 정상조직은 적색으로 염색이 되고, 허혈 된 부분은 염색이 되지 않는다. 허혈 크기의 측정은 Michael의 방법16) 으로 수행하였다. 허혈의 크기(AT)는 [(Al / STI) + (A2 / ST2) + (A3 / ST3) + (A4 / ST4)]이고, A는 사진 상에 나타난 허혈 면적, ST 는 각각 section(2 ㎖)의 전체 면적, BH(brain Hipocampus)는 뇌의 hipocampus부분의 면적이며, risk에 대한 허혈 크기는 전체 면적의% 로 표현하였다 즉 BH부위의 허혈 면적(LV)은 (AT of area at risk/ST of B베 x 100로 분석하였다
성능/효과
- AD 병태 생쥐 뇌조직의 손상을 관찰한 결과 대조군에서는 hippocampus 조직에 astrocytes와 microglial cell이 침투하여 hipptxampus의 cell line이 뚜렷하지 않았고 cognex 투여군은 정상군과 가깝게 뚜렷한 hippocampus의 cell line을 보였으며 洗心湯 실험군에서도 희미하게 hippocampus의 cell line을 보였고, 대조군에 비해 cognex투여군과 洗心湯 실험군에서는 뇌의 허혈상태로 유도된 stratum orion, stratum radiatum, oligodendrocytes-like cells, astrocytes-like cell 등은 보였지만 pyramidal cell layer, neurons 그리고 dentate gyrus등이 회복된 것을 볼 수 있었다. 이는 #이 AD에서 보이는 뇌조직의 손상과 뇌 허혈로 인한 신경세포와 조직의 손상을 억제하는 효과가 있어 염증과 허혈에 관련된 AD의 기전을 억제할 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있겠다.
- AD 병태 생쥐 뇌조직의 손상을 관찰한 결과, 대조군은 hippocampus와 entorhinaL fimbriaformix 등의 형태가 뚜렷하지 않았으나 cognex 투여군과 洗心湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군에서는 비교적 뚜렷한 조직 형태를 갖추고 있었다.
- AD 병태 생쥐 뇌조직의 허혈크기를 관찰한 결과, 洗心湯 열수추출물, 洗心湯 나노분말 실험군은 대조군에 비하여 허혈의 크기가 다소 감소하였으나 유의성은 없었다.
- AD 병태 생쥐 모델의 hippocampus를 anti-tau Ab로 면역조직 화학염색을 실시한 결과, 대조군에서는 tau protein에 positive한 조직세포가 많이 보였으나, cognex 투여군과 洗心湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군에서는 tau protein에 positive 한 조직세포가 현저히 감소하였다.
- AD 병태 생쥐 모델의 hippocampus를 면역화학조직염색을 실시하여 관찰한 결과, 대조군에서는 정상군과 비교하여 tau protein, GFAP, PS-1/PS-2에 양성반응을 보이는 조직 세포가 현저히 증가하였고 실험군에서는 이러한 조직세포가 감소했음을 확인할 수 있었다.
- BV2 microglial cell line 배양상층액의 NO의 생성을 관찰한 결과, NO의 생성량은 洗心湯 100 ㎍/㎖ 50 ㎍/㎖ 실험군 모두에서 유의성 있는 감소를 보였다. 이로써 洗心湯이 산화적 손상을 유발하는 No의 생성을 억제함으로써 AD의 예방에 활용될 수 있음을 알 수 있으며 이는 최"13)의 연구에서 총명탕과 목근피 총명탕이 NO의 생성을 억제하여 AD의 예방에 활용될 수 있다는 결과와 비교된다.
- Microglial 세포내에서의 TNF-a의 발현은 대조군은 86.8±6.5 (%)이었고, cognex 투여군은 56.5±10.9 (%), 洗心湯 열수추출물 실험군은 63.8±15.1 (%)였으며, 洗心湯 초미세분말 실험군은 60.9±1.1 (%)로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(Fig. 5).
- Morris water maze를 이용하여 stop-through latency와 distance movement-through latency를 관찰하였는데, stop-through latency 는 洗心湯 열수추출물 및 洗心湯 초미세분말 실험군이 모두 대조군에 비해 시간의 단축을 보였으나, 각 실험군 간 유의한 차이는 없었고, distance movement-through latency는 洗心湯 열수추출물 실험군만이 대조군에 비해 유의한 거리 단축을 보였다(Fig. 3, 4).
- Presenilin-1과 presenilin-2 Ab로 면역조직화학 염색을 실시한 결과, 대조군에서 presenilin-1/presenilin-2에 positive한 뇌조직세포가 많이 보였으나, cognex 투여군과 洗心湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군에서는 presenilin-l/presenilin-2에 positive 한조직세포가 현저히 감소하였다.
- 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세 분말은 AD 병변 뇌조직에서의 MDA를 감소시켰으나 유의성은 없었다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 0A로 유도된 AD 병태 생쥐 모델의 혈청 내 AChE 활성을 유의성 있게 억제하였다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 AD 병변 뇌 조직의 허혈 상태를 개선하였고 허혈로 인한 뇌조직 손상을 억제하였다.
- 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 AD 병변 뇌 조직의 허혈 상태를 개선하였고 허혈로 인한 뇌조직 손상을 억제하였다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 AD 병변 뇌 조직의 tau protein, GFAP, presenilin 1, 2의 생성을 억제하였다.
- 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 0A로 유도된 AD 병태 생쥐 모델의 혈청 내 AChE 활성을 유의성 있게 억제하였다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 AD 병변 뇌 조직의 허혈 상태를 개선하였고 허혈로 인한 뇌조직 손상을 억제하였다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 AD 병변 뇌 조직의 tau protein, GFAP, presenilin 1, 2의 생성을 억제하였다.
- 洗心湯 열수추출물은 100 ㎍/㎖ 실험군에서 BV2 microglial cell line 배양상층액의 IL-6, TNF-a, NO의 생성을 유의성 있게 감소시켰다. 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말은 Morris water maze를 통한 stop-through latency측정에서 유의성 있는 기억력개선 효과를 나타냈고, distance movement-through latency 측정에서 洗心湯 열수추출물이 유의성 있는 기억력 개선 효과를 나타냈다. 洗心湯 초미세분말은 microglial cell에서의 TNF-Q의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
- 洗心湯 열수추출물과 초미세분말의 효과를 비교해 보면, PA 로 유도된 AD 병태 생쥐에 대해 Morris water maze를 통한 stop-through latency에서 기억력 감퇴개선효과, microglial cell 의 IL-1β의 발현 억제, 뇌조직에서의 MDA, CD68과 CDllb 발현 세포 수, 혈청 내 AChE 활성도 측정, 뇌조직의 허혈상태 개선 효과에 있어 모두 효과가 있었으나 제형에 따른 유의한 차이는 없었고, Distance-through latency에서의 기억력 감퇴효과에서는 洗心湯 열수추출물만이, microglial cell에서 TNF-a의 발현 측정에서는 洗心湯 초미세분말만이 유의한 효과를 나타냈다.
- 洗心陽의 세포독성을 측정한 결과, mLFC의 생존율은 대조군에 비해 洗心湯 50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖ 200 ㎍/㎖ 실험군에서 각각 92.9±0.7(%), 88.1±2.0(%), 81.2±3.0(%)로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으나 실험군 모두에서 80% 이상의 생존율을 나타내었다.
- \mRNA 발현을 관찰하였다. 그 결과, 모든 실험군에서 proinflammatory cytokine IL-lβ, IL-6, TNF-a, COX-2, NOS-D 의 mRNA의 발현이 억제되었음을 볼 수 있다.
- 또한 BV2 microglial cell line의 배양상층액에서 IL-lβ IL-6,의 생성량을 측정한 결과, IL-1β 생성량은 모든 실험군에서 다소 감소하였으나 유의성은 없었고, IL-6, TNF-a의 생성량은 '洗心湯 100㎍/㎖ 실험군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 또한 GFAP에 대한 면역조직화학염색의 결과에서, 대조군에서 GFAP에 positive한 astrocyte가 많이 보였으나, cognex 투여군과 洗心湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군에서는 GFAP에 positive한 astrocyte가 현저히 감소하였다.
- 또한 대조군에서는 hippocampus의 neuronal line의 형태가 뚜렷하지 않았으나 cognex 투여군은 정상과 가깝게 뚜렷한 hippocampus 의 neuronal line를 보였고,# 열수주출물 및 초미세분말 실험군에서도 희미하게 hippocampus의 neuronal line를 보였다.
- 또한 대조군은 hippocampus 조직에 neuronal line이 사라졌으나, cognex 투여군과 洗心湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군에서는 neuronal line이 비교적 뚜렷이 보였고, 뇌의 허혈 상태로 유도된 stratum orion, stratum radiatum, oligodendrocytes-like cells, astrocytes-like cell 등은 보였지만 병변 부위에서 사라졌던 pyramidal cell layer, neurons 그리고 dentate gyrus 등은 회복되었다.
- 로 유도된 AD 병태 생쥐 microglial cell에서의proinflammatory cytokine의 일종인 IL-lβ, TNF-a 발현을 관찰한 결과, 정상군에 대해 0A를 뇌에 주입한 대조군에서는 발현이 증가되었으나 실험군 모두에서 발현이 감소했고, 洗心湯 초미세 분말 실험군에서 TNF-a 발현이 유의성 있게 억제되었다.
- 먼저 정상 생쥐의 mLFC에서 洗心湯의 세포독성을 측정한 결과, 세포의 생존율은 대조군에 비해 洗心湯 50 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖ 200 ㎍/㎖ 실험군에서 감소하였으나, 실험군 모두에서 80% 이상으로 나타났다 이후의 실험에서는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도로 洗心湯을 사용하였다.
- 생쥐 혈청 내 AChE 활성도는 정상군이 24.616.1 (U/㎖), 대조군은 59.5±7.1 (U/㎖)이었고 cognex 투여군은 34.7±8.4 (U/ ㎖), 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말 실험군은 각각 38.4±8.6 (U/㎖)과 37.9±4.9 (U/㎖)로 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 감소하였으며, 실험군간 유의한 차이는 없었다(Fig. 7).
- 생쥐의 뇌조직에서의 MDA 양을 관찰한 결과, 대조군이 95.4±24.0 (pg/mg)이었고, cognex 투여군이 49.9±10.9 (pg/mg)였고, 洗心湯 열수추출물과 洗心湯 초미세분말 실험군은 각각 71.0±9.3과 72.1±10.3 (pg/mg)로 대조군에 비하여 감소를 하였으나 유의성은 없었다(Fig. 6).
- 이런 점에서 AD 병태 생쥐 병변 뇌조직에서의 MDA의 양을 측정한 결과 대조군에 비해 洗心湯 열수추출물 및 洗心湯 초미세 분말을 투여한 실험군에서 다소 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 6).
- 이상의 내용을 총괄해 보면 洗心湯은 BV2 microglial cell line에서 IL-lβ, IL-6, TNF-a, NOS-Ⅱ, COX-2의 mRNA 발현을 억제하였고 , BV2 microglial cell line 세포배양액에서 IL-lβ, IL-6, TNF-a, NO의 생성량을 감소시켰으며, βA로 유도된 AD 병태 모델 생쥐에 대해 Morris water maze를 통한 stop-through latency, distance movement-through latency에서 기억력 개선 효과를 나타냈고, BA로 유도된 AD 병태 모델 생쥐의 microglial cell에서 proinflammatory cytokine인 IL-lβ, TNF-a의 발현을 억제하였고, 뇌조직에서의 MDA, CD68과 CDllb 발현 세포 수를 감소시켰으며, BA로 유도된 AD 병태 생쥐의 혈청 내 AChE 활성도를 유의성 있게 억제하였고, 뇌조직의 허혈상태 및 조직손상을 개선하였으며 hippocampus에서의 tau protein, GFAP, PS-1/PS-2를 감소시키는 것으로 나타났다.
후속연구
- 따라서 洗心湯은 microglial cell 의 proinflammatory cytokines의 과잉 발현, 산화적 스트레스 등으로 인해 야기될 수 있는 AD와 choline성 신경세포의 퇴화에 의해 야기되는 기억력감퇴에 대해 예방과 치료제로 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 처방구성으로 볼때 특히 氣㎖虧虛, 痰濁咀竅형 치매에 응용할 수 있을 것으로 보며, 향후 초미세분말의 정확한 기전과 새로운 제형의 개발 및 치매에 대한 임상 연구 등이 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 洗心湯은 proinflammatory cytokine의 과잉발현 등으로 인해 야기될 수 있는 AD의 예방과 치료에 활용될 수 있으리라 판단할 수 있다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 洗心湯 열수추출물과 초미세 분말은 AD의 치료에 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
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