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문제 정의
- 사인 (砂仁' Amomum xanthioides)은 생강과의 다년생 초본으로 방향성이 높아 한방에서 소화기내의 습을 제거하고, 위장의 운동을 활성화하여 소화를 돕는 작용을 하는 것으로 알려져 있으나 피부 관련 소재로도 사용되고 있다. 본 연구는 사인의 열수 추출물이 a-MSH에 의해 유도된 B16F10 세포 내 멜라닌 형성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 효소반응이다8). 최근 천연물에서 tyrosinase활성 억제 관련 소재의 스크린을 통한 미백관련 화장품 및 의약품 소재에 대한 연구가 널리 이루어지고 있어 한방에서 사용되고 있는 피부 관련한 약재 중 멜라닌형성에 억제 기능을 가지는 한약재를 탐색하였다 a-MSH에 의해 유도된 B16F10세포계를 사용한 결과 사인의 열수 추출물이 a-MSH에 의해 유도된 멜라닌형성에 억제 기능 가지며 있어 보고하는 바이다.
제안 방법
- B16F10세포의 형태학적 변화는 200배율로 위상차 현미경을 통해 관찰하였다. 세포 주기는 B16F10 세포를 trypsin-EDTA를 처리하여 배양 용기에서 떼어 낸 후, PBS로 세번 수세하여, 원심분리시켜 cell pollet을 모았다.
- 세포 주기는 B16F10 세포를 trypsin-EDTA를 처리하여 배양 용기에서 떼어 낸 후, PBS로 세번 수세하여, 원심분리시켜 cell pollet을 모았다. Cell pellete citrate buffer로 재부유 시켜 RNase A를 처리한 후, 세포핵을 propidium iodide로 염색시켜 flow cytometry로 분석하였다.
- Synthetic melanin을 이용하여 농도별 표준곡선을 작성한 후 멜라닌의 농도를 측정하였다. 세포외 멜라닌은 B16F10 세포의 배양 상층 액을 취하여 404 nm에서 흡광도를 측정하고, 세포의 수를 계수하여 한 개의 세포가 분비한 melanin의 양을 계산하여 대조군을 100%로 놓고 상대적인 값을 측정하였다.
- Tyrosinase활성은 Martinez-Esparza'의 방법을 수정하여 사용하였다. B16F10 세포를 trypsin-EDTA토 부유시켜 Ixlff개로 100 m 배양 용기에 나눈 다음, 24시간 동안 안정화시킨 후, 사인의 열수추출물과 q-MSH 를 처리하여 2일간 배양하고, phosphate-buffered saline을 세 번 씻어내고 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
- 1 mM PMSF, 1 mM NaF)를 첨가하여 30 분간 얼음에서 반응시켜 세포를 녹인후, 원심분리하여 상층액을 취하여 tyrosinase 활성 측정용액으로 사용하였다. 단백질 농도 50㎍의 용액을 취하여 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)과 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시키면서 10분 간격으로 405 nm에서 흡광도의 변화를 1시간 동안 관찰하였다.
- 멜라닌생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 arbutin을 0.1 mg/ml의 농도로 처리하고 실험군과 같은 조건으로 배양하여 대조군으로 사용하였다. Fig.
- 본 실험의 사인 열수추출물은 세포 성장에 영향을 미치지 않은 농도에서 멜라닌생성을 억제하며 세포 수준의 tyresinas우활성을 억제하며 나아가 멜라닌형성관련 효소인 tyrosinase, TRP-1 단백질의 발현을 Western blot으로 재검정 하였다. 이상의 결과는 사인의 열수추출물이 세포 수준에서 tyrosinase활성 뿐 아니라 그 발현을 억제함으로써 궁극적으로 멜라닌생성을 저해하는 것을 볼 수 있다.
- 사인의 열수추출물과 a-MSH를 처리한 다음 5일간 배양 후 배양액을 취하여 B16F10세포가 세포외로 분비되는 멜라닌 양을 조사하였다. Fig.
- 사인의 열수추출물은 사인 100 g을 증류수 2,000 ml에 넣어 90℃에서 3시간 동안 추출하였으며 3z000 rpm으로 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 pore size가 0.45 인 filter로 여과한 다음 동결건조 하였다 (수득율 8.5 %). 이를 10% fetal bovine serum (FBSZ Gibco BRL)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL)이 함유된 Dulbccco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL)을 이용하여 100 mg/ml의 농도를 시료로 사용하였다
- 사인의 열수추출물이 a-MSH에 의해 유도된 B16F10 흑색종세포의 멜라닌형성에 대한 영향을 조사하였다. 세포의 성장 및 형태에 있어서는 영향을 미치지 않는 0.
- 사인의 열수추출물이 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2와 같은 멜라닌형성에 관여하는 효소발현을 Western blot으로 살펴보았다. Fig.
- Synthetic melanin을 이용하여 농도별 표준곡선을 작성한 후 멜라닌의 농도를 측정하였다. 세포외 멜라닌은 B16F10 세포의 배양 상층 액을 취하여 404 nm에서 흡광도를 측정하고, 세포의 수를 계수하여 한 개의 세포가 분비한 melanin의 양을 계산하여 대조군을 100%로 놓고 상대적인 값을 측정하였다.
- 배양하였다. 실험을 위하여 배양 플라스크에 부착되어 있는 B16F10 세포를 trypsin-EDTA (Gibco BRL)로 부유시켜 1×105개로 100 mm 배양 용기에 나눈 다음, 24시간 동안 안정화시킨 후, 사인의 열수추출물과 a-MSH을 처리하여 2일 또는 5일 간 배양하였다.
- 5 %). 이를 10% fetal bovine serum (FBSZ Gibco BRL)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL)이 함유된 Dulbccco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL)을 이용하여 100 mg/ml의 농도를 시료로 사용하였다
- 25% sodium deoxycholate, 150 mM NaClz 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM sodium orthovanadate, 1 /2gmC aprotinin, leupeptin, pepstatin)로 lysis를 실시하고, 14, 000 rpm에서 25분간 원심분리하여 단백질을 포함하는 상층액을 얻어내어 Bradforde method에 따라 정량한 후 Laemlfs sample buffer와 섞어 3분간 끓인 후 8%의 polyacrylamide gel상에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, g이상의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 옮겨 10% skim milk로 blocking을 한 후, 순차적으로 일차항체 및 이차 항체를 처리한 후 enhanced chemiluminoescence method로 발광시켜 X-ray 필름에 감광하였다.
대상 데이터
- Arbutin, synthetic melanin, L-DOPA 와 a-melanocyte stimulating hormone (q-MSH)는 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, tyrosinase (H-109, sc-15341), TRP-1 (G-17, sc-10443) 및 TRP-2 (G-15, sc-10452) 와 같은 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.
- B16F10세포의 배양을 위해 90%의 DMEM에 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 포함된 성장 배지를 사용하였으며, 5%의 CO2가 공급되는 37℃ humidity incubator 에서 배양하였다. 실험을 위하여 배양 플라스크에 부착되어 있는 B16F10 세포를 trypsin-EDTA (Gibco BRL)로 부유시켜 1×105개로 100 mm 배양 용기에 나눈 다음, 24시간 동안 안정화시킨 후, 사인의 열수추출물과 a-MSH을 처리하여 2일 또는 5일 간 배양하였다.
성능/효과
- 4와 같다, a-MSH에 의해 유도된 tyrosinase 활성은 약 663% 증가하였다. 0.5와 1.0 mg/ml 농도의 사인 열수추출물 처리를 처리했을 때 대조군에 비해 각각 87.9%, 68.9% 감소하였으며 arbutine 50.3%가 감소하였다.
- 1 mg/ml의 농도로 처리하고 실험군과 같은 조건으로 배양하여 대조군으로 사용하였다. Fig. 2에 보는 바와 같이 0.5와 1.0 mg/ml 농도의 사인의 열수추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 각각 81.7%, 25.2%로 감소하였으며 특히 10 mg/ml 농도는 58.1%를 나타내는 0.1 mg/ml 농도의 arbutin에 비해 높은 억제효과를 나타내었다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 0.5와 1.0 mg/ml 농도의 열수추출물에서 각각 62.0%, 97.3% 세포외 멜라닌분비에 억제효과를 보였으며 83.3%의 arbutin과는 차이를 보여 주지 않았다.
- a -MSH의 처리는 B16F10 세포를 크게 확장시키며, 수지상의 돌기를 형성하게 하며 세포 내 색소침적을 형성한다. MTT assay를 통해 정해진 농도의 사인 열수 추출물이 B16F10세포의 형태와 세포 주기에 미치는 영향을 볼 때 세포성장시기에 해당하는 G1 기의 비율이 열수추출물처리와 괸계없이 유사하게 나타나 세포의 성장에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
- 0 mg/ml 농도의 열수추출물에 의해 멜라닌 생성이 억제되었다. 동일 농도에서 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase활성이 억제되며 멜라닌형성관련 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 발현을 살펴 본 결과 tyrosinase와 TRP-1의 발현이 열수추출물에 의해 저해되었다. 이상의 결과로 보아 사인의 열수추출물은 tyrosinase활성과 발현을 함께 억제함으로서 멜라닌생성을 저해함을 알 수 있으며 이는 미백관련 화장품 또는 의약품 개발에 대한 기초 자료로 유용할 것이다.
- 멜라닌생성에 관해 조사한 동일한 농도의 사인 열수추출물과 q-MSH를 함께 처리한 후 2일간 배양하여 tyrosinase활성도를 측정한 결과는 Fig. 4와 같다, a-MSH에 의해 유도된 tyrosinase 활성은 약 663% 증가하였다. 0.
- 멜라닌형성에 대한 영향을 조사하였다. 세포의 성장 및 형태에 있어서는 영향을 미치지 않는 0.5 및 1.0 mg/ml 농도의 열수추출물에 의해 멜라닌 생성이 억제되었다. 동일 농도에서 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase활성이 억제되며 멜라닌형성관련 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 발현을 살펴 본 결과 tyrosinase와 TRP-1의 발현이 열수추출물에 의해 저해되었다.
- 발현을 Western blot으로 재검정 하였다. 이상의 결과는 사인의 열수추출물이 세포 수준에서 tyrosinase활성 뿐 아니라 그 발현을 억제함으로써 궁극적으로 멜라닌생성을 저해하는 것을 볼 수 있다. 따라서 사인의 열수 추출물을 더 진행된 분획과정을 통해 보다 효능이 높은 물질로 순수 분리를 통한다면 미백 관련 화장품이나 약제 개발에 대한 기초 자료로 유용할 것이다.
후속연구
- 이상의 결과는 사인의 열수추출물이 세포 수준에서 tyrosinase활성 뿐 아니라 그 발현을 억제함으로써 궁극적으로 멜라닌생성을 저해하는 것을 볼 수 있다. 따라서 사인의 열수 추출물을 더 진행된 분획과정을 통해 보다 효능이 높은 물질로 순수 분리를 통한다면 미백 관련 화장품이나 약제 개발에 대한 기초 자료로 유용할 것이다.
- 동일 농도에서 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase활성이 억제되며 멜라닌형성관련 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 발현을 살펴 본 결과 tyrosinase와 TRP-1의 발현이 열수추출물에 의해 저해되었다. 이상의 결과로 보아 사인의 열수추출물은 tyrosinase활성과 발현을 함께 억제함으로서 멜라닌생성을 저해함을 알 수 있으며 이는 미백관련 화장품 또는 의약품 개발에 대한 기초 자료로 유용할 것이다.
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