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문제 정의
- 어려움이 있었다. 본 연구에서는 제모제를 사용하여 털을 제거한 C57BL/6N 생쥐모델을 이용하여 측백엽을 시중에서 구입한 건조한 것, 생측백을 건조한 것과 건조하지 않은 것으로 나누어 acetone과 MeOH로 추출하여 C57BL/6N 생쥐 피부에 도포한후 發毛效果를 육안적으로 관찰하고, 조직내 모낭과 비만세포의숫적 변화 그리고 비장과 흉선내 림프구의 변화를 관찰하여 측백엽의 발모효과를 실험적으로 입증하고자 시도하였다.
제안 방법
- 1% minoxidil군은 3% minoxidil(마이녹실, 현대약품)을 50% 에탄올에 희석하여 1% 용액으로 만들어 사용하였고, 대조군은 50% 에탄올만을 동량 도포하였다.
- 발모현상은 관찰할 수 없었다. 1% minoxidil을 피부에 도포한 실험대조군의 실험 14일째에는 8/8마리에서 제모된 목과등부위 피부영역 전체에서 발모현상을 관찰하였다. 측백엽-1을 도포한 후 실험 14일째에는 등 전체에 발모가 된 경우가 6/8마리 관찰되었고, 2/8마리에서는 등의 일부분에서만 발모현상을 관찰할 수 있었다.
- 6일째 제모제를 사용하여 털을 완전히 제거한 날을 실험 1일째로 정하여 피부에서 일어나는 發毛와 관련된 특징들을 16일째까지 관찰히면서 디지털카메라를 이용하여 3일 10일, 14, 16일째에 촬영하였고 더욱 세밀한 관찰을 위하여 handscope를 이용하여 3일, 10 일, 14일 및 16일째에 색소 침착부위와 발모부위를 촬영하였다.
- 건조한 측백엽 acetone 추출물(측백엽-1), 생측백엽 acetone 추출물(측백엽-2) 및 메탄올 추출물(측백엽-3)을 이용하여 제모제를 사용하여 제모한 C57BL/6N 생쥐의 피부에 약 3주간 도포한 후 발모효과를 육안, 광학, 면역조직화학기법 및 비장과 흉선의 T & B 림프구와 아세포의 변화를 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 여러 가지 용매를 이용하여 추출한 측백엽 추출물을 도포한 후실험 10일째에 육안적으로 관찰한 바 측백엽-1 도포군에서는 등 전체에 발모가 일어난 경우가 3/8마리 관찰되었고, 5/8마리에서는 등의 일부분에서만 발모현상을 관찰할 수 있었다.
- 건조한 측백엽 acetone 추출물, 생측백엽 acetone 추출물 및생측백엽 MeOH 추출물을 이용하여 제모제를 사용하여 제모한 C57BL/6N 생쥐의 피부에 약 3주간 도포한 후 발모효과를 육안, 광학현미경적 변화 및 비장과 흉선의 T & B 림프구와 아세포의 변화를 관찰하였다.
- formalin 용액으로 고정하였다. 고정 후 일반적인 방법에 의하여 수세와 탈수과정을 거쳐 paraffin으로 포매하였으며, 포매후 7㎛의 절편을 제작하여 H&E 염색을 시행하여 1000㎛당발생중인 hair follicle의 수, 피부두께 및 조직의 변화를 관찰하였다.비만세포 수의 변화를 관찰하기 위하여 toluidine blue 염색을 시행하였으며, 피부 조직내 여러가지 neuropeptide와 cytokine을 관찰하기 위하여 면역 조직화학적 염색법을 이용하였다.
- 1M PB 수세과정을 거친 후 peroxidase가 표지된 ABC 용액에 담가 실온에서 1시간 가량 반응시켰다. 그후 다시 0.1M PB 로 15분간 2회 수세하고 나서 30 mg 의 3-3’ diaminobenzidine를 150ml의 0.1M PB에 녹인 용액에서 5분간반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 5분간 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 다시 0.
- 위하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. 면역조직화학 염색을 위하여 박절한 조직을 0.1M phosphate buffer(PB)로 세척한 후 조직 절편내에 내재되어 있을 과산화효소를 제거하기 위하여 0.3% HQ)루 처리하고 1% normal goat serum과 0.3% triton X-100으로 1시간 처리하여 비특이성 항원의 반응을 제거하였다, 1차항체는 rabbit polyclonal antibody(Santa cruz)인 vascular endothelial growth factor(VEGF), protein kinase C-a (PKC-a), 그리고 stem(mast) cell factor(SCF)를 각각 l;100, l:50z 1:50으로 희석하여 조직절편에 떨어뜨려 실온에서 12시간 동안반응시켰다. 이때 1차 항체의 희석은 0.
- 005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 5분간 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 다시 0.1M PB 로 여러차례 수세하고 hematoxylin으로 20초간 대조염색한 후통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 8g을 얻었다. 생측박엽 acteone 추출물(측백엽-2)은 자연상태에서 채취하여 음건한 생측백엽 2kg을 상기와 같은 방법으로 추출한 후 동결건조기를 사용하여 건조시켜 28.9g을 회수하였고 생측백엽 MeOH 추출물(측백엽-3)도 MeOH 80% 용매를 이용하여 음건한 생측박엽 2kg을 상기한 동일한 방법으로 추출한 후 동결건조하여 으5.4g을 회수하여 본 실험에 사용하였다.
- 실험 10일째와 14일째 비만세포의 숫적 변화를 관찰하기 위하여 toluidin blue 염색을 시행하였다. 10일째 대조군의 비만세포의 수(전체적인 비만세포/탈과립 된 비만세포의 수)는 11.
- 실험 16일째에 C57BL/6N 생쥐의 모든 군에서 T & B 림프구의 변화를 관찰하기 위하여 경추를 탈구시켜 비장 및 흉선을 적출한 후, 비장 및 흉선세포 부유액을 조제하고 IxltfWiis/well에 PE conjugated-anti B220 및 FITC-anti Thyl antibody와 PE-anti CD4/FITC~anti CD8 monoclonal antibody(l:30 dilution)로 이중염색하여 4℃에서 30분간 반응시키고 laser flow cytometer (excitation: 488nm, emission: 525nm/FITCz 575nm/PE)를 이용하여 각각의 세포 중의 림프구의 아집단을 측정하였다22).
- 실험군(측백엽-1, 2, 3)은 제조한 시료 12g을 각각 50% 에탄올 30 에 녹여 하루에 2회 200니/1회를 피부에 도포하였다. 1% minoxidil군은 3% minoxidil(마이녹실, 현대약품)을 50% 에탄올에 희석하여 1% 용액으로 만들어 사용하였고, 대조군은 50% 에탄올만을 동량 도포하였다.
- 실험동물들은 털을 완전히 제거하기 전에 소동물용 이ipper 를 이용하여 털을 깍은 후 5일동안 각각의 시료들을 이용하여 하루 2회씩 미리 피부에 도포하였다. 그 후 6일째에 제모제(비키로크림, 태극약품)를 이용하여 각 군의 등쪽 피부에 도포하여 털을 완전히 제거한 후 흐르는 물로 남은 제모제를 수세하였다.
- 실험의 정확성을 위하여 모두 출생날짜가 유사한 것을 이용하였으며, 실험군은 5개의 군으로 설정하여 대조군, 1% minoxidil 투여군, 건조측백엽 acetone 추출물(측백엽.1), 생측백엽 acetone 추출물(측백엽-2) 및 생측백엽 MeOH 추출물(측백엽-3)을 도포한 군으로 나누어 실험에 이용하였다.
- 피부내 모낭의 수와 비만세포의 숫적 변화를 조직학적으로 관찰하기 위하여 약물 도포 후 10일째에 3마리씩 희생시켜 등쪽피부의 발모된 부위를 척추선에 평행하게 절개하여 normal buffered formalin 용액으로 고정하였다. 고정 후 일반적인 방법에 의하여 수세와 탈수과정을 거쳐 paraffin으로 포매하였으며, 포매후 7㎛의 절편을 제작하여 H&E 염색을 시행하여 1000㎛당발생중인 hair follicle의 수, 피부두께 및 조직의 변화를 관찰하였다.
- 피부조직내 털의 성장과 관련된 여러가지 cytokine을 관찰하기 위하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. 면역조직화학 염색을 위하여 박절한 조직을 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약재는 시중에서 구입한 국산 약재로서 건조한 측백엽 acetone 추출물(측백엽-1)은 약재 2kg을 acetone 80% 용매에 넣어 실온에서 1주일간 방치한 후에 여과과정을 거친 여액을 감압농축기로 농축하였다. 농축액을 냉장보관한 후침전된 레진은 제거하였다.
- 실험동물은 체중 25g 내외의 숫놈 6주령 C57BL/6N 정상생쥐 40마리를 이용하였으며 각군에 8마리씩 배정하였다. 실험의 정확성을 위하여 모두 출생날짜가 유사한 것을 이용하였으며, 실험군은 5개의 군으로 설정하여 대조군, 1% minoxidil 투여군, 건조측백엽 acetone 추출물(측백엽.
데이터처리
- 모든 자료는 mean ± SE이며, 통계학적 유의성 검정은 students t test에 의하여 검정하였다. P값은 P < 0.
이론/모형
- 3% Triton X-100 (Sigma)이섞여 있는 것을 사용하였다. 그 후 조직절편들은 실온에서 15분간 2회 0.1 M PB로 세척하며 Hsu 등의 방법에 따라 2차 항체인 1:200으로 희석된 biotinylated anti-rabbit IgG (Vector Laboratories, Inc.)에 실온에서 1시간 가량 반응시켰다. 다시 15 분간 2회 0.
- 고정 후 일반적인 방법에 의하여 수세와 탈수과정을 거쳐 paraffin으로 포매하였으며, 포매후 7㎛의 절편을 제작하여 H&E 염색을 시행하여 1000㎛당발생중인 hair follicle의 수, 피부두께 및 조직의 변화를 관찰하였다.비만세포 수의 변화를 관찰하기 위하여 toluidine blue 염색을 시행하였으며, 피부 조직내 여러가지 neuropeptide와 cytokine을 관찰하기 위하여 면역 조직화학적 염색법을 이용하였다.
성능/효과
- PKC-a에 대한 면역반응은 대조군에서는 표피, bulge, stem cell, 입모근 및 진피의 유두에서 강한 면역반응을 나타내었고, 1% minoxidil을 도포한 실험대조군에서는 표피, stem cel1, 생장기줌의 모간 주위의 내, 외모근초 및 모구(hair bulb)에서 강한 면역반응을 나타내었다. 그러나 측백엽1, 2, 3군에서는 bulge, 내외모근초 및 동피근에서 미약한 면역반응을 나타내었다.
- SCF에 대한 면역반응은 대조군에서는 표피, bulge, stem cell 및 진피의 유두에서 미약한 면역반응을 나타내었고, 1% minoxidil을 도포한 실험대조군에서는 성장기 말기의 외모근초에서 강한 면역반응을 나타내었고, 그 외의 표피, stem cell, 생장기중의 모간 주위의 내, 외모근초 및 모구(hair bulb)에서는 중등도의 면역반응을 나타내었다. 측백엽2, 3군에서는 bulge와 내, 외모근초 및 동피근에서 중등도의 면역반응을 나타내었다.
- 側柏葉을 메탄올로 추출하여 항균활성을 관찰하면 그람양성균, 그람음성균 및 곰팡이균에 모두 항균력을 나타냈으며, 여러가지 용매로 분획한 후 항균력을 관찰하면 크로로포름과 에틸아세테이트 분획층에서 강한 항균력을 나타낸다고 하였고, 특히 에틸아세테이트 분획층에서 그람양성균, 그람음성균 및 곰팡이균의 현저한 생육억제 효과가 나타났다고 하였다.
- 그러나 실험 10일째에는 1/8마리에서 전체적으로 발모가 일어나기 시작하였고 7/8마리에서는 전체적으로 등의 피부가 검게 변하였으나 육안적인 발모현상은 관찰할 수 없었다. 건조한 측백엽 acetone 추출물(측백엽-1), 생측백엽 acetone추출물(측백엽 -2) 및 생측백엽 MeOH 추출물(측백엽-3)을 도포한 후 실험 10일째에 육안적으로 관찰한 바 측백엽-1군에서는 전체적으로 발모가 일어난 경우가 3/8마리 관찰되었고, 5/8마리에서는 등의 일부분에서만 발모현상을 관찰할 수 있었다. 측백엽-2군에서는 6/8마리에서 등 전체가 회색으로 변하면서 발모가 일어났으며 2/8마리에서는 등의 일부분에서만 약간 회색으로 변하면서 발모가 일어났다.
- 측백엽은 생발오발(生髮烏髮尸, 흑윤발발(黑潤髮發), 독발(禿髮), 생기(生肌) 등의 효능이 있고 또한 禿髮치료 효과에 대한 임상연구가 보고되었다2. 그러므로 측백엽의 발모촉진에 대한 효능을 실험적으로 규명한 바 유의한 실험결과를 얻었다.
- 2%로 대조군보다 증가하였다. 또한 비장내 T림프구중의 Th/Tc 양성세포의 비율은 대조군이 7.5±0.8/5.3±0.4%, 1% minoxidil 도포군이 12.0±0.6/7.0±0.6%로서 대조군에 비하여 1% minoxidil 도포군이 유의성있게 증가하였다. 실험군인 측백엽」 군과 측백엽-2군에서는 대조군과 유사하였으나 측백엽-3군에서도 대조군보다 유의성있게 증가하였다(Fig.
- 본 실험에서 건조한 측백엽 acetone 추출물, 생측백엽 acetone추출물 및 메탄올추출물을 도포한 후 16일째에 육안적으로 관찰한 바 대조군의 실험 16일째에는 3/8마리에서 반점형태로 극히 일부분에서만 발모가 일어났으며, 나머지 5/8마리에서는 등쪽의 피부 일부에서만 회색 반점을 띄어 육안적인 발모현상은 관찰할 수 없었다. 제모된 목과 등부위 피부영역 전체에 완전히 발모된 경우는 1예도 관찰할 수 없었으며, 전체적으로 제모된 피부영역의 약 5%정도의 발모율을 나타내었다.
- 본 실험에서 제모 후 10일째의 혈관내피세포성장인자 (VEGF)에 대한 면역반응은 대조군에서는 표피, bulge, stem cell, 입모근 및 진피의 유두에서 강한 면역반응을 나타내었고, 1% minoxidil을 도포한 실험대조군에서는 표피, stem cell, 생장기중의 모간 주위의 내, 외모근초 및 모구(hair bulb)에서 강한 면역반응을 나타내었다. 측백엽-1군에서는 전체적으로 미약한 반응을 보였으나 동피근에서는 강한 면역반응을 나타내었다.
- 측백엽-1, 2, 3군에서는 bulge, 내, 외모근초 및 동피근 등에서 중등도의 면역반응을 나타내었다. 본 실험의 결과는 대조군에 비하여 측백엽추출물 도포군에서 SCF의 면역반응의 강도가 강하게나타냄으로써 모낭의 빠른 성장을 촉진할 것으로 사료되었다.
- Li 등44)은 퇴행기의 모낭이나 털을 뽑은 후 1일째에는 PKGa에 대한 면역반응은 나타나지 않는다고 하였으나 뽑은 후 10일과 17일째인 털의 성장주기의 성장기 중기와 퇴행기 초기에는 외모근초에 면역반응을 나타낸다고 하였다. 본실험에서는 대조군에서 PKC-Q에 대한 강한 면역반응을 보여 모낭이 성장기에있다는 것을 암시하며, 측백엽 실험군에서는 PKC-a에 대한 미약한 반응을 보임으로써 모낭이 빠르게 퇴행기로 이행하고 있음을 암시하고 있다. 이러한 실험결과는 측백엽주출물 도포군이 대조군에 비하여 털의 빠른 성장을 촉진시킨다는 것을 의미한다.
- 1%로 대조군보다 B 림프구의 수는 감소하였다. 비장세포 중 T림프구의 분포는 대조군에서는 12.6±1.0% 이었고 1% minoxidil 도포군에서는 16.8+1.2 %로서 대조군에 비하여 1% minoxidil 도포군이 유의성있게 증가하였다. 그러나 측백엽-1군과 측백엽-3군은 각각 11.
- 실험 10일째에 대조군(50% 에탄올), 실험대조군(1% minoxidil), 측백엽-1군, 측백엽-2군 및 측백엽-3군에서 가장 많이발모된 개체 2마리의 조직절편을 제작하여 H&E 염색을 시행하여 관찰한 바 대조군에서의 성숙한 모낭의 수는 관찰할 수 없었으며 직경 1-2㎛정도의 작은 모낭이 진피층에서 형성되었으나, 아직 피하층까지는 자라지 못하였다. 피부의 평균 두께는 252.
- 6%로서 대조군에 비하여 1% minoxidil 도포군이 유의성있게 증가하였다. 실험군인 측백엽」 군과 측백엽-2군에서는 대조군과 유사하였으나 측백엽-3군에서도 대조군보다 유의성있게 증가하였다(Fig. 10).
- 얻었다. 여러 가지 용매를 이용하여 추출한 측백엽 추출물을 도포한 후실험 10일째에 육안적으로 관찰한 바 측백엽-1 도포군에서는 등 전체에 발모가 일어난 경우가 3/8마리 관찰되었고, 5/8마리에서는 등의 일부분에서만 발모현상을 관찰할 수 있었다. '측백엽-2 도포군에서는 6/8마리에서 등 전체가 회색으로 변히면서 발모가 일어났으며 2/8마리에서는 등의 일부분에서만 약간 회색으로 변하면서 발모되었다.
- 여러가지 용매를 이용하여 추출한 측백엽추출물을 16일 동안 피부에 도포한 후 비장내 T림프구 중의 Th/Tc양성세포의 비율은 실험군인 측백엽-1군과 측백엽-2군에서는 대조군과 유사하였으나 측백엽-3군에서는 대조군보다 유의성있게 증가하였다. 흉선내 T 림프구의 아형, 즉 Th/Tc 림프구를 관찰한 바 실험군인 측백엽-2군의 Th 림프구는 대조군과 유사하였으나 측백엽-1군과 측백엽-3군의 Th 림프구는 대조군에 비하여 증가하였다.
- Stem cell factor(SCF)는 Kit-tyrosine kinase re%ptor(Kit)를 가진 피부의 mast cell과 melanocyte] 성숙과 증식을 조절하는 물질로서 상피에서 유래한 또는 mesenchymal-derived SCF에 반응을한다. 이러한 인자들은 생장기 모낭에서 강한 면역반응을 나타내며, 주로 색소침작부위나 진피유두에 강한 양성반응을 나타낸다 하였고 털의 성장주기에 의존적으로 강하게 반응을 한다고 하였다, 본 실험의 stem cell factor에 대한 면역반응은 제모후 10일째의 대조군에서는 표피, bulge, stem cell 및 진피의 유두에서 미약 면역반응을 나타내었고, 1% minoxidil을 도포한 실험대조군에서는 성장기 말기의 외모근초에서 강한 면역반응을 나타내었고, 그 의의 표피, stem cell, 생장기중의 모간 주위의 내, 외모근초 및 모구(hair bulb)에서는 중등도의 면역반응을 나타내었다. 측백엽-1, 2, 3군에서는 bulge, 내, 외모근초 및 동피근 등에서 중등도의 면역반응을 나타내었다.
- 발모현상은 관찰할 수 없었다. 제모된 목과 등부위 피부영역 전체에 완전히 발모된 경우는 1예도 관찰할 수 없었으며, 전체적으로 제모된 피부영역의 약 5%정도의 발모율을 나타내었다(Fig. 1). 1% minoxidil을 피부에 도포한 실험대조군의 실험 16일째에는 8마리 전체에서 제모된 목과 등부위 피부영역 전체에서 약 100%의 발모현상을 관찰하였다(Fig.
- 발모현상은 관찰할 수 없었다. 제모된 목과 등부위 피부영역 전체에 완전히 발모된 경우는 1예도 관찰할 수 없었으며, 전체적으로 제모된 피부영역의 약 5%정도의 발모율을 나타내었다(Fig. 1).
- 조직학적 변화는 실험 14일째 대조군을 제외한 모든 실험군에서 피부를 뚫고 나오는 발모현상을 관찰할 수 있었으며, 비만세포의 숫적 변화는 모든 측백엽 도포군에서 감소하였으나 실험 14일째에는 큰 차이를 관찰할 수 없었다. 혈관내피세포성장인자와 PKC-a에 대한 면역반응은 대조군에 비하여 측백엽 도포군에서 미약하였으며, stem cell factor에 대한 면역반응은 대조군에 비하여 측백엽 도포군에서 강한 면역반응을 나타내었다.
- 2㎛ 이었다. 측백엽-1군의 성숙한 모낭의 수는 19.3±4.1개 이었으며 여러 단계의 발생중인 성숙한 모낭들이 피하층에서 관찰되었고 피부를 뚫고 발모가 시작됨을 알 수 있었다. 피부의 평균두께는 471.
- 혈관내피세포성장인자에 대한 면역반응은 대조군에서는 표피, bulge, stem cell, 입모근 및 진피의 유두에서 강한 면역반응을 나타내었고, 1% minoxidil을 도포한 실험대조군에서는 표피, stem cell 생장기중의 모간 주위의 내, 외모근초 및 모구(hair bulb)에서 강한 면역반응을 나타내었다. 측백엽-1군에서는 전체적으로 미약한 반응을 보였으나 동피근에서는 강한 면역반응을 나타내었다.
- 혈관내피세포성장인자와 PKC-a에 대한 면역반응은 대조군에 비하여 측백엽 도포군에서 미약하였으며, stem cell factor에 대한 면역반응은 대조군에 비하여 측백엽 도포군에서 강한 면역반응을 나타내었다.
후속연구
- 이상의 실험결과로 측백엽 추출물들은 털의 성장 촉진과 관련이 있음을 실험적으로 입증한 바 양모제로 이용될 수 있으리라 사료된다.
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