In the recent, increased concern has been focused on the pharmacology and clinical utility of herbal extracts and derivatives as a drug or adjunct to chemotherapy and immunotherapy. Salicis Radicis Cortex, A decoction has been mainly used for improvement of ozena and a diuretic effect in oriental me...
In the recent, increased concern has been focused on the pharmacology and clinical utility of herbal extracts and derivatives as a drug or adjunct to chemotherapy and immunotherapy. Salicis Radicis Cortex, A decoction has been mainly used for improvement of ozena and a diuretic effect in oriental medicine, but there was no study on the molecular mechanism of Salicis Radicis Cortex as an immunomodulator. Here we investigated the role of the aqueous extract of Salicis Radicis Cortex in the expression of inflammatory mediators, surface molecule, and related receptors in vitro and in vivo. In murine macrophage RAW 264.7 cells and peritoneal macrophages of C57BL/6N mice, water extract of Salicis Radicis Cortex increased the production of secretary TNF-alpha and Nitric oxide, and the expression level of CD14, LPS co-receptor and CD86, co-stimulatory molecule compared to negative natural extract ex vivo. Moreover, i.p. injection of water extract of Salicis Radicis Cortex significantly increased the secretion level of IFN-gamma and TNF-alpha, IL-2, IL-4 and IL-5 in serum of mice in vivo. Taken together, these results suggest that Salicis Radicis Cortex may regulate the immune response by secreting Th1 and Th2 types of cytokines in vivo and the possibility of its as natural immunostimulator.
In the recent, increased concern has been focused on the pharmacology and clinical utility of herbal extracts and derivatives as a drug or adjunct to chemotherapy and immunotherapy. Salicis Radicis Cortex, A decoction has been mainly used for improvement of ozena and a diuretic effect in oriental medicine, but there was no study on the molecular mechanism of Salicis Radicis Cortex as an immunomodulator. Here we investigated the role of the aqueous extract of Salicis Radicis Cortex in the expression of inflammatory mediators, surface molecule, and related receptors in vitro and in vivo. In murine macrophage RAW 264.7 cells and peritoneal macrophages of C57BL/6N mice, water extract of Salicis Radicis Cortex increased the production of secretary TNF-alpha and Nitric oxide, and the expression level of CD14, LPS co-receptor and CD86, co-stimulatory molecule compared to negative natural extract ex vivo. Moreover, i.p. injection of water extract of Salicis Radicis Cortex significantly increased the secretion level of IFN-gamma and TNF-alpha, IL-2, IL-4 and IL-5 in serum of mice in vivo. Taken together, these results suggest that Salicis Radicis Cortex may regulate the immune response by secreting Th1 and Th2 types of cytokines in vivo and the possibility of its as natural immunostimulator.
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문제 정의
본 연구에서는 대식세포 활성에서 유근피의 면역조절 효과를 실험 하였다. 유근피 추출물은 RAW 264.
In vivo 모델에서는, 유근피를 경구 투여한 마우스의 혈액에서 혈장을 분리하여 TNF-a, IFN-rz IL-2, IL-4 및 IL・5의 사이토카인을 측정한 결과 모두 증가하여 Thl과 Th2 반응에 관여함을 보여줬다. 이러한 결과는 유근피가 대식세포로부터 분비된 NO 생성증가와 T cell로부터 분비되는 사이토카인의 조절을 통해 면역 증강효과를 나타내고 있음을 제시해준다.
이에 저자들은 천연약품자원으로부터 면역 증강 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명의 유근피 추출물이 암세포의 증식을 억제하는 NO 생성 증가효과, 세포와 관련된 사이토카인발현 증가 효과 및 CD 14의 발현 증가 효과를 확인하였다.
제안 방법
7 세포를 96 well plate에 IXlO'cells/well씩 분주한 후 100 ug/ml의 상기 유근피 물 추출물을 처리하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 후 상층액을 취하여 Griess reagent를 이용해 595nm에서 NO의 양을 측정하였다. Peritoneal macrophage cells/well을 분주한 후 NO를 측정하였다.
Spelnocytes를 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다. C57BL/6 mouse 복강에 3% thioglycollate 를 주입하고, 4일 뒤 경추탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 PBS를넣어 peritoneal macrophage를 분리하였다. 분리된 macrophage 는 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다.
57% solids-latex)(108 particles/ml) lOOul 를 첨가해 37℃ 에서 30 분간 shaking incubtion을 하였다. Ice cold PBS를 첨가해 반응을 멈추게 한후, 세포를 FACS분석하였다.
Monoclonal antibody, isotype-matched control로 ice에서 30분간 staining을 하였다, Staining된 세포는 FITC anti-mouse MHC class Ⅱ, FITC anti-mouse CD80z CD86, PE-anti-mouse Toll like receptor 4 (TLR4)/MD-2Z PE-anti~mouse CD14로 staining을 한 후/ FACS Calibur (Becton-Dickinson)으로 분석을 하였다.
RAW 264.7 세포와 peritoneal macrophage에 유근피 추출물 WOug/mL LPS 10ug/ml을 24시간, 48시간 처리한 후 Griess 반음으로 NO 생성을 측정하였고 ELISA 방법으로 TNF-a를 측정하였다. 유근피 추출물이 NO 생성에 미치는 효과와 염증 매개 물질인 TNF-a 분비능력을 알아보기 위해 실험을 실시한 결과 Fig.
RAW264.7과 peritoneal macrophage 에 유근피 추출물 100ug/ml을 첨가한 후, 37℃에서24시간, 48시간 처리하였다. LPS는 양성 대조군으로 10 ug/ml을 처리하였다 상층액을 취하여 sandwich ELISA 방법으로 TNF-a의 양을 측정하였다.
1200rpm, 10분간 원심분리한 후 증류수를 이용하여 적혈구를 파괴하였다. Spelnocytes를 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다. C57BL/6 mouse 복강에 3% thioglycollate 를 주입하고, 4일 뒤 경추탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 PBS를넣어 peritoneal macrophage를 분리하였다.
사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹 당 2마리씩의 동물에 유근피 추출물 100㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다 유근피 추출물 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.
각 그룹당 2마리씩의 동물에 유근피 물 추출물을 100 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변하, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
그리고 CBA kit를 이용하여 혈청내의 싸이토카인 분비 정도를 확인하였다. 결과는 Fig 4.
마우스 대식세포를 분리하여 1X106세포에 유근피 추출물을 100ug/ml을 24시간 처리한 뒤 1% BSA로 블로킹하고, CD86과 CD80 세포표면 항체로 FACS 분석을 실시하였다. 각 항체의 양은 0.
마우스에 유근피 물 추출물 4mg/500ul를 복강에 주입하고 7일 후에마우스의 혈액을 심장에서 채혈하여 혈청을 분리하였다 그리고 CBA키트(cytokine assay kit, BD science)를 이용하여 혈청 내의 사이토카인 분비 정도를 확인하였다.
대상 데이터
6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹 당 2마리씩의 동물에 유근피 추출물 100㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다 유근피 추출물 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.
한국식 물추출물은행 으로부터 분양받은 유근피 를 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여 건조된 유근피 3kg에 100% 물 120L를 가하여 7CTC에서 가열 추출을 3회 행한 후, 여과하고 감압 농축하여 동결건조한 후 유근피 추출물 635.5g을 수득하였다.
이론/모형
7과 peritoneal macrophage 에 유근피 추출물 100ug/ml을 첨가한 후, 37℃에서24시간, 48시간 처리하였다. LPS는 양성 대조군으로 10 ug/ml을 처리하였다 상층액을 취하여 sandwich ELISA 방법으로 TNF-a의 양을 측정하였다.
성능/효과
또한 항원 존재 세포에서 발현하는 B7 분자인 CD86의 발현이 음성대조군에 비해 증가하였고 LPS와 LBP복합체의 공통 수용체인 CD14의 발현이 현저히 증가하였다. In vivo 모델에서는, 유근피를 경구 투여한 마우스의 혈액에서 혈장을 분리하여 TNF-a, IFN-rz IL-2, IL-4 및 IL・5의 사이토카인을 측정한 결과 모두 증가하여 Thl과 Th2 반응에 관여함을 보여줬다. 이러한 결과는 유근피가 대식세포로부터 분비된 NO 생성증가와 T cell로부터 분비되는 사이토카인의 조절을 통해 면역 증강효과를 나타내고 있음을 제시해준다.
세포표면 항체로 FACS 분석을 실시하였다. 각 항체의 양은 0.25ug/lXl06으로 처리한 후 LPS 10ug/ml을 처리한 양성 대조군과 비교하여 결과를 분석하였다 그 결과 Fig. 3에서 보여지는 바와같이, 항원 존재세포(antigen presentation cel1)에서 발현하는 B7 분자인 CD86의 발현이 상기 유근피 추출물 처리시 음성대조군(천궁및 정향)에 비해 증가하였고, LPS와 LBP 복합체(complex)의 공동수용체(co-receptor)인 CD14의 발현이 현저히 증가하였다.
그리고 CBA kit를 이용하여 혈청내의 싸이토카인 분비 정도를 확인하였다. 결과는 Fig 4.에서 보는 바와 같이 유근피 추출물을 복강 주입하였을 때, TNF-a, IFN-r, IL-2, IL-4 및 IL-5의 사이토가인의 발현이 증가하였다.
형성에 장애가 발생한다. 결과적으로, 환자들은 종종 빈혈과 림프구 감소증, 혈소판 감소증 또는 과립 백혈구 감소증을 경험하게 되며, 이것은 심각하고 치명적인 감염을 일으키고 환자들의 사망률을 높이게 된다. 임상적으로, 항암치료나 골수이식후에 골수성장인자인 G-CSF, GM-CSF, IL-1-12, N-CSF 및 EPO 등을 사용하고 있으며, 이들 성장인자는 서로 상승작용을 일으키면서 CFU 와 BFU에서부터 세포 분화 및 생성을 촉진시키고 세포의 이동, 식세포작용, 슈퍼옥사이드 생성, 항체 자극에 따른 백혈구의 세포 독작용 등도 증가시킨다.
7 세포와 복강대식세포로부터 NO와 TNF-a의 분비를 증가시켰다. 또한 항원 존재 세포에서 발현하는 B7 분자인 CD86의 발현이 음성대조군에 비해 증가하였고 LPS와 LBP복합체의 공통 수용체인 CD14의 발현이 현저히 증가하였다. In vivo 모델에서는, 유근피를 경구 투여한 마우스의 혈액에서 혈장을 분리하여 TNF-a, IFN-rz IL-2, IL-4 및 IL・5의 사이토카인을 측정한 결과 모두 증가하여 Thl과 Th2 반응에 관여함을 보여줬다.
의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변하, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD50)은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.
7 세포와 peritoneal macrophage에 유근피 추출물 WOug/mL LPS 10ug/ml을 24시간, 48시간 처리한 후 Griess 반음으로 NO 생성을 측정하였고 ELISA 방법으로 TNF-a를 측정하였다. 유근피 추출물이 NO 생성에 미치는 효과와 염증 매개 물질인 TNF-a 분비능력을 알아보기 위해 실험을 실시한 결과 Fig. 1과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 RAW 264.7 과 peritoneal macrophage 모두에서 공통적으로 NO 와 염증 매개물질 (inflammatory mediator)이 증가하였다.
실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변하, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD50)은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.
참고문헌 (18)
Han, S.B., Lee, C.W., Kang, M.R., Yoon, Y.D., Kang, J.S., Lee, K.H., Yoon, W.K., Lee, K.H., Park, S.K., Kim, H.M. Pectic polysaccharide isolated from Angelica gigas Nakai inhibits melanoma cell metastasis and growth by directly preventing cell adhesion and activating host immune functions. cancer letters, 1-10, 2006
Yang, H.Z., Xu, S., Liao, X.Y., Zhang, S.D., Liang, Z.L., Liu, B.H., Bai, J.Y., Jiang, C., Ding, J., Cheng, G.F., Liu, G. A Novel Immunostimulator, N2-[-O-Benzyl-N-(acetylmuramyl)- L-alanyl-D-isoglutaminyl]-N6-trans-(m-nitrocinnamoyl)-L-lysine, and Its Adjuvancy on the Hepatitis B Surface Antigen. J. Med. Chem. 48:5112-5122, 2005
Lin, Y.L., Liang, Y.C., Lee, S.S., Chiang, B.L. Polysaccharide purified from Ganoderma lucidum induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF- ${\kappa}$ B and p38 mitogen-activated protein kinase pathways. Journal of Leukocyte Biology. 78:533-543, 2005
Shao, B.M., Dai, H., Xu, W., Lin, Z.B., Gao, X.M. Immune receptors for polysaccharides from Ganoderma lucidum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323:133-141, 2004
Han, S.B., Park, S.K., Ahn, H.J., Yoon, Y.D., Kim, Y.H., Lee, J.J., Lee, K.H., Moon, J.S., Kim, H.C., Kim, H.C., Kim, H.M. Characterization of B cell membrane receptorsof polysaccharide isolated from the root of Acanthopanax koreanum. International Immunopharmacology. 3:683-691, 2003
Nakaya, T.A. Panax ginseng Induces Production of Proinflammatory Cytokines via Toll-like Receptor. Journal of Interferon & Cytokine Research. 24:93-100, 2004
Han, S.B., Yoon, Y.D., Ahn, H.J., Lee, H.S., Lee, C.W., Yoon, W.K., Park, S.K., Kim, H.M. Toll-like receptor-mediated activation of B cells and macrophages by polysaccharide isolated from cell culture of Acanthopanax senticosus. International Immunopharmacology. 3:1301-1312, 2003
Wang, M., Guilbert, L.J., Ling, L., Li, J., Wu, Y.Q., Xu, S., Pang, P., Shan, J.J. Immunomodulating activity of CVT-E002, a proprietary extract from North American ginseng (panax quinquefolium), Journal of Pharmacology. 53:1515-1523, 2001
Wang, M., Guillbert, L.J., Li, J., Wu, Y.Q., Pang, P., Basu, T.K., Shan, J.J. A proprietary extract from North American ginseng(panax quinquefolium) enhances IL-2 and IFN- productions in murine spleen cells induced by Con-A. International Immunopharmacology. 4:311-315, 2004
Roswitha F., Thomas, M., Brigitte, T., Paul, G.S. Stimulation of nitric oxide synthesis by the aqueous extract of Panax ginseng root in RAW 264.7 cells. British Journal of Pharmacology. 134:1663-1670, 2001
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