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문제 정의
- 그러므로, 본 연구에서는 dopamine 생합성 저해작용을 나타낸 ethaverine의 새로운 생리활성 작용을 검색하기 위하여, ethaverine0] serotonin 생합성 과정에 미치는 영향을 비교 검토하였다. Ethaverine0] P815 세포내의 serotonin 함량, 세포 내 TPH 및 AADC 활성 변화에 미치는 영향 등의 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 사용하였다. 23)효소반응액은 Tris-acetate 완충액(0.1 M, pH 7.6, 200 μdithiothreitol(10 mM, 80 B), catalase(2 mg/ml, 40 p/), Ltryptophan(2 mM, 50|iZ), 4H-PT(10 mM, 40 g/) 및 효소시료액이며, 37℃에서 효소반응 20분 후 perchloric acid(3.0M, 70 B) 및 5-HIAA(10 μM, 50 p/)를 가한 후 원심 분리한 다음, 상등액을 HPLC에 주입, 5-hydroxytryptophan 농도를 정 량하여 효소 활성을 측정하였다. HPLC 조건은 serotonin 함량 측정시와 동일하게 처리하였다.
- AADC 활성 측정은 enagisa 등의 방법을 사용하였다.2幻 효소 반응액은 sodium phosphate 완충액 (50mM, pH 8.2, 240 |J), pargyline(5 mM, 80 μ/), pyridoxal phosphate(0.1 mM, 40 μ/), L-5-tryptophan(10 mM, 40 ji/) 및 효소시료액이며, 37℃에서 효소 반응 120~240분 후 trichloroacetic acid(3.0 M, 80 μ/) 및 5-HIAA(10 皿, 50B)를 가한 후 원심분리한 다음, 상등액을 HPLC에 주입 serotonin 농도를 정량하여 효소활성을 측정하였다. HPLC 조건은 serotonin 함량 측정시와 동일하게 처리하였다.
- 1 μM) 보다약 2배의 높은 값을 나타내었다(Eble I). Ethaverinee P815 세포에 대한 독성은 lactate dehydrogenase 활성을 측정하여 검색하였다. Ethaverinee 2.
- Ethaverine에 의한 P815 세포내의 serotonin 함량 감소가 serotonin의 배지 (culture medium)로의 분비 (secretion)의 가능성을 알아보기 위하여 , ethaverinee 전처치 24시간 후에 세포 내 및 배지중의 serotonin 함량을 측정하였다. Ethaverine(10 gM) 의 전처치에 의하여 배지중의 serotonin 함량은 유의적인 변화가 없었다(Eble II).
- Ethaverine에 의한 P815 세포내의 serotonin 함량 감소작용에대한 부분적인 작용기전을 규명하기 위하여 P815 세포내의 TPH 및 AADC 활성 변화를 측정하였다(Bble HI). TPH 활성은 ethaverine 전처치 24시간 후에 측정하였으며, 대조군의 TPH 및 AADC 활성은 19.
- Ethaverine에 의한 P815 세포중의 serotonin 함량 감소 및 TPH 활성 저해작용에 대한 경시적인 변화를 검토하였다(Fig. 2). P815 세포중의 serotonin 함량은 ethaverine(7.
- Ethaverine을 사용하여 P815 세포내의 serotonin 함량에 미치는 영향에 대하여 검토하였다(Eble I). 대조군의 serotonin 함량은 1.
- Serotonin 함량은 HPLC■형광광도계법으로 측정하였다户)시료용액 (150 μ)에 trichloroacetic acid(l M, 150 jiZ), HIAA(10 pM, 50 此 내부표준)를 가한 다음 원심 분리하였다. 상등액을 Millex-GV(0.
- TPH 활성 측정은 Yanagisa 등의 방법을 개량하여 사용하였다. 23)효소반응액은 Tris-acetate 완충액(0.
- AADC 활성 변화를 측정하였다(Bble HI). TPH 활성은 ethaverine 전처치 24시간 후에 측정하였으며, 대조군의 TPH 및 AADC 활성은 19.6 nmol/min/mg protein 및 0.76 nmol/min/mg protein 이었다. TPH 활성은 ethaverine 7.
- 따라서 ethaverine에 의한 P815 세포중의 TPH 활성 저해작용은 세포 내 serotonin 함량 감소작용을 유도한 것으로 사료되어, 세포내의 TPH를 부분정제 (P815-TPH)하여 ethaverine이 P815-TPH 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 대조군의 P815-TPH 활성은 35.
대상 데이터
- Ethaverine hydrochloride, L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, serotonin, dithiothreitol, DL-6-methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrop-terin(4H-PT), 5-hydroxyindoleacetic acid(HIAA) 및 catalase는 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)로부터, 세포배양용 fetal calf serum 및 penicillin/streptomycin, DMEM 배지는 Gibco 사 (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그 밖의 시약은 특급 및 HPLC 용 등급을 사용하였다.
- P81S세포는 Cornell 대학교 의과대학(분자신경생물학 교실)에서 분양 받았다. 세포배양은 10% fetal calf serum, 100 unit/m/ penicillin과 100 μg/mZ streptomycin을 포함한 DMEM 배지를사용하여 , 세포배양용 dish에서 37℃, 5% CO2 상에서 배양하였다.
이론/모형
- AADC 활성 측정은 enagisa 등의 방법을 사용하였다.2幻 효소 반응액은 sodium phosphate 완충액 (50mM, pH 8.
- P815 TPH의 부분정제는 Naoi 등의 방법에 준하였다.约 세포를 포집한 후, 2mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 4 mM dithiothreitol, 10 pg antipeptidases(antipain, pepstatin A, chymostatin, leupeptine)^ 포함한 Tris-acetate 완충액 (pH 7.
- 법에 의하여 측정하였다.蜀 실험결과는 means土SE로 나타내고 유의성은 Students Mest에 의하여 검정하였다.
- 검정 각 항의 생리활성은 각각의 시료중의 단백질 함량을 측정하여 보정하였으며, 단백질 함량은 소혈청 albumin을 사용한 Lowry 법에 의하여 측정하였다.蜀 실험결과는 means土SE로 나타내고 유의성은 Students Mest에 의하여 검정하였다.
성능/효과
- 2). P815 세포중의 serotonin 함량은 ethaverine(7.5 凹曲)의 전처치에 의하여 12시간에서 감소하기 시작하여 12~36시간까지는 감소를 유지하였으며, 이후 serotonin 함량은 48시간에서 대조군 수준(대조군의 80~85%)으로 회복되었다. 또한 TPH 활성은 ethaverine 전처치(7.
- 7%로 나타나 유의성 있는 TPH 활성저해 작용을 나타내었다. 그러나, AADC의 활성은 ethaverine(7.5 gM) 의 전처치에 의하여 미약한 활성 저해작용(대조군의 92.1%)을 나타내었으며 유의성 있는 저해작용을 나타내지 않았다
- Ethaverine(10 gM) 의 전처치에 의하여 배지중의 serotonin 함량은 유의적인 변화가 없었다(Eble II). 따라서 ethaverinee] 의한 P815 세포중의총 serotonin 함량 감소작용은 세포 내 serotonin 함량감소가 주된 원인임을 알 수 있었다.
- 5 凹曲)의 전처치에 의하여 12시간에서 감소하기 시작하여 12~36시간까지는 감소를 유지하였으며, 이후 serotonin 함량은 48시간에서 대조군 수준(대조군의 80~85%)으로 회복되었다. 또한 TPH 활성은 ethaverine 전처치(7.5 μM)에 의하여 1少]간에서 저해되기 시작하여 12~36시간에서 최대의 저해작용을 나타내었으며, 48시간에서 TPH 활성은 대조군 수준으로 회복되었다.
- 본 연구에서는 ethaverinee P815 세포 내 serotonin 함량 감소작용을 나타내었으며, 배지 중으로의 serotonin 분비는 영향을주지 않았다. 이 경우에 P815 세포내의 TPH 활성을 경시적으로 저해하였으나, AADC 활성은 유의적으로 저해되지 않았다.
후속연구
- Ethaverinee L-type Ca++ 통로 차단하여 세포 내 Ca++ 함량의 감소를 유도하며, 源)이는 세포 내 TPH 활성 저해작용과 관련이 있을 것으로 사료된다.8, 9)이 결과로부터 ethaverine에 의한 P815 세포중의 TPH 활성 저해작용은 효소 P815-TPH에 직접적인 활성 저해작용이 아니라 간접적인 활성 저해작용에 의한 것임을 제시하고 있으며, 이에 대한 연구는 추가로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 ethaverine에 의한 P815 세포중의 serotonin 함량 감소작용은 TPH 활성 변화와 밀접하게 관련이 있을 것으로 사료된다. 따라서 ethaverinee monoamines(dopamine 및 serotonin) 함량 감소작용을 나타내고 있으며, 이와 관련하여 세포수준에서의 작용기전 연구 및 행동 약리학적, 뇌내 동태학적인 응용 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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