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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 국내에 자생하는 다릅나무 추 출물의 성분을 단리하여 NMR, mass 등의 기 기분석에 의해 화학구조를 구명하였다. 또한, 항산화 활성 시험을 통하여 기능성 소재로의 이용가능성에 대한 기초 자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- MABD27의 분획물(132.5 mg)을 benzene-MeOH (3 : 1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 60 column (3 x 45 cm)을 이용하여 10 g씩 380개의 분취물을 얻었으며 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후, UV 램프로 검색하여 4개의 분획물(MABD-2-7-1 ~ MABD- 2-7-4)로 나누었다. 이 중 MABD-7-2의 분획물(32.
- 각 분취물은 UV로 검 색하여 4개의 분획물(MABE-4-2BT ~ MABE-4-2BT)로 나누었다. MABE-4-2B-2의 분획물(782.0 mg)을 다시 acetone-EtOAcTLO (10 : 30 : 1, v/v/v)을 용출 용매로 한 silica gel 60 column (3.0 x 27 cm)을 이용하여 10 g씩 100개의 분취물을 얻었다. 각 분취물 은 UV로 검색하여 5개의 분획물(MABE-4-2B-2T ~ MABE-4-2B-5)로 나누었으며 , MABE-4-2B-2-3 분획물에서 화합물 Ⅳ (87.
- MABE-4의 분획물(&8 g)에 대해 CHCl2-MeOH (10 : 1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 60 column (5.5 x 30 cm)을 이용하여 100 ㎖씩 90개의 분취물 을 얻었으며, 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후, UV 램프로 검색하여 5개의 분획물(MABE-4-1 ~ MABE-4-5)로 나누었다.
- 0 mg)을 CHCk'MeOH (10 : 1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 60 column (3 x 47 cm)을 이용하여 20 g씩 270개의 분취물을 얻었 Free radical Scavenging activity (%)으며 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후. UV 램프로 검색하여 4개의 분획물(MABD-2-4T ~ MABD-2-4-4)로 나누었고, 이 중 MABD-2-4-3으로부터 화합물 I (16.9 mg)을 단리하였다.
- 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후. UV 램프로 검색하여 5개의 분획물(MABD-1 ~ MABD-5)로 나누었다. 이 중 MABD-2의 분획물(3.
- 0 x 37 cm)을 이용하여 100 ㎖씩 100개의 분취물을 얻었으며 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후. UV 램프로 검색하여 8개의 분획물(MABD-2T ~ MABE-2-8)로 나누었다. 이 중 MABD-2-4의 분획물(44.
- 0 x 27 cm)을 이용하여 10 g씩 100개의 분취물을 얻었다. 각 분취물 은 UV로 검색하여 5개의 분획물(MABE-4-2B-2T ~ MABE-4-2B-5)로 나누었으며 , MABE-4-2B-2-3 분획물에서 화합물 Ⅳ (87.5 mg)를 단리하였다..
- 5 x 25 cm)을 이용하여 20 g씩 90 개의 분취물을 얻었다. 각 분취물은 UV로 검 색하여 4개의 분획물(MABE-4-2BT ~ MABE-4-2BT)로 나누었다. MABE-4-2B-2의 분획물(782.
- 0 x 53 cm)을이용하여 20 g씩 540개의 분취물을 얻었다. 각 분취물은 UV로 검색하여 8개의 분획물(MABE-7-1 ~ MABE-7-8)로 나누었으며. MABE-7-7의 분획물 (350.
- 다릅나무 수피는 실험실에서 음건시킨 후, 분쇄기를 사용하여 분말화하였다. 분말시료는 95% 에탄올 (ethanol.
- 다릅나무 수피의 EtOAc 가용부(19.5 g)에 대해 benzene-MeOH (5 : 1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 60 column (7 x 50 cm)을 이용하여 250 씩 110개의 분취물을 얻었으며, 이들 분취물들은 TLC 에 전개시킨 후, UV 램프로 검색하여 8개의 분획물 (MABE-1 ~ MABE-8)로 나누었다. 이 중 MABE-7 의 분획물(1.
- 다릅나무 수피의 EtOH 조추출물로부터 Sephadex LH-20 및 silica gel 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 4종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 단리 화합물은 NMR, MS 등의 기기분석 결과, 7-0-^-D-glu-copyranosyle'-methoxyisoflavone, 7-0-D-gluco-pyranosyld"(1"-6")-δ-glucopyranosyl-4'Fe-thoxyisoflavone, 7-0-/5-D-glucopyranosyl(lw, -^6w)-BTAglucopyranosyl (1"-6") - 8-D-glucopyransoyl-4/-methoxyisoflavone, 7-0- ^-D-glucopyranosyl-4', 6- dimethoxyisoflavone으로 각각 동정하였다.
- 화합물 I 의 A환, B환, C환의 구조가 동일하기 때문에 그에 상응하는 signale 앞의 화합물 I 과 같은 방법으로 귀속하였다. 당의 부분 구조에서 TOCSY spectrum을 통해 이들의 연결 상태를 확인하였다. 두 번째 당의 anomeric proton인 S 4.
- 하지만, 국내의 다릅나무 추출 성분에 대한 단리 및 구조 동정과 그에 따른 생리활 성에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서, 본 연구는 국내에 자생하는 다릅나무 추 출물의 성분을 단리하여 NMR, mass 등의 기 기분석에 의해 화학구조를 구명하였다. 또한, 항산화 활성 시험을 통하여 기능성 소재로의 이용가능성에 대한 기초 자료를 얻고자 하였다.
- 이것은 Tostes 등(1999)과 Krishnaveni와 Rao (2000)가 보고한 isoflavone 화합물과도 일치하였다. 또한, H-2'가 <5 8.45 (1H, s, H-2) signal과 NOESY spectrum에서 상관 peak를 나타내었으므로 B환의 pMton의 결합 위치를 알 수 있었으며 5 7.15 (1H, ddt J = 2.5, 8.5 Hz, H-6), 6 7.25 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), S 8.06 (1H, d, J = 8.5 Hz H-5)의 aromatic proton signal의 결합정수로 A 환의 proton의 결합 위치를 확인하였다. 우선 결합 정수 J = 2.
- 사용하여 분말화하였다. 분말시료는 95% 에탄올 (ethanol. EtOH)에 72시간 동안 실온에서 침지 시켜 조 추출물을 얻었으며 충분한 양을 얻기 위하여 이조 작을 3회 반복 실시하였다. 여기서 얻어진 조 추출물은 석유에테르(light petroleum ether, LPE), 디클로로메탄(di chloromethane, CH2CI2) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc) 등의 용매를 순차적으로 연속 추출하여 분획하였다.
- EtOH)에 72시간 동안 실온에서 침지 시켜 조 추출물을 얻었으며 충분한 양을 얻기 위하여 이조 작을 3회 반복 실시하였다. 여기서 얻어진 조 추출물은 석유에테르(light petroleum ether, LPE), 디클로로메탄(di chloromethane, CH2CI2) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc) 등의 용매를 순차적으로 연속 추출하여 분획하였다.
- 이 조작을 2회 반복하여 실시하였으며 FRS aciv-ity가 50%가 될 때의 농도인 ICso ppm을 구하였다.
- 조추출물과 단리화합물을 25, 50, 75, 100 ppm의 농도로 만들어 4 ㎖씩 시험관에 넣고 1.5 X 10T M 의 DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 1 ㎖를가하여 vortex mixer로 잘 섞어서 30분간 상온에서 반응시킨 다음, 반응액을 분광광도계 (8452A Diode Array Spectrometer, Hewlett Packard CO.)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며 , 대조 구로는 천연항산화제인 a-tocopherol과 합성항산화제인 BHT (Butylated hydroxy toluene)를 사용하였다. Free radical scavenging (FRS) activity는 실험 구와 대조구의 흡광도를 사용하여 다음과 같이 백분율로 나타내었다.
- 항산화 활성은 다릅나무 수피 , 목부의 각 분획물과 단리 물질을 대조구인 천연 항산화제인 tf-tocopherol 과 합성 항산화제인 BHT를 사용하여 free radical scavenging (FRS) activity (%)와 IC50 (ppm)을 구하여 그- 결과를 정리하였다.
대상 데이터
- 다릅나무 수피의 CHzCh 가용부(60.9 g) 에 대해 EtOH을 용줄용매로 한 Sephadex LH-20 column (8.0 x 43 cm)을 이용하여 250 ㎖씩 30개의 분취물을 얻었으며. 이들 분취물들은 TLC에 전개시킨 후.
- 다릅나무 수피의 조추출물과 분획물은 MeOH을기본 용매로 사용하였으며, EtOH 조추출물(MAB EtOH), 석유에테르(MABL), 디클로로메탄(MABD), 에틸아세테이트(MABE), 잔여물(MABR)에 대한 FRS activity의 결과는 Fig. 2와 같다.
- 본 실험에 사용된 공시수종은 2004년 6월 경남 하동군 화계면 정금리 산 10번지에 있는 50년생 (흉고직경 30 cm) 다릅나무 수피를 사용하였다.
- 5 g)에 대해 benzene-MeOH (5 : 1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 60 column (7 x 50 cm)을 이용하여 250 씩 110개의 분취물을 얻었으며, 이들 분취물들은 TLC 에 전개시킨 후, UV 램프로 검색하여 8개의 분획물 (MABE-1 ~ MABE-8)로 나누었다. 이 중 MABE-7 의 분획물(1.8 g)을 CHaCb-MeOH (5 : 1, v/'v)을 용출 용매로 한 silica gel 60 column (5.0 x 53 cm)을이용하여 20 g씩 540개의 분취물을 얻었다. 각 분취물은 UV로 검색하여 8개의 분획물(MABE-7-1 ~ MABE-7-8)로 나누었으며.
이론/모형
- 단리한 화합물의 질량(MS) 스펙트럼은 JEOL JMS-600W, 그리고 1H-, 13C-NMR, Correlation Spectroscopy ( H-1H COSY), Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY), Detected Multiple Quantum Coherence (HMQC), 1H Detected Multiple Bond Connectivity (HMBC) 등의 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance, NMR) 스펙트럼은 한국기초과학지원연구원 서울분 소의 Varian UI 500을 사용하였다.
성능/효과
- EI-MS spectrum에서 분자 ion peak느: m/z 592 [M"로서 이 화합물의 분자량과 일치하였으며 이상의 분석 결과, 화합물 U는 7-0- /5-D-glucopyranosyl (r/ze-6, , )-^-D-glucopyranosyl-4/-methoxyisofla-vone임을 확인하였다.
- 을 나타내었다. MeOH을 기본용매로 사용했을 때는 두 대조구 모두 높은 활성을 나타내었지만, 단리화합물은 DMSO에만 용해되어 대조구와 비교하기 위해 기본 용매로 DMSO를 사용한 결고" MeOH을 사용했을 때와 마찬가지로 농도가 증가할수록 활성이 증가하는 경향을 나타내었지만, 용매에 따른 흡광도가 다르기 때문에 a-tocopherol의 경우 100 ppm에서 20%, BHT의 경우 56%나 활성이 낮게 나왔다.
- 다릅나무 수피의 EtOH 조추출물로부터 Sephadex LH-20 및 silica gel 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 4종의 페놀성 화합물을 분리하였다. 단리 화합물은 NMR, MS 등의 기기분석 결과, 7-0-^-D-glu-copyranosyle'-methoxyisoflavone, 7-0-D-gluco-pyranosyld"(1"-6")-δ-glucopyranosyl-4'Fe-thoxyisoflavone, 7-0-/5-D-glucopyranosyl(lw, -^6w)-BTAglucopyranosyl (1"-6") - 8-D-glucopyransoyl-4/-methoxyisoflavone, 7-0- ^-D-glucopyranosyl-4', 6- dimethoxyisoflavone으로 각각 동정하였다. 이들 단리 물질의 항산화 활성은 라디컬 소거 능으로 측정하였으며 , 항산화 활성은 α-(DPPHT)보다 낮게 나타났지만 BHT와 비슷한 활성을 나타내었다.
- 당의 부분 구조에서 TOCSY spectrum을 통해 이들의 연결 상태를 확인하였다. 두 번째 당의 anomeric proton인 S 4.21 (1H, d, J = 7.5 Hz, HT") signal의 HMBC spectrum을 분석한 결과 이 anomeric proton0] S 68.45 (t, C-6")에서 나타난 signal과 교차 peak를 보였다. 이로써 두 번째 당이 첫 번째 당의 C-6"번 위치에 결합하고 있음을 알 수 있었으며 이것은 Rukachaisirikul 등 (2002)이 단리한 isoflavone 화합물과 유사한 형태를 나타내었다.
- DEPT (45°, 90°, 135°)법에 의한 화합물 Ⅱ의 13C-NMR spectrum에서는 primary carbon0] 18개 , secondary carbon0] 2개 , tertiary carbon0] 1개 , quaternary carbon 7개로, 총 28개의 signal이 나타났다. 화합물 I 의 A환, B환, C환의 구조가 동일하기 때문에 그에 상응하는 signale 앞의 화합물 I 과 같은 방법으로 귀속하였다.
- 교차 peak를 보인 이 carbon signale A환으] H-5, H-6, H-8과도 모두 교차 peak를 나타내었음으로 당이 C-7 위치에 결합하고 있음을 알 수 있었다. EI-MS spectipm에서 분자 ion peak는 m/z 430 ([M]*) 으로 이 화합물의 분자량과 일치하였으며 이상의 분석 결과 화합물 I 은 7-O-^-Deglucopyrano-syle'-methoxyisoflavoneS. 구조를 구명하였다.
- 5 Hz의 signale ortho 결합을 하고 있는 H-5에 귀속하였다. H-5와 H-6은 COSY spectrum에서 상관 peak가 확인되었으며, H-5는 C~4 carbonyl gToup과 HMBC에서 교차 peak가 확인되어 그 위치를 확인하였다. 당의 결합위치를 확인하기 위하여 anomeric proton인 S 5.
- a-tocopherol보다 낮게 나타났지만 합성 항산화제인 BHT와비슷한활성을나타났다. IC50의 값에서 보면 MAB-1이 116.7 ppm, MABTI가 126.6 ppm을 나타내 결합수가 증가할수록 활성이 약간 감소하는 것을 알 수 있었다. 나머지 MABTII과 MAB-Ⅳ는 각각 114.
- 午卜NMR spectrum에서 $ 8.41 (1H, & H-2)의 singlet signale isoflavonoid 화합물의 특징적인 signal로 이를 확인하여 화합물 Ⅳ가 isoflavonoid 의구조임을 확인하였다. Aromatic proton이면서 sin-인아; signal인 S 7.
- 다릅나무 수피 단리화합물의 항산화 활성은 천연항산화제인 a-tocopherol보다 낮게 나타났지만 합성 항산화제인 BHT와비슷한활성을나타났다. IC50의 값에서 보면 MAB-1이 116.
- proton signal을 확인하였다. 이 중 S 7.00 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3\ 5) S 7.54 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2', 6‘)의 signal을 B혼의 proton으로 귀속하고, 이들 proton과 NOESY spectTum에서 상관 peak 가 나타난 & 3.79 (3H, s, OMe-4')의 signal을 통해 methoxyl group이 C-4 위치에 결합하고 있음을 확인하였다. 특히.
- 추출물 및 분획물 모두 농도가 증가할수록 FRS activity는 증가하였으나, 대조구보다는 활성이 낮은 것으로 나타났다. MABE와 MABR의 항산화 활성은 거의 없는 것으로 나타났다.
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