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문제 정의
- 이상의 보고들을 근거로 하여 본 연구에서는 기도 내에서 콜히친에 의한 항염증작용이 IL-1Ra에 의해 매개될 수 있다는 가설을 세우고 이를 실험적으로 증명하고자 하였다.
제안 방법
- BALB/c 쥐에게 콜히친을 복강 내 주사(체중 1 kg당 1 mg, 3 mg)한 후, 48시간 후에 ketamine을 복강내 주사하여 마취한 후 기관지 폐포 세척술을 시행하였다. 먼저 BALB/c 쥐의 목부분에 피부 절개를 하여 기관을 노출시키고 polyethylene tube를 삽입한 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 1 ml씩 2차례 기관지 폐포 세척술을 시행하였다.
- ELISA kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 방법을 따라 IL-1Ra를 정량적으로 측정하였다.
- RT-PCR반응산물은 1% agarose gels에서 전기영동한 후, ethidium bromide stained band들을 자외선 하에서 관찰하고 사진 촬영하였다.
- 각 단계에서 상층액을 채취한 후 protease inhibitor mixture(complete protease inhi-bitor mixture tablets; Boehringer Mannheim, Mann-heim, Germany)를 처리하였으며, 이후 cell culture lysis reagent(Promega)를 투여해서 세포 용해물을 만들었다. 각 검체의 총 단백량은 bicinchoninic acid protein reagent(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용해 분석하였다.
- Western blot은 Levine 등이 제시한 방법11을 변형하여 시행하였다. 각 단계에서 상층액을 채취한 후 protease inhibitor mixture(complete protease inhi-bitor mixture tablets; Boehringer Mannheim, Mann-heim, Germany)를 처리하였으며, 이후 cell culture lysis reagent(Promega)를 투여해서 세포 용해물을 만들었다. 각 검체의 총 단백량은 bicinchoninic acid protein reagent(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용해 분석하였다.
- 각 실험 단계에서 10 μg의 동일 용량의 총RNA를 1% agarose, 17% form- aldehyde gels로 전기영동하였으며, nylon membrane으로 옮겨져 32P-labeled cDNA probes로 hybridization하였다.
- 세척액은 원심분리(4℃, 1000 rpm)하여, 상층액과 침전물을 분리한 후 -80℃에 냉동 보관하였다. 기관지 폐포 세척술을 시행한 후 폐를 절제하였으며 폐조직을 분쇄한 후 trizol (Invitrogen)을 사용해 제조사의 방법에 따라 세포용해물을 얻었다.
- BALB/c 쥐에게 콜히친을 복강 내 주사(체중 1 kg당 1 mg, 3 mg)한 후, 48시간 후에 ketamine을 복강내 주사하여 마취한 후 기관지 폐포 세척술을 시행하였다. 먼저 BALB/c 쥐의 목부분에 피부 절개를 하여 기관을 노출시키고 polyethylene tube를 삽입한 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 1 ml씩 2차례 기관지 폐포 세척술을 시행하였다. 세척액은 원심분리(4℃, 1000 rpm)하여, 상층액과 침전물을 분리한 후 -80℃에 냉동 보관하였다.
- 이를 통해 IL-1Ra와 β-actin에 대한 mRNA transcript를 반정량적으로 분석하였다.
- 정상 인체 기관지 상피세포와 RAW 264.7 세포 각각에 콜히친을 투여한 군과 투여하지 않은 군으로 나누어 실험을 시행하였다. 각 세포의 배양액에 다양한 농도(0.
- 콜히친에 의한 IL-1Ra의 생성기전에 MAPK경로가 관여하는 지를 확인 하기 위해 정상 인체 기관지 상피세포와 RAW 264.7 세포에 대표적인 MAPK 특이 억제제인 PD98059(Calbiochem, San Diego, CA, USA)와 콜히친을 투여한 후 IL-1Ra의 생성 변화를 확인하였다.
- 콜히친을 투여한 정상 인체 기관지 상피세포에 대표적인 MAPK경로 억제제인 PD98059를 투여한 후 IL-1Ra생성을 관찰하였다. 콜히친 투여로 증가되었던 IL-1Ra의 생성은 PD98059에 의해 감소되었으며, 이는 PD98059의 농도가 증가할수록 더욱 감소하였다(Figure 6).
대상 데이터
- 각 IL-1Ra아형과 hybridization하는 1.7-Kb IL-Ra cDNA insert를 포함한 clone HT AAA12은 American Type Culture Collection에서 구입하였으며, 겔 loading의 정확성은 ethidium bromide 염색과 cDNA encoding β-actin으로 측정하였다.
- 생체 내에서 IL-1Ra의 생성자극을 확인하기 위해 8-10주 된 BALB/c 쥐를 사용하였다.
- 이 실험에서는 2개의 양성반응 기준물질이 사용되었는데 그 중 하나는 recombinant human nonglycosylated mature sIL-1Ra(R&D system)이며 다른 하나는 recom-binant human IL-4에 48시간 동안 보관된 PMA- differentiated U937 monocyte-like세포의 용해물로, 이는 쉽게 검출할 수 있는 glycosylated mature sIL-1Ra, icIL-1Ra I을 포함 하고 있다12.
- 정상 인체 기관지 상피세포(normal human bronchial epithelial cells, NHBE)와 쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) 에서 구입하였으며, 각 세포는 제조사의 방법에 따라 배양하였다. 각 세포는 20세대까지 사용하고 이후 세대는 폐기하였다.
데이터처리
- 모든 측정치는 평균과 표준오차로 표시하였고 각 실험군과 대조군의 측정치를 비교분석하기 위해 Student’s t-test를 사용하였으며 그 통계학적 유의 수준은 5% 미만으로 하였다.
이론/모형
- 역전사와 PCR은 Access RT-PCR kit(Promega)를 사용하여 제조업체의 방법을 따라 시행되었다. RT-PCR primer와 방법은 Muzio 등13이 기술한 바에 따랐으며, 모든 primer는 Yale oligonucleotide syn-thesis laboratory에서 합성하였다. 이를 통해 IL-1Ra와 β-actin에 대한 mRNA transcript를 반정량적으로 분석하였다.
- 역전사와 PCR은 Access RT-PCR kit(Promega)를 사용하여 제조업체의 방법을 따라 시행되었다. RT-PCR primer와 방법은 Muzio 등13이 기술한 바에 따랐으며, 모든 primer는 Yale oligonucleotide syn-thesis laboratory에서 합성하였다.
- 총 RNA는 Chomczynski 와 Sacchi10에 의한 acid-guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction방법에 따라, 각각의 지정된 시간에 세포배양 단일세포층으로부터 추출하였다. 각 실험 단계에서 10 μg의 동일 용량의 총RNA를 1% agarose, 17% form- aldehyde gels로 전기영동하였으며, nylon membrane으로 옮겨져 32P-labeled cDNA probes로 hybridization하였다.
성능/효과
- BALB/c 쥐에게 콜히친을 복강 내 주사한 후 기도 내 IL-1Ra의 생성을 폐조직과 기관지 폐포 세척액에서 관찰하였을 때 폐 분쇄물과 기관지 폐포 세척액의 상청액, 세포 용해물에서 대조군에 비해 IL-1Ra의 생성이 증가되었다(Figure 5).
- RAW 264.7세포에서 콜히친을 투여한 후 IL-1Ra의 mRNA 발현을 보았을 때 icIL-1Ra I mRNA보다 sIL-1Ra mRNA의 발현이 우세하게 관찰되었으며 이러한 mRNA의 발현은 PD98059 의 농도가 증가할수록 감소하였다(Figure 7).
- 본 연구는 염증반응의 주요 매개체인 IL-1의 길항제가 기도 내에서 콜히친에 의해 생성이 증가된다는 것을 확인하였고 이는 세포 실험뿐 아니라, 쥐의 생체 내 실험을 통해서도 확인할 수 있었다. 이러한 사실을 통해 콜히친이 IL-1Ra를 통해 기도 내 염증을 감소시킬 수 있을 것이라는 결과를 얻을 수 있었다.
- 본 연구에서 콜히친에 의한 IL-1Ra의 생성이 정상 인체 기관지 상피세포와 RAW 264.7 세포에서 모두 증가되었지만, 발현된 IL-1Ra의 아형을 보면 인체 기관지 상피세포의 경우 icIL-1Ra I이 우세하게 관찰된 반면, RAW 264.7 세포에서는 sIL-1Ra의 발현이 우세하였다. 아마도 이 차이는 각 세포간의 특성 차이 또는 인간과 쥐, 두종간에 서로 다른 조절 기전에 의한 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 콜히친에 의한 IL-1Ra의 발현 증가의 기전을 밝히기 위해 대표적인 MAPK경로의 특이 억제제인 PD98059를 사용하였으며, 그 결과로 IL-1Ra의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 이는 적어도 콜히친에 의한 IL-1Ra생성에 MAPK경로가 관여한다는 것을 의미한다.
- 세포배양시 배양액안의 성장인자 등이 세포에 영향을 주어, 많은 수의 사이토카인들이 특별한 자극없이 증가되는 것을 흔히 관찰할 수 있다. 본 연구의 결과에서 4시간 이후에는 실험군과 대조군간에 차이가 보이며, 16시간 이후에는 두 군간에 통계적으로 유의한 차이를 관찰할 수 있어 콜히친 투여가 시간에 따라 IL-1Ra의 생성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
- 본 연구의 결과에서 콜히친 투여 후 시간이 지남에 따라 IL-1Ra의 생성이 증가하지만 대조군에서도 증가하는 소견을 보인다(Figure 2). 세포배양시 배양액안의 성장인자 등이 세포에 영향을 주어, 많은 수의 사이토카인들이 특별한 자극없이 증가되는 것을 흔히 관찰할 수 있다.
- 본 연구의 결과에서 콜히친의 농도가 증가할수록 IL-1Ra의 생성이 증가하지만 0.5 μM이상의 고농도 콜히친에서는 IL-1Ra의 생성이 감소하는 경향을 보였다.
- 본 연구는 염증반응의 주요 매개체인 IL-1의 길항제가 기도 내에서 콜히친에 의해 생성이 증가된다는 것을 확인하였고 이는 세포 실험뿐 아니라, 쥐의 생체 내 실험을 통해서도 확인할 수 있었다. 이러한 사실을 통해 콜히친이 IL-1Ra를 통해 기도 내 염증을 감소시킬 수 있을 것이라는 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 콜히친에 의한 IL-1Ra의 생성자극은 다른 콜히친 유사약제에서는 관찰할 수 없었다.
- 천식지속 상태(status asthmaticus) 환자에서는 기관지 폐포 세척액 내에 IL-1과 IL-1Ra 모두가 증가되어 있으나, IL-1Ra의 양이 IL-1을 억제할 만큼 충분하지 못했다는 보고도 있다30. 이상의 소견들을 종합하여 볼 때 IL-1과 IL-1Ra의 균형은 염증성, 면역성 폐질환의 경과와 결과에 있어 중요한 역할을 한다.
- 이상의 소견을 종합하였을 때 기도에서 콜히친은 IL-1Ra의 생성을 유도하고 IL-1Ra를 통한 항염증 작용을 할 것으로 보인다. 본 연구에서는 콜히친의 투여가 기도 폐포세척액의 염증세포의 변화나, 기도 조직에서의 염증정도의 변화를 유도하는 지를 직접적으로 보여준 실험결과를 보여주지 못하였으므로, 이러한 항염증 작용이 얼마나 효과적인가에 대해서는 추후의 실험 등을 통해 검증하는 것이 필요할 것으로 보인다.
- 정상 인체 기관지 상피세포에 콜히친을 투여 후 생성되는 IL-1Ra의 아형은 icIL-1Ra I mRNA가 우세하게 관찰되었다. 그러나 콜히친 농도에 따른 mRNA발현의 차이는 없었다(Figure 3).
- 그러나 고농도의 콜히친에서는 IL-1Ra의 생성이 일부 감소되는 경향을 보였다(Figure 1). 콜히친을 투여한 후 시간에 따라 IL-1Ra의 생성은 증가되었으며, 16시간 이후에는 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(Figure 2).
후속연구
- 본 연구에서는 콜히친의 투여가 기도 폐포세척액의 염증세포의 변화나, 기도 조직에서의 염증정도의 변화를 유도하는 지를 직접적으로 보여준 실험결과를 보여주지 못하였으므로, 이러한 항염증 작용이 얼마나 효과적인가에 대해서는 추후의 실험 등을 통해 검증하는 것이 필요할 것으로 보인다. 또한, 적어도 콜히친에 의한 IL-1Ra의 생성에는 MAPK경로가 관여할 것으로 사료되며 구체적으로 어떠한 단계가 이러한 결과를 보였는지는 추가적인 실험이 필요할 것이다.
- 이상의 소견을 종합하였을 때 기도에서 콜히친은 IL-1Ra의 생성을 유도하고 IL-1Ra를 통한 항염증 작용을 할 것으로 보인다. 본 연구에서는 콜히친의 투여가 기도 폐포세척액의 염증세포의 변화나, 기도 조직에서의 염증정도의 변화를 유도하는 지를 직접적으로 보여준 실험결과를 보여주지 못하였으므로, 이러한 항염증 작용이 얼마나 효과적인가에 대해서는 추후의 실험 등을 통해 검증하는 것이 필요할 것으로 보인다. 또한, 적어도 콜히친에 의한 IL-1Ra의 생성에는 MAPK경로가 관여할 것으로 사료되며 구체적으로 어떠한 단계가 이러한 결과를 보였는지는 추가적인 실험이 필요할 것이다.
- 콜히친이 천식에 치료에 있어 도움을 줄 수 있다는 연구결과들은 아직 부족한 상태이지만, 향후 이 연구가 콜히친의 천식에 치료 효용성에 대한 잘 계획되고, 많은 환자들을 대상으로 한 연구의 실험적 근거가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이는 적어도 콜히친에 의한 IL-1Ra생성에 MAPK경로가 관여한다는 것을 의미한다. 하지만 이 결과 만으로는 복잡하고 다양한 구조의 MAPK경로 중 어떠한 단계가 관여하는지는 알 수 없으며 이후 추가적인 실험이 필요할 것으로 사료된다.
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