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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 열 전도성이 우수한 실리콘 및 유리 재질로 제작된 microchip을 기반으로 하는 real-time PCR 기기를 사용하여, AIDS의 진단에서 그 병인체인 HIV를 10분대에 진단, 판정할 수 있는 새로운 초고속 PCR판정법을 개발하고자 하였으며, 또한 이 초고속 진단법이 기존의 real-time PCR법에 비하여 어떤 차이가 있는가를 검토하고자 하였다.
가설 설정
- DNA synthesis of HIV-1 and HIV-2 specific, 495bp(HlV-l) and 294 bp(HIV-2)-long partial env gene(HIV-l : gi_1332355 / HIV-2 : gi_l184090). A. Target DNA was synthesized through 5-step long-nuclotide extension. Each lane shows the result of each extension step, except lane M (DNA size marker).
- 281bp-long, 366bp-long and 495bp-long HIV-1 specific partial env gene, respectiv이y. B. Target DNA was synthesized through 4-step long-nuclotide extension. Each lane shows the result of each extension step.
제안 방법
- 범위는 54。(2-66。(2이며, 각 2℃ 간격으로 동일조건의 PCR을 수행하여최대산물을 생산하는 annealing온도를 결정하였다. PCR 결과 HIV-1 (117 bp), HIV-2 (119 bp)의 증폭산물을 확인할 수 있었고(Fig.
- Exicycler™ Quantitative Thermal Block을 이용한 real-time PCR의 조성은 10 attogram (2.3 copies)에서 1 nanogram (2.3x 108 copies)까지의 pBX-HIVl를 기질로 사용하고, 10 pmole HIVl-dF, 10 pmole HIVl-dR, 2x greenstar master mix가 포함된 최종 20 μ1의 반응액을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 印V-2의 경우 동일한 농도의 pBX-HIV2와 동일한 농도의 HTV2- dF, HIV2-dR primer를 사용하였다.
- HIV-1 및 HIV-2의 PCR 진단을 위하여 HIV-1 및 HIV-2의 검색용 primer를 각기 제작하였다(Table 1). 이들 HIV 검색용 primer는 primer3 v0.
- HIV-1의 annealing 최적온도를 측정하기 위한 PCR의 조성은 1 ng pBX-HIVl, HIVl-dF/HIVl-dR primer 각각 10 pmole, 1 pl dNTP (each more 2.5mM), lOx PCR buffer (15 mM MgCl2), 2.5 U Taq polymerase (GeneClone, Korea)을 사용하였 匸k H1V・2는 1 ng pBX-HIV2, HIV2-dF/HIV2-dR primer 각 10 pmole을 사용하였으며 그 외의 조성은 HIV1의 경우와 동일하게 하였다. Peltier방식의 Thermal Cy이er인 PTC-200 (MJ research, USA)을 사용하였고, 94℃ 5분간 pre-denaturation을 수행한 후, denaturation 94℃, 30초, annealing 54-66℃, 30초, polymerization 72℃, 30초 과정을 30회 반복하였다.
- 기질 DNA인 pBX-HIVl의 농도와 copy 수의 상관관계는 기존 연구(9)에서 제시한 관계식에 의해 계산하였으며 본 연구의 모든 copy 수 측정에 적용하였다. HIV-1의 경우, 10 attogram (2.3 copies)에서 10 femtogram (2.3xl03 copies) 까지의 pBX-HIVl을 기질로 사용한 최종 1μ1의 반응액으로 Ultra-rapid real-time PCR을 수행하였으며, HIV-2의 경우에도 동일한 양의 pBX-HIV2를 사용하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, 94℃ 1초, 60℃ (HIV-1) 또는 56℃ (HIV-2) 1초, 72℃ 3초 과정을 40회 반복하였다.
- PCR 최적조건을 측정하기 위하여 온도 구배 PCR을 수행하였다. HIV-1의 annealing 최적온도를 측정하기 위한 PCR의 조성은 1 ng pBX-HIVl, HIVl-dF/HIVl-dR primer 각각 10 pmole, 1 pl dNTP (each more 2.
- 이후 finalpolymerization 72℃, 10분하여 PCR을 완료하였다. PCR산물들은 agarose 전기영동 후 Densitormeter (Gene Tools v3.06, Synoptics, England)로 측정하여 최적의 온도조건을 확립하였다.
- PCR의 조성은 최종 반응액 1 μ1안에 template DNA인 1 fg pBX-HTVl (2.3xl02 copy), 10 pmole HTVl-dF, 10 pmole HTV1- dR, 2x greenstar master mix로 조성하였으며 HTV-2에 대하여는 1 fg pBX-HIV2, 10 pmole HIV2-dF, 10 pmole HIV2-dR, 2x greensta master mix로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃, 30초를 수행하고, denaturation (94℃), annealing (HIV-1, 60℃/ HIV-2, 56℃), extention (72℃) 과정을 40회 반복하였다.
- 5 U Taq polymerase (GeneClone, Korea)을 사용하였 匸k H1V・2는 1 ng pBX-HIV2, HIV2-dF/HIV2-dR primer 각 10 pmole을 사용하였으며 그 외의 조성은 HIV1의 경우와 동일하게 하였다. Peltier방식의 Thermal Cy이er인 PTC-200 (MJ research, USA)을 사용하였고, 94℃ 5분간 pre-denaturation을 수행한 후, denaturation 94℃, 30초, annealing 54-66℃, 30초, polymerization 72℃, 30초 과정을 30회 반복하였다. 이후 finalpolymerization 72℃, 10분하여 PCR을 완료하였다.
- Ultra-rapid real-time PCR for the amplification of HIV specific env gene. Ultra-rapid real-time PCR was performed with minimum time of each 3 steps (denaturation, annealing and polymerization) and 40 cycles. Each time of 3 steps was 1, 1 and 3 seconds, respectively.
- Ultra-rapid real-time PCR의 단계별 최소시간(1초-1초-3초)이 확인되었기에, 이를 기준으로 하여, 기질의 양 또는 기질 유전자의 copy수에 따른 초고속 실시간 PCR을 수행하여 이 조건에서 template의 검출 한계(민감도)를 측정하였다. 기질의 양은 pBX- HIV1 와 pBX-HIV2 를 각 10 ag, 100 ag, 1 fg, 10 电씩 사용하여 초고속 실시간 PCR을 수행하였으며, 이를 각 해당 유전자의 copy개수로 계산하면, 각 2.
- Ultra-r叩id real time PCR의 조건하에서 검색할 수 있는 최저 copy 수를 측정하였다. 기질 DNA인 pBX-HIVl의 농도와 copy 수의 상관관계는 기존 연구(9)에서 제시한 관계식에 의해 계산하였으며 본 연구의 모든 copy 수 측정에 적용하였다.
- pBX-HIVl, pBX-H!V2를 본 PCR실험의 기질로 사용하여 온도 구배 PCR을 실행하였다. 측정된 annealing 온도의 범위는 54。(2-66。(2이며, 각 2℃ 간격으로 동일조건의 PCR을 수행하여최대산물을 생산하는 annealing온도를 결정하였다.
- 반응조건은 pre-denaturation 94℃, 30초를 수행하고, denaturation (94℃), annealing (HIV-1, 60℃/ HIV-2, 56℃), extention (72℃) 과정을 40회 반복하였다. cycle내에서의 각 단계(step)별 시간을 15초-15초-15초, 1(応-10초 -10초, 5초-5초-5초, 3초-3초-3초, 1초-1초-3초로 설정하여 각각 측정하였으며 melting point analysis는 75-9(TC구간을 즉정하여 Tm값을 결정하였다.
- pBX・HIVl와 pBX-HIV2 각 1 fg (2.3xl02 copies)을 초기 기질로 사용하여 초고속 실시간 PCR의 가능성을 시험하였다. 사용된 기기는 Genespectoie TMC-1000 (Samsung, Korea)이며, 이기기에서 설정할 수 있는 각 단계별 최소 시간인 denaturation (94℃), 1초, annealing (60℃ 또는 56℃), 1초, extention (72℃), 3초의 수준까지, 즉, 각 단계(step)를 15초초・15초에서 부터 점차로 시간의 설정을 줄여 최종 1초-1초-3초까지 PCR을 수행하여 해당 유전자의 증폭여부를 측정하였다.
- 0 (17)을 통하여 HTV 이외의 종에서는 반응하지 않을 것임을 확인하였다. 각 oligonucleotide의 제작은 바이오닉스(Bionics, Korea) 사에 의뢰하였다.
- 검출 한계(민감도)를 측정하였다. 기질의 양은 pBX- HIV1 와 pBX-HIV2 를 각 10 ag, 100 ag, 1 fg, 10 电씩 사용하여 초고속 실시간 PCR을 수행하였으며, 이를 각 해당 유전자의 copy개수로 계산하면, 각 2.3개, 23개, 230개 그리고 2.3X1W 개가 된다. 민감도 측정에 사용된 real-time PCR 기기도 초고속이 가능한 GenspectorR TMC-1000 (Samsung, Korea)을 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 미국 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에 보고되어 있는 45종의 HIV-1 과 33종의 HIV-2의 염기서열 정보를 확보하고 이를 염기서열 비교분석 프로그램인 CLUSTAL X vl.83을 사용하여 비교분석을 수행하였다. 이 결과로써 각 바이러스군의 유전자 중 가장 상동성의 정도가 높은 염기서열 부분을 추출하게 되었으며, 이는 각기 HTV-l-env495 (495 bp), HIV-2-env294 (294 bp)라 명명하였고, 이를 각기 인공 유전자 합성법을 사용하여 제작하였다.
- 印V-2의 경우 동일한 농도의 pBX-HIV2와 동일한 농도의 HTV2- dF, HIV2-dR primer를 사용하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 10분을 수행하고, denaturation 94℃ 15초, annealing 60℃ (HIV-1) / 56℃ (HIV-2) 15초, extention 72℃ 15초 과정을 40회 반복하였으며 melting point analysis는 40-94℃ 구간에서 즉정하였다.
- 3xl03 copies) 까지의 pBX-HIVl을 기질로 사용한 최종 1μ1의 반응액으로 Ultra-rapid real-time PCR을 수행하였으며, HIV-2의 경우에도 동일한 양의 pBX-HIV2를 사용하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 30초를 수행하고, 94℃ 1초, 60℃ (HIV-1) 또는 56℃ (HIV-2) 1초, 72℃ 3초 과정을 40회 반복하였다. Melting point analysis는 45-90℃구간을 측정하였다.
- 3xl02 copy), 10 pmole HTVl-dF, 10 pmole HTV1- dR, 2x greenstar master mix로 조성하였으며 HTV-2에 대하여는 1 fg pBX-HIV2, 10 pmole HIV2-dF, 10 pmole HIV2-dR, 2x greensta master mix로 조성하였다. 반응조건은 pre-denaturation 94℃, 30초를 수행하고, denaturation (94℃), annealing (HIV-1, 60℃/ HIV-2, 56℃), extention (72℃) 과정을 40회 반복하였다. cycle내에서의 각 단계(step)별 시간을 15초-15초-15초, 1(応-10초 -10초, 5초-5초-5초, 3초-3초-3초, 1초-1초-3초로 설정하여 각각 측정하였으며 melting point analysis는 75-9(TC구간을 즉정하여 Tm값을 결정하였다.
- 본 연구에서 수행한 Ultra-rapid real-time PCR의 정량성을 비교하기 위하여, 기존의 일반적 real-time PCR기기인 Exicycler™ Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)을 사용하여 각 단계별 설정시간만을 제외한 동일 실험을 수행하고 결과를 비교하였다. Exicycler™ Quantitative Thermal Block을 이용한 real-time PCR의 조성은 10 attogram (2.
- 본 연구에서 제시하는 Ultra-rapid real-time PCR과 일반 Real- Time PCR의 정량성을 비교하기 위하여, 일반 real-time PCR 기기인 Exicycler™ Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)을사용하여 동일한 실험을 수행하고 초고속 실시간 PCR의 장단점을 추론하였다. 여기서 초고속 실시간 PCRe PCR의 각 단계, 즉 denaturation, annealing 및 extention의 시간을 각 1초-1초-3초로 설정한 것을 말하며, 일반 실시간 PCR이란 Thermal block의 특성상 온도의 변화에 신속히 대응하지 못하기에 이를 각 15초- 15초-15초로 설정한 것이다.
- 본 연구의 유전자원인 HIV-l-env495 (495 bp), HIV-2-env294 (294 bp)를 각기 인공 유전자 합성법을 사용하여 제작하였으며 각 단계의 합성 산물은 전기영동을 통하여 확인하였다(Fig. 1). 해당 PCR 산물은 각기 T-vector인 pBX에 클로닝한 후 염기서열 결정을 수행하여 정확히 제작되었음을 확인하였다.
- 3xl02 copies)을 초기 기질로 사용하여 초고속 실시간 PCR의 가능성을 시험하였다. 사용된 기기는 Genespectoie TMC-1000 (Samsung, Korea)이며, 이기기에서 설정할 수 있는 각 단계별 최소 시간인 denaturation (94℃), 1초, annealing (60℃ 또는 56℃), 1초, extention (72℃), 3초의 수준까지, 즉, 각 단계(step)를 15초초・15초에서 부터 점차로 시간의 설정을 줄여 최종 1초-1초-3초까지 PCR을 수행하여 해당 유전자의 증폭여부를 측정하였다.
- 실험에 사용된 real-time PCR 기기는 백금선과 실리콘 microchip을 기반으로 한 GenspectorR TMC-1000 (Samsung, Korea)이며, 이를 이용하여 H* IV 진단할 수 있는 최단 시간을측정하고자 하였다.
- 83을 사용하여 비교분석을 수행하였다. 이 결과로써 각 바이러스군의 유전자 중 가장 상동성의 정도가 높은 염기서열 부분을 추출하게 되었으며, 이는 각기 HTV-l-env495 (495 bp), HIV-2-env294 (294 bp)라 명명하였고, 이를 각기 인공 유전자 합성법을 사용하여 제작하였다.
- 일반적 합성과정에서 PCR의 조성은 각각의 long-nucleotide (50-80 mer) 10 pmole, 2.5 mM dNTP, 2.5 μ1의 lOx PCR buffer (15 mM MgCl2), 2.5 unit Taq polymerase# 첨가하여 최종 25 μ1로 반응을 수행하였으며, 반응 조건은 pre-denaturation 94℃, 5분을 수행하고, denaturation 94℃, 30초, annealing 57℃, 30초, extention 72℃, 30초 과정을 30회 반복한 뒤 postextention 72℃ 10분으로 하였다. 단, 2차의 PCR부터는 각 단계에서 합성된 DNA단편 1 ng을 기질로서 사용하였다.
- 합성된 각 env 부분 유전자들은 PCR product purification kit (Intron, Korea)를 사용하여 염성분을 제거하였고, T-vector인 pBlueXcm (pBX)에 클로닝하였으며, 염기서열 분석 후, 각기 pBX-HIVl과 pBX-HIV2라 명명하였다(2).
대상 데이터
- 3X1W 개가 된다. 민감도 측정에 사용된 real-time PCR 기기도 초고속이 가능한 GenspectorR TMC-1000 (Samsung, Korea)을 사용하였다. 민감도 측정의 결과는 HIV-1과 HIV-2 모두에서, 주어진 10 fg (2.
이론/모형
- 수를 측정하였다. 기질 DNA인 pBX-HIVl의 농도와 copy 수의 상관관계는 기존 연구(9)에서 제시한 관계식에 의해 계산하였으며 본 연구의 모든 copy 수 측정에 적용하였다. HIV-1의 경우, 10 attogram (2.
성능/효과
- 56。(3로 차이를 주었기에, 총소요시간은 HIV-1의 것들이 HIV-2의 것들 보다 상대적으로 짧게 나타났으며, 이는 HIV-2가 HIV-1 에 비하여 40회전의 각 amealing단계에서 4℃ 더 낮은 온도로 온도이동을 수행하였기 때문으로 해석되었다(대조 실험 결과 미제시). 이는 초고속 PCR을 설계함에 있어, primer 염기서열의 높은 GC%가 최소한 총소요시간의 단축에서는 보다 유리할 것임을 시사하고 있다.
- 측정된 annealing 온도의 범위는 54。(2-66。(2이며, 각 2℃ 간격으로 동일조건의 PCR을 수행하여최대산물을 생산하는 annealing온도를 결정하였다. PCR 결과 HIV-1 (117 bp), HIV-2 (119 bp)의 증폭산물을 확인할 수 있었고(Fig. 3A and B), 과 Densitormeter인 Gene Tools v3.06 (Synoptics, England)로 측정 결과 HIV-1의 경우 60℃, HIV-2 의 경우 56P에서 가장 높은 값을 보여(Fig. 3C) 이들을 각기 최적 annealing 온도로 판단하였다.
- 5B and 6B). Tm의 값 중 극미량(2.3개 유전자)에 대한 초고속 실시간 PCR에서 HIV-1 및 HIV-2의 Tm 값들은 모두 상대적으로 낮게 측정되었으나, 전기영동의 결과에서 희박하나마 해당 유전자의 동일한 크기의 PCR 산물이 발견됨에 따라, PCR 조성에서 다량첨가 시킨 primer가 PCR증폭에 참여하지 못하고 용융점분석에서 Tm의 측정에 영향을 미친 것으로 해석하였다. PCR산물의 정성적 면을 평가하는 용융점분석에서 소량의 증폭된 DNA 산물과 다량의 잔류 primer가 Tm에 미치는 영향은 향후 보다 엄밀하게 분석되어야 할 것이며, 초고속 실시간 PCR에서 이에 따른 보정이 이루어져야 할 것으로 생각되었다.
- 6(+ 0.3)。。로 측정되었으며, 모두 전기영동 결과에서 동일한 크기의 PCR 산물이 생성됨을 확인하였으며, Tm값간의 미세한 변화와 CT값 또는 형광강도간에서 규칙성은 발견할 수 없었다(자료 미제시).
- 각 단계별 설정시간의 감소는 HIV-1, HIV-2 모두에서 총소요 시간의 확실한 감소를 보임으로, 초고속 실시간 PCM] 가능함을 보여주었다. 한편 HIV-1의 경우 annealing 온도가 60℃, HIV-2의경우 56。(3로 차이를 주었기에, 총소요시간은 HIV-1의 것들이 HIV-2의 것들 보다 상대적으로 짧게 나타났으며, 이는 HIV-2가 HIV-1 에 비하여 40회전의 각 amealing단계에서 4℃ 더 낮은 온도로 온도이동을 수행하였기 때문으로 해석되었다(대조 실험 결과 미제시).
- 결과로써 최소 설정가능 시간인 각 단계별 1초-1초・3초의 PCR 에서도 pBX・HIVl와 pBX-HIV2의 해당유전자 부위가 정확히 증폭됨을 확인할 수 있었으며 , PCR 후 융점분석시간까지를 포함하여 HIV1의 경우 40회전의 PCR이 13분 15초, HIV-2의 경우 40 회전의 PCR이 14분 48초 만에 검색이 완료되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
- 그러나 동일한 양의 초기기질에 대해 초고속 실시간 PCR과 일반 실시간 PCR법을 비교한 결과, HIV-1과 HIV-2 모두에서 100 ag (2.3x10개)이하의 초기 기질양의 수준에서는 초고속 실시간 PCR법의 CT값이 일반 실시간 PCR법의 CT값보다 상대적으로 낮게 측정되었으며, 10 fg (2.3X103개)의 수준에서는 반대로 초고속 실시간 PCR법의 CT값이 일반 실시간 PCR법보다 상대적으로 높은 것으로 측정되었다(Table 3).
- 다시 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 그 감소 후 증가의 양상도 HIV-1과 HIV-2의 경우가 동일하지 아니하였으며, 즉 HIV-1의 경우 최소 CT값인 27.98회전이 단계별 설정시간 10 초-10초-10초 및 5초-5초-5초에서 동일하게 측정되었으나, HIV-2 의 경우 최소 CT값인 27.63회전이 단계별 설정시간 3초-3초-3초에서 측정되었다. 이러한 양자의 차이의 원인은 아직 규명하지 못하였으나, 각 단계별 충분한 설정시간을 주는 것이 PCR에서 결코 유리한 것이 아닌 사실은 매우 흥미롭다 할 것이다.
- 민감도 측정에 사용된 real-time PCR 기기도 초고속이 가능한 GenspectorR TMC-1000 (Samsung, Korea)을 사용하였다. 민감도 측정의 결과는 HIV-1과 HIV-2 모두에서, 주어진 10 fg (2.3xl03 copies), 1 fg (2.3xl02 copies), 0.1 fg (2.3x10’ copies), 0.01 fg (2.3 copies)의 모든 반응에서 형광값이 증가되어 특이유전자의 존재여부에 대한 검색이 가능한 것으로 확인되었다. 이는 초고속 실시간 PCR에서도 일반 실시간 PCR의 최고수준의 민감도를 보여줄 수 있음을 증명하는 것으로, 초고속 PCR이 일반 PCR에 비하여 동등한 민감도를 갖출 수 있음을 보여준 것이라 하겠다(Fig.
- 본 연구에서 제시한 Ultra-rapid real-time PCR을 이용한 HIV- 1, HIV-2 신속검색법은 기존의 실시간 PCR법에서 간과되어 왔던 검사시간을 단축할 수 있는 가능성을 보여주었다. 본 검사법에서는 PCR조성 후 15분 이내에 HIV-1 및 HIV-2의 특정 유전자를 증폭시켜 , 그 존재를 확인할 수 있었으며 또한 검출의 민감성의 면에서도 HIV-1, HIV-2 각기 2.
- 일반 실시간 PCR을 이용한 민감도 측정에서, HIV-1 및 HIV-2 는 모두 초기 기질의 양이 2.3X10, 개(1 ng)에서 2.3개(10 ag) 에이르기까지 형광값이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 회귀 상수의 값이 印V-1에 대하여 R2=0.9947로, HIV-2에 대하여는 R2=0.9988로, 정량적으로 우수하게 CT값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7A and 8A). 이런 넓은 범위의 초기기질의 양을 정량적으로 측정하는 것은 최종 반응액 1 贝안에서 PCR을 조성하여야 하는 초고속 실시간 PCR법이 감당하기 어려운 것이라 하겠으며, 초미량(lb개의 특정 유전자)의 초기기질의 정량을 제외한 일반적인 정량성에서는 일반 실시간 PCR법이 보다 폭넓게 사용될 수 있을 것이라 사료된다.
- 정량 PCR의 측면에서 분석할 때, HIV-1과 HIV-2 모두에서 CT값은 초기기질농도(양)가 낮을수록 정량적으로 증가되는 것이 확인하였으나, 10 및 100 attogram (2.3 및 23개 유전자) 범위에서의 정량은 다소 불안정한 것으로 측정되었다(Fig. 5A and 6A). 또한 PCR산물에 대한 정성적 측정의 방법인 융점분석 (melting point analysis)에서 Tm값은 HIV-1의 경우 85.
- 특히 HIV-2의 경우 초기기질 2.3개의 특정유전자를 대상으로 한 PCR 증폭에서 초고속 실시간 PCR법은 일반 실시간 PCR 법에 비하여 6 cycle 수준의 CT값이 낮게 측정됨을 보였으며, 이는 초미량의 초기기질에 대한 PCR 증폭은 오히려 초고속 실시간 PCR법이 보다 유리함을 보여주는 것이라 하겠다. 그러나 초고속 실시간 PCR의 특징인 각 단계별 설정 시간의 축소로 인하여 이런 결과가 나왔다는 해석은 무리가 큰 것으로 추론되며, 오히려 초고속 실시간 PCR법에서 사용된 PCR용액이 1 μ1이기에, 같은 양으로 사용된 초기 기질이 일반 PCR법에 비하여 20배의 농축 효과를 보이고, 이는 Primer 및 K?g-polymerase분자와 접촉 빈도를 보다 높일 수 있었기 때문으로 설명될 수 있을 것이다.
- 한편, 각 단계별 설정시간의 축소에 따른 CT값의 정 량적 감소는 발견되지 아니하였으며, HIV-1 및 HIV-2 모두에서 CT 값은 감소하다가 다시 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 그 감소 후 증가의 양상도 HIV-1과 HIV-2의 경우가 동일하지 아니하였으며, 즉 HIV-1의 경우 최소 CT값인 27.
- 1). 해당 PCR 산물은 각기 T-vector인 pBX에 클로닝한 후 염기서열 결정을 수행하여 정확히 제작되었음을 확인하였다. HIV-1- env495 (495 bp) 및 HIV-2-env294 (294 bp)가 삽입된 클론은 각기 pBX-HIVl과 pBX-HIV2로 명명하였으며, 이들 염기서열들은 보고된 해당 유전자들의 multiple alignment 분석에 의해 추론되고 설계된 것이나, 각, 기 GenBank 의 HTV1 env gene (gi_l 184090)의 1949-2443의 서열과 HIV2 env gene (gi_1332355)의 8786-9079의 서열과 동일한 것이었다(Fig.
후속연구
- 3개 유전자)에 대한 초고속 실시간 PCR에서 HIV-1 및 HIV-2의 Tm 값들은 모두 상대적으로 낮게 측정되었으나, 전기영동의 결과에서 희박하나마 해당 유전자의 동일한 크기의 PCR 산물이 발견됨에 따라, PCR 조성에서 다량첨가 시킨 primer가 PCR증폭에 참여하지 못하고 용융점분석에서 Tm의 측정에 영향을 미친 것으로 해석하였다. PCR산물의 정성적 면을 평가하는 용융점분석에서 소량의 증폭된 DNA 산물과 다량의 잔류 primer가 Tm에 미치는 영향은 향후 보다 엄밀하게 분석되어야 할 것이며, 초고속 실시간 PCR에서 이에 따른 보정이 이루어져야 할 것으로 생각되었다.
- 비록 HIV의 진단은 정확성이 필요한 진단 영역이지만 본 연구에서 개발한 초고속 실시간 PCR 진단법은 1차적인 검색을 위해 유용하게 사용될 것으로 사료된다. 또한 이런 초고속 실시간 PCR 진단법은 HTV의 진단 뿐 아니라 다른 바이러스와 같은 병원체의 PCR 진단법에 대해서도 그 빠른 PCR법을 적용한 개선이 이루어질 수 있을 것이며, 10분 이내의 검사를 완료할 수 있도록 발전함으로써 이른바 즉석검사 등에서 활용될 수 있기를 기대한다.
- 검사시간을 단축할 수 있는 가능성을 보여주었다. 본 검사법에서는 PCR조성 후 15분 이내에 HIV-1 및 HIV-2의 특정 유전자를 증폭시켜 , 그 존재를 확인할 수 있었으며 또한 검출의 민감성의 면에서도 HIV-1, HIV-2 각기 2.3개의 em 유전자의 존재를 유전자 증폭을 통하여 확인할 수 있을 정도로 높은 민감도를 보여 주었으나 차후 임상시료에서의 검출 실험을 통해 민감도를 증명할 필요성이 있다. 비록 HIV의 진단은 정확성이 필요한 진단 영역이지만 본 연구에서 개발한 초고속 실시간 PCR 진단법은 1차적인 검색을 위해 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
- 3개의 em 유전자의 존재를 유전자 증폭을 통하여 확인할 수 있을 정도로 높은 민감도를 보여 주었으나 차후 임상시료에서의 검출 실험을 통해 민감도를 증명할 필요성이 있다. 비록 HIV의 진단은 정확성이 필요한 진단 영역이지만 본 연구에서 개발한 초고속 실시간 PCR 진단법은 1차적인 검색을 위해 유용하게 사용될 것으로 사료된다. 또한 이런 초고속 실시간 PCR 진단법은 HTV의 진단 뿐 아니라 다른 바이러스와 같은 병원체의 PCR 진단법에 대해서도 그 빠른 PCR법을 적용한 개선이 이루어질 수 있을 것이며, 10분 이내의 검사를 완료할 수 있도록 발전함으로써 이른바 즉석검사 등에서 활용될 수 있기를 기대한다.
- 7A and 8A). 이런 넓은 범위의 초기기질의 양을 정량적으로 측정하는 것은 최종 반응액 1 贝안에서 PCR을 조성하여야 하는 초고속 실시간 PCR법이 감당하기 어려운 것이라 하겠으며, 초미량(lb개의 특정 유전자)의 초기기질의 정량을 제외한 일반적인 정량성에서는 일반 실시간 PCR법이 보다 폭넓게 사용될 수 있을 것이라 사료된다.
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