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문제 정의
- 따라서 이러한 특성을 갖는 젖산균을 김치에서 분리하여 확보하고 이 젖산균을 이용하여 감귤의 분쇄물을 발효시켜 이를 양식 넙치의 사육시 사료첨가제로 사용하여 넙치의 성장률에 미치는 영향을 조사함으로써 젖산균에 의한 감귤발효물의 사료 첨가제로서의 가능성을 확인하고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 분리된 균주를 MRS 액체 배지에 2회 계대하여 30℃에서 16-18 시간 배양한 후 배양액을 고체배지에 3 μ1 점적하고 30℃에서 18시간 배양하였다. Colony가 형성되면 액체배지에서 배양한 시험균을 5x106-5x107 CFU/ml로 접종한 MRS soft agar (MRS+ agar 0.7%) 배지 8 ml을 부어 굳힌 다음 지시균에 따른 적정 배양온도에서 배양한 후, spot 주위에 발생하는 생육 저지환의 크기로서 항균활성을 여부를 조사하였다.
- , USA)과 hesperetin (Sigma Co, USA)을 구입하여 위와 같은 HPLC 조건에서 분석하였다. HPLC 검출기를 통해 얻은 flavonoid의 농도에 따른 peak의 면적을 측정하여 분석한 시료의 수치와 비교하여 그 함량을 환산하였다.
- L. lactis W-44로 발효된 감귤발효물(0.02-10%, v/w)을 첨가한 사료를 투여하여 16주간 사육하면서 매 4주 간격으로 체중 및 전장을 측정한 결과를 Table 2와 3에 표시하였다. Table 2의 결과에 나타난 바와 같이 실험 종료 후, 감귤발효물을 첨가하지 않은 대조구의 전장은 15.
- 건조하였다. MeOH 추출물을 증류수에 현탁한 후 chloroform, butanee 순차적으로 추출하여 분획하고 각 분획물을 완전히 건조시킨 후 MeOH을 이용하여 5 mg/ml, 1 mg/ml의 용액을 만들고 일정량을 취하여 high performance liquid chromatography (HPLC)하였다. 무배당체의 naringenin과 hesperetin의 함량을 측정하기 위한 HPLC 분석조건으로는 Shimadzu LC-6A (Shimadzu, Japan), YMC ODS-18 (4.
- 0%를 2-3회/일 공급하면서 16주 간 투여하였다. 감귤 발효액을 첨가하지 않은 사료를 같은 방법으로 투여하여 대조군으로 하였다. 수조 내 수량은 1 ton이었으며, 1 일 15-18회 환수시켰다.
- 김치에서 젖산균 배지인 MRS agart- 사용하여 분리한 총 600 주의 젖산균의 배양액을 대상으로 변형된 spot-on-the-lawn method (5)를 사용하여 항균활성을 조사하여 항균활성이 가장 강한 균주인 W-44를 최종 선정하였다. 최종 선정된 균주 W-44는 구균으로, 크기는 0.
- 7%) 배지에 직경 8 mm의 well을 만들고 일차적으로 분리된 젖산균의 배양액 100 μ1를 가하여 각 시험균의 최적온도에서 18시간 배양하여 well 주위의 나타나는 생육 저지환의 크기에 따라 젖산균의 항균 활성을 조사하였다. 또한, 항균활성을 나타내는 젖산균의 배양 상등액에 1 N NaOH를 가하여 중화하거나 a-chymotrypsin, trypsin, protease type IX 및 type XIV 등의 단백질 분해효소를 처리한 뒤, 시험균에 대한 항균활성을 조사하.여 항균활성 물질이 젖산, 유기산 또는 단백질성 여부를 확인하였다.
- 0 ml/min이었으며 photodiode array (Shimadzu, Japan)가 장치된 검출기로 분석하였다(21). 무배당체 flavonoid 표준 시료로 naringenin (Sigma Co., USA)과 hesperetin (Sigma Co, USA)을 구입하여 위와 같은 HPLC 조건에서 분석하였다. HPLC 검출기를 통해 얻은 flavonoid의 농도에 따른 peak의 면적을 측정하여 분석한 시료의 수치와 비교하여 그 함량을 환산하였다.
- MeOH 추출물을 증류수에 현탁한 후 chloroform, butanee 순차적으로 추출하여 분획하고 각 분획물을 완전히 건조시킨 후 MeOH을 이용하여 5 mg/ml, 1 mg/ml의 용액을 만들고 일정량을 취하여 high performance liquid chromatography (HPLC)하였다. 무배당체의 naringenin과 hesperetin의 함량을 측정하기 위한 HPLC 분석조건으로는 Shimadzu LC-6A (Shimadzu, Japan), YMC ODS-18 (4.6x250 mm, S-4 |im, YMC, Japan) column, 0.01% trifluoroacetica acid (Sigma Co., USA)가 함유된 30% acetonitrile (Merck Co., Germany) 수용액, 유속 1.0 ml/min이었으며 photodiode array (Shimadzu, Japan)가 장치된 검출기로 분석하였다(21). 무배당체 flavonoid 표준 시료로 naringenin (Sigma Co.
- 젖산균을 다양하게 분리하기 위해 젖산균 배지인 MRS agar 배지와 젖산균 선택배지(17) 를 사용하였다. 분리된 젖산균 중에서 항균활성이 우수한 젖산균을 선별한 후에 생리학적 특성과 16S rDNA의 28에서 1, 524번 염기까지의 1, 497 bp 염기서열을 분석한 후 CLUSTAL W software (EBI, UK)로 비교하고 최종 동정하였다(27).
- 시험균이 1% 함유된 MRS soft agar (0.7%) 배지에 직경 8 mm의 well을 만들고 일차적으로 분리된 젖산균의 배양액 100 μ1를 가하여 각 시험균의 최적온도에서 18시간 배양하여 well 주위의 나타나는 생육 저지환의 크기에 따라 젖산균의 항균 활성을 조사하였다. 또한, 항균활성을 나타내는 젖산균의 배양 상등액에 1 N NaOH를 가하여 중화하거나 a-chymotrypsin, trypsin, protease type IX 및 type XIV 등의 단백질 분해효소를 처리한 뒤, 시험균에 대한 항균활성을 조사하.
- 수조 내 수량은 1 ton이었으며, 1 일 15-18회 환수시켰다. 실험 기간 중에 수온, 용존산소량(DO- meter, DO-14P), pH (pH-meter, HM-12P), 염분은 광학염분계(S/ Mill-E, ATAGO)를 사용하여 1일 간격으로 측정하였다.
- 실험어는 각 115 마리씩 약 2 ton (Φ 150x100 cm) 규모의 원뿔형 FRP 수조에서 7일간 순치시킨 다음 사용하였다. 실험용 사료는 시판의 넙치용 배합사료에 감귤 발효액을 0.02-10% 첨가하여 흡착시켜 제조하였다. 일간사료 투여량은 어체중의 1.
- 또한, 항균활성을 나타내는 젖산균의 배양 상등액에 1 N NaOH를 가하여 중화하거나 a-chymotrypsin, trypsin, protease type IX 및 type XIV 등의 단백질 분해효소를 처리한 뒤, 시험균에 대한 항균활성을 조사하.여 항균활성 물질이 젖산, 유기산 또는 단백질성 여부를 확인하였다.
- 02-10% 첨가하여 흡착시켜 제조하였다. 일간사료 투여량은 어체중의 1.0%를 2-3회/일 공급하면서 16주 간 투여하였다. 감귤 발효액을 첨가하지 않은 사료를 같은 방법으로 투여하여 대조군으로 하였다.
- 85이었으며, 감귤은 미생물 발효에 적합하도록 분쇄기로 완전 분쇄하고, 실험에 사용될때 까지 -2UC에서 보관하였다. 젖산균 발효를 위한 기본 배지로는 MRS (Difco, USA)배지를 사용하였고, 감귤 분쇄액은 필요에 따라 농도를 조절하여 첨가하였다. L.
- lactis W-44의 배양은 50 ml의 MRS가 첨가된 250 ml Erlenmyer flask에서 18시간 종배양한 후, 이를 200 ml MRS가 첨가된 250 ml Erlenmyer flask 에서 28℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였으며, 세포의 성장은 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 나타내었다. 젖산균의 보관용배지는 agar 1.5% (w/v)가 포함된 MRS 한천고체배지를 사용하였고, 4주마다 동일한 배지를 이용하여 계대 배양하였다.
대상 데이터
- 94 g을 사용하였다. 실험어는 각 115 마리씩 약 2 ton (Φ 150x100 cm) 규모의 원뿔형 FRP 수조에서 7일간 순치시킨 다음 사용하였다. 실험용 사료는 시판의 넙치용 배합사료에 감귤 발효액을 0.
- 실험에 사용된 넙치 치어는 제주도 내 넙치양식장에서 종묘생산한 치어로 제주대학교 해양과환경연구소로 운반한 후 실험에 사용하였다. 실험어는 실험개시 전, 평균 전장 8.
- 전국 각지에서 여러 종류의 김치 및 기타 전통 발효식품 등의 시료를 수집하고 밀봉하여 냉장 운반하였다. 수집 후, 24시간 이내에 멸균된 생리식염수로써 10배수로 연속 희석한 시료 100 μ1 를 항진균제인 nystatin을 함유한 배지에 도말하여 균체가 나타날 때까지 30℃ 항온기에서 배양하였다.
- 수집 후, 24시간 이내에 멸균된 생리식염수로써 10배수로 연속 희석한 시료 100 μ1 를 항진균제인 nystatin을 함유한 배지에 도말하여 균체가 나타날 때까지 30℃ 항온기에서 배양하였다. 젖산균을 다양하게 분리하기 위해 젖산균 배지인 MRS agar 배지와 젖산균 선택배지(17) 를 사용하였다. 분리된 젖산균 중에서 항균활성이 우수한 젖산균을 선별한 후에 생리학적 특성과 16S rDNA의 28에서 1, 524번 염기까지의 1, 497 bp 염기서열을 분석한 후 CLUSTAL W software (EBI, UK)로 비교하고 최종 동정하였다(27).
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미생물 발효에 의한 감귤 발효물 제조
제주도 남제주군 가시리 소재(23년생 일반조생, 궁천)에서 무농약 재배법에 의해 재배된 감귤을 구입하여 사용하였다. 이 때, 감귤의 평균 당도는 11.
이론/모형
- L. lactis W-44 균주가 생산하는 항균활성 범위를 조사하기 위해 well-diffusion assay 방법으로 배양 상등액을 시험균에 대한 항균작용을 조사하여 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 조사된 시험균 중에서 Lactobacillus 중 8개 균주, Leuconostoc 중 5개균주 및 Pediococcus 중 한 균주가 상등액에 의해 생육이 억제되었다.
- 선정된 젖산균의 항균력은 well-diffusion assay 방법으로 조사하였다(5). 시험균이 1% 함유된 MRS soft agar (0.
- 일차적으로 분리한 젖산균의 배양액을 대상으로 변형된 spot- on-the-lawn method (5)를 사용하여 항균활성 여부를 조사하였다. 분리된 균주를 MRS 액체 배지에 2회 계대하여 30℃에서 16-18 시간 배양한 후 배양액을 고체배지에 3 μ1 점적하고 30℃에서 18시간 배양하였다.
성능/효과
- lactis W-44를 접종하여 28℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하여 감귤 발효를 수행하였다. Naringenin과 hesperitin의 함량은 L. lactis W-44의 접종 시점에서 124, 188 ng/g였으나, 배양 7일 후에는 1295, 1105 ng/g으로 기존의 함량보다 10.4배, 5.9배 증가하였다(Fig. 2). 또한 naringenin과 hesperitin의 함량은 L.
- 02-10%, v/w)을 첨가한 사료를 투여하여 16주간 사육하면서 매 4주 간격으로 체중 및 전장을 측정한 결과를 Table 2와 3에 표시하였다. Table 2의 결과에 나타난 바와 같이 실험 종료 후, 감귤발효물을 첨가하지 않은 대조구의 전장은 15.9±1.8 cm로 177%의 성장률을 나타낸 반면, 0.2%의 감귤발효물을 첨가한 실험구에서는 15.8H.9-16.6±1.8 로서 178-186%의 성장률을 나타냄으로써 대조구에 비해 4.5% 정도 더 높은 성장효과를 나타내었다. 또한 체중의 경우, Table 3에 표시한 것처럼 대조구는 최종 50.
- 조사된 병원성균과 부패균 중 Listeria monocytogenes KCTC 3710을 제외한 Candida albicans KCTC 1940, Bacillus subtilis KCTC 1013 및 Staphylococcus aureus KCTC 1928에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 나타나 그람 양성세균에만 항균활성을 갖음을 확인하였다. 또한 L. lactis W-44 배양액을 단백질 분해효소인 a-chymotrypsin을 처리하여 항균활성을 조사한 결과, 항균활성이 사라지는 것으로 보아 L. lactis W-44가 생산하는 항균물질은 peptide 계열로 예상된다.
- 55 ㎛ 이었다. 또한 W-44의 16S rDNA의 28에서 1524번 염기까지의 1, 497 bp의 염기서열을 분석하여 이를 젖산균 16S rDNA 염기서열과 CLUSTAL W software (EBI, UK)로 비교한 후, evolutionary distance 및 phylogenetic tree를 작성한 결과 Lactococcus lactis ATCC19435 및 Lactococcus lactis ATCC19257과 각각 100, 99.4% 일치하는 것을 확인하고, 최종적으로 L. lactis W-44로 명명하였다(Fig. 1).
- 5% 정도 더 높은 성장효과를 나타내었다. 또한 체중의 경우, Table 3에 표시한 것처럼 대조구는 최종 50.5+16.9 g으로 579% 의 성장을 나타낸 반면, 0.2%의 감귤발효물을 첨가한 실험 구에서는 최대 700%의 넙치 성장률을 나타냄으로써 대조구에 비해 20.9% 정도 더 높은 성장효과를 나타내었다. 한편, 어체 폐사율의 경우 실험시작시 사용한 치어수에 대비하여 대조구는 13%, 각 실험구에서는 9-15%로 각 실험구 별로 약간의 차이는 있었으나(자료 미제시), 대조구에 비해 큰 차이가 없는 것으로 보아 감귤 발효 물의 투여로 인한 독성 여부는 없는 것으로 사료된다.
- 한편, 어체 폐사율의 경우 실험시작시 사용한 치어수에 대비하여 대조구는 13%, 각 실험구에서는 9-15%로 각 실험구 별로 약간의 차이는 있었으나(자료 미제시), 대조구에 비해 큰 차이가 없는 것으로 보아 감귤 발효 물의 투여로 인한 독성 여부는 없는 것으로 사료된다. 이와 같이 감귤발효물에 의한 양식넙치의 생육 촉진효과는 L. lactis W-44의 균체와 이 균에 의한 항균활성, 감귤 과피내 활성형 flavonoids 및 다량의 비타민 등에 기인한 것으로 예상되며, 이러한 결과는 본 실험에 사용된 감귤발효물이 양식넙치의 성장에 우수한 기능성 사료첨가제라는 사실을 시사하고 있다.
- 조사된 시험균 중에서 Lactobacillus 중 8개 균주, Leuconostoc 중 5개균주 및 Pediococcus 중 한 균주가 상등액에 의해 생육이 억제되었다. 조사된 병원성균과 부패균 중 Listeria monocytogenes KCTC 3710을 제외한 Candida albicans KCTC 1940, Bacillus subtilis KCTC 1013 및 Staphylococcus aureus KCTC 1928에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 나타나 그람 양성세균에만 항균활성을 갖음을 확인하였다. 또한 L.
- lactis W-44 균주가 생산하는 항균활성 범위를 조사하기 위해 well-diffusion assay 방법으로 배양 상등액을 시험균에 대한 항균작용을 조사하여 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 조사된 시험균 중에서 Lactobacillus 중 8개 균주, Leuconostoc 중 5개균주 및 Pediococcus 중 한 균주가 상등액에 의해 생육이 억제되었다. 조사된 병원성균과 부패균 중 Listeria monocytogenes KCTC 3710을 제외한 Candida albicans KCTC 1940, Bacillus subtilis KCTC 1013 및 Staphylococcus aureus KCTC 1928에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 나타나 그람 양성세균에만 항균활성을 갖음을 확인하였다.
- 9% 정도 더 높은 성장효과를 나타내었다. 한편, 어체 폐사율의 경우 실험시작시 사용한 치어수에 대비하여 대조구는 13%, 각 실험구에서는 9-15%로 각 실험구 별로 약간의 차이는 있었으나(자료 미제시), 대조구에 비해 큰 차이가 없는 것으로 보아 감귤 발효 물의 투여로 인한 독성 여부는 없는 것으로 사료된다. 이와 같이 감귤발효물에 의한 양식넙치의 생육 촉진효과는 L.
후속연구
- 따라서 본 실험에서 넙치 양실험을 통하여 검증된 젖산균에 의해 발효된 감귤 발효물을 사용하여 넙치 양식어를 생산하는 경우, 현행 양^업 기술의 향상 및 경제적 가치의 증가에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
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