두 가지 곤충 세포주에 대한 배양 및 바이러스 증식을 위한 최적 FBS 농도 결정 Determination of the Optimal Concentration of Fetal Bovine Serum for the Growth of Two Insect Cell and Viruses원문보기
곤충 세포주 Sf21과 Bm5 세포주에 대해 세포 배양과 바이러스의 증식을 위한 최적 FBS 의 농도를 결정하기 위하여 다양한 FBS 농도에서 세포 및 바이러스의 증식 곡선을 비교하였다. 세포의 생존율, 증식속도, 증식량 그리고 FBS 함량을 모두 고려할 때 Sf21 에 대해서는 7%가, Bm5에 대해서는 5% FBS 가 최적 농도로 결정되었다. 바이러스의 증식은 감염 후 5일째에 두 세포주 모두 모든 FBS 농도에서 유사한 증식량을 보였으나, 감염 후 2 일과 3일에 있어서는 Sf21 은 각각 10%와 3%가 Bm5 에 대해서는 양일 모두 5% FBS 농도에서 가장 증식량이 높았다. 이러한 결과는 목적에 따라 세포 및 바이러스 증식을 위한 적정 FBS 농도의 결정이 필요함을 제시하는 것이다.
곤충 세포주 Sf21과 Bm5 세포주에 대해 세포 배양과 바이러스의 증식을 위한 최적 FBS 의 농도를 결정하기 위하여 다양한 FBS 농도에서 세포 및 바이러스의 증식 곡선을 비교하였다. 세포의 생존율, 증식속도, 증식량 그리고 FBS 함량을 모두 고려할 때 Sf21 에 대해서는 7%가, Bm5에 대해서는 5% FBS 가 최적 농도로 결정되었다. 바이러스의 증식은 감염 후 5일째에 두 세포주 모두 모든 FBS 농도에서 유사한 증식량을 보였으나, 감염 후 2 일과 3일에 있어서는 Sf21 은 각각 10%와 3%가 Bm5 에 대해서는 양일 모두 5% FBS 농도에서 가장 증식량이 높았다. 이러한 결과는 목적에 따라 세포 및 바이러스 증식을 위한 적정 FBS 농도의 결정이 필요함을 제시하는 것이다.
To determine the optimal concentration of fetal bovine serum (FBS) on the growth of insect cells and the multiplicity of viruses, the growth of cells (Sf21 and Bm5) and viruses were examined on the various concentrations of FBS. In view of the viability, growth speed, proliferation of cells and the ...
To determine the optimal concentration of fetal bovine serum (FBS) on the growth of insect cells and the multiplicity of viruses, the growth of cells (Sf21 and Bm5) and viruses were examined on the various concentrations of FBS. In view of the viability, growth speed, proliferation of cells and the amount of FBS, the most proper concentration for the cell culture were 7% and 5% for Sf21 and Bm5, respectively. The multiplicity of viruses at the various concentrations of FBS was similar in both cell lines at 5 days post-infection (p.i.). However, it differed significantly at 2 and 3 days p.i. The proper concentration of FBS were 10% and 3% for Sf21 at 2 and 3 days p.i., respectively, and 5% for Bm5 at both 2 and 3 days p.i. These results suggested that the optimal concentration of FBS should be determined according to the used cell lines and viruses for their optimum production.
To determine the optimal concentration of fetal bovine serum (FBS) on the growth of insect cells and the multiplicity of viruses, the growth of cells (Sf21 and Bm5) and viruses were examined on the various concentrations of FBS. In view of the viability, growth speed, proliferation of cells and the amount of FBS, the most proper concentration for the cell culture were 7% and 5% for Sf21 and Bm5, respectively. The multiplicity of viruses at the various concentrations of FBS was similar in both cell lines at 5 days post-infection (p.i.). However, it differed significantly at 2 and 3 days p.i. The proper concentration of FBS were 10% and 3% for Sf21 at 2 and 3 days p.i., respectively, and 5% for Bm5 at both 2 and 3 days p.i. These results suggested that the optimal concentration of FBS should be determined according to the used cell lines and viruses for their optimum production.
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문제 정의
이와 같이 곤충 세포주에서 바이러스에 대한 FBS의 영향^ 대해서는 조금씩 서로 상반된 결과도 보고되고 있으나 공통적인 사항은 FBS의 존재가 바이러스의증식율에는 좋지 않은 영향을 미치며, 발현하고자 하는 단백질에 따라 FBS가 유리하게 또는 불리하게 작용할 수 있음을 보여주고 있다. 따라서 본 연구 결과에서도 보여주는 것과 같이 곤충 세포주를 이용하여 실험을 수행하는데 있어서는, 목적에 따라 세포주 및 바이러스에 대해 적절한 FBS의 첨가량이 먼저 결정되어야만 만족스러운 실험 결과를 얻을 수 있을 것으로 여겨진다.
따라서 이들 세포주에 대한 FBS의 영향에 대해 많은 보고가 있으나 그 중 Sf21과 Bm5에 대해서는 현재까지 FBS의 영향에 대해 세포 및 바이러스의 증식과 관련한 보고가 미진한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 이들 두 세포주에 대해 다양한 FBS 농도에서 증식양상을 조사하고 이를 바탕으로 바이러스의 증식을 위한 최적 FBS 농도를 결정하고자 하였다.
제안 방법
FBS 함량에 따른 세포의 증식양상을 조사하기 위하여 3~15%의 FBS 농도로 세포를 배양하며 증식곡선(Fig. 1A and 2A) 및 생존율(Fig. IB and 2B)을 조사하였다. 그 결과 두 세포주 모두 FBS 함량이 증가할수록 세포의증식율 역시 대체적으로 높게 나타났으며, 특히 7% FBS 농도와 그 이하의 농도 사이에는 그 차이가 더욱 뚜렷하게 나타났다(Fig.
다양한 FBS 농도에서 바이러스의 증식 양상을 조사하기 위하여 표지유전자로써 lacZ 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스를 각 세포주에 접종하고 |3-galactosidase 의 발현여부를 확인하여 바이러스의 증식곡선을 작성하였다. 그 결과, 두 바이 러스 모두 접종 4일과 5 일 후에는 증식량이 모두 비슷한 최고치를 보였으나, 일반적으로 특정 단백질을 발현 후 수거하는 시기인 접종 후 2일과 3일째에는 FBS 함량에 따라 상당한 차이를 보였다(Fig.
다양한 FBS 농도에서 바이러스의 증식율을 비교 조사하기 위하여 각 FBS 농도에서 배양된 세포를 lxl06 cells로 25 cm2 flask (5 ml)에 초기 분주한 후, BacPAK6 및 BmKl-LacZ를 각각 1 MOI (multiplicity of infection)로 접종하고 각각의 FBS 농도로 배양하였다. 접종 후 1일 간격으로 5일까지 100 国씩 세포배양액을 수거하고 O'Reilly et al.
다양한 FBS 농도에서의 세포 증식곡선을 작성하기 위하여 5% FBS 농도에서 계대배양 중이던 각 세포주를 3%, 5%, 7%, 10% 그리고 15% FBS 농도에서 5회 이상계 대배양하여 각 FBS 농도에 충분히 적응시킨 후 실험에 이용하였다. 세포 증식곡선은 8개의 60 mm culture plate에 각 배양세포를 초기 농도 2><1。5 cells/ml로 2 ml 분주하고 1일 간격으로 plate를 수거하여 8일까지 증식 곡선을 작성하였다.
(1992)의 end-point dilution 방법을 준용하여 바이러스의 PFU (plaque forming unit)를 결정하였다. 바이러스의 농도는 96 well plate에 각 세포를 분주하고 수거한 바이러스액을 단계별로 희석하여 접종한 다음 접종 5일 후에 X-gal 용액(50 mg/ml)을 0.1 %로 처리하여 발색 여부에 따라 바이러스 감염여부를 결정함으로써 바이러스 농도를 조사하였다.
세포 증식곡선은 8개의 60 mm culture plate에 각 배양세포를 초기 농도 2><1。5 cells/ml로 2 ml 분주하고 1일 간격으로 plate를 수거하여 8일까지 증식 곡선을 작성하였다. 세포 계수는 수거한 배양 세포에 0.4% tiypan blue를 1:1로 처리한 후 hemocytometer를 이용하여 조사하였으며 염색여부에 따라 생존율을 계산하였다.
각각의 FBS 농도로 배양하였다. 접종 후 1일 간격으로 5일까지 100 国씩 세포배양액을 수거하고 O'Reilly et al. (1992)의 end-point dilution 방법을 준용하여 바이러스의 PFU (plaque forming unit)를 결정하였다. 바이러스의 농도는 96 well plate에 각 세포를 분주하고 수거한 바이러스액을 단계별로 희석하여 접종한 다음 접종 5일 후에 X-gal 용액(50 mg/ml)을 0.
대상 데이터
곤충 세포주는 S. 血giperda의 난소에서 유래된 Sf21 과누에(B. mo祖)의 난소에서 유래된 Bm5 세포주를 곤충 세포 배양용 TC-100 배지에서 5% FBS 농도로 27℃에서 계대배양 중이던 것을 이용하였다. 바이러스는 다각체 단백질 유전자(polyhedrin gene) 대신에 표지 유전자로써 대장균 유래의 3-galactosidase 유전자를 가진 재조합 AcNPV인 BacPAK6 (Clontech)와 재조합 BmNPV인 BmKl-LacZ (Hong et al.
이론/모형
Cells were infected with 1 MOI. Aliquots were sampled at indicated times after infection and the viral titers were determined by end-point dilution method.
mo祖)의 난소에서 유래된 Bm5 세포주를 곤충 세포 배양용 TC-100 배지에서 5% FBS 농도로 27℃에서 계대배양 중이던 것을 이용하였다. 바이러스는 다각체 단백질 유전자(polyhedrin gene) 대신에 표지 유전자로써 대장균 유래의 3-galactosidase 유전자를 가진 재조합 AcNPV인 BacPAK6 (Clontech)와 재조합 BmNPV인 BmKl-LacZ (Hong et al., 2000)를 일반적인 바이러스증식법(O'Reilly et al., 1992)에 따라 각각 Sf21 및 Bm5에서 증식시키고 바이러스 농도를 결정한 후 실험에 이용하였다.
성능/효과
2B) Bm5 세포주가 낮은 FBS 농도에서는 좀 더 안정적으로 증식하는 것으로 나타났다 한편 초기 분주 후 두 배로 늘어나는 시간(doubling time) 은 Sf21 세포의 경우 7% 이상의 농도에서는 3일 이내에 이루어졌으나 5% 농도에서는 4일 이내 그리고 3% 농도에서는 약 5일 이내에 이루어지는 것으로 조사되었으나, 7% 이상 농도에서만 생존율이 80% 이상 유지되는 것으로 보아 Sf21 세포의 경우 계대배양을 위해서는 7% FBS 함량이 가장 적정한 것으로 여겨졌다. Bm5 세포의 경우에는 Sf21 세포에 비해 다소 느린 증식을 보여 15%인 경우에만 2일 이내에 두 배 증식이 이루어졌고, 10%인 경우에는 3일, 7%인 경우에는 4일, 5%인 경우에는 5일 그리고 3%인 경우에는 7일 이내에 두 배의 증식이 이루어지는 것으로 나타났다(Fig. 2A). 그러나 생존율은 5%의 농도에서도 7일까지 80% 이상 유지되는 것으로 보아 5% FBS 함량만으로도 양호한 계대배양이 가능한 것으로 조사되었다 이상의 결과에서 계대배양을 위한 조건으로는 두 세포주가 약간 다른 경향을 보여, 세포의 증식량, 증식속도, 생존율 그리고 FBS 첨가량을 모두 고려할 때 Sf21 은 7%, Bm5는 5%가 최적인 것으로 결정되었다.
IB and 2B)을 조사하였다. 그 결과 두 세포주 모두 FBS 함량이 증가할수록 세포의증식율 역시 대체적으로 높게 나타났으며, 특히 7% FBS 농도와 그 이하의 농도 사이에는 그 차이가 더욱 뚜렷하게 나타났다(Fig. 1A, 2A). 그러나 세포의 생존율에 있어서는 두 세포주간에 다소 차이가 있어 Sf21 세포주의 경우에는 7% 이상의 농도에서만 80% 이상의 생존율을 보인 반면 (Fig.
그 결과, 두 바이 러스 모두 접종 4일과 5 일 후에는 증식량이 모두 비슷한 최고치를 보였으나, 일반적으로 특정 단백질을 발현 후 수거하는 시기인 접종 후 2일과 3일째에는 FBS 함량에 따라 상당한 차이를 보였다(Fig. 3). 재조합 AcNPV인 BacPAK6를 Sf21에 접종 한 경우, 접종 후 2일째에는 10% FBS 농도에서 가장 높은 증식율을 보인 반면, 접종 후 3일째에는 모든 농도에서 큰 차이를 보이지는 않았으나 3%와 5%에서 가장 높은 증식율을보였다世ig.
2A). 그러나 생존율은 5%의 농도에서도 7일까지 80% 이상 유지되는 것으로 보아 5% FBS 함량만으로도 양호한 계대배양이 가능한 것으로 조사되었다 이상의 결과에서 계대배양을 위한 조건으로는 두 세포주가 약간 다른 경향을 보여, 세포의 증식량, 증식속도, 생존율 그리고 FBS 첨가량을 모두 고려할 때 Sf21 은 7%, Bm5는 5%가 최적인 것으로 결정되었다.
1A, 2A). 그러나 세포의 생존율에 있어서는 두 세포주간에 다소 차이가 있어 Sf21 세포주의 경우에는 7% 이상의 농도에서만 80% 이상의 생존율을 보인 반면 (Fig. IB), Bm5 세포주의 경우에는 5% 농도까지 유사한 생존율을 보여(Fig. 2B) Bm5 세포주가 낮은 FBS 농도에서는 좀 더 안정적으로 증식하는 것으로 나타났다 한편 초기 분주 후 두 배로 늘어나는 시간(doubling time) 은 Sf21 세포의 경우 7% 이상의 농도에서는 3일 이내에 이루어졌으나 5% 농도에서는 4일 이내 그리고 3% 농도에서는 약 5일 이내에 이루어지는 것으로 조사되었으나, 7% 이상 농도에서만 생존율이 80% 이상 유지되는 것으로 보아 Sf21 세포의 경우 계대배양을 위해서는 7% FBS 함량이 가장 적정한 것으로 여겨졌다. Bm5 세포의 경우에는 Sf21 세포에 비해 다소 느린 증식을 보여 15%인 경우에만 2일 이내에 두 배 증식이 이루어졌고, 10%인 경우에는 3일, 7%인 경우에는 4일, 5%인 경우에는 5일 그리고 3%인 경우에는 7일 이내에 두 배의 증식이 이루어지는 것으로 나타났다(Fig.
유지할 수 있을 것으로 기대된다. 그러한 측면에서 본 연구의 결과 제시된 Sf21의 경우에는 80% 이상 생존율을 보이는 7% FBS 농도에서 그리고 Bm5 세포의 경우에는 5% FBS 농도에서 계대배양함이 좋을 것으로 여겨졌다. 그러나 실험을 목적으로한 세포의 빠른 증식과 더욱 높은 생존율이 요구될 경우에는 그 이상의 FBS 농도에서 배양함이 좋음을 역시 보여주고 있다.
3B). 이러한 결과는 FBS의 함량이 높을수록 바이 러스의 증식에는 불리한 환경이라는 기존의 보고와 유사한결과이나, FBS 함량변화에 비례하여 바이러스의 증식 정도가 변하지는 않았다. 이러한 결과는 바이러스의 증식이 세포의 증식과 연관되어 영향을 받음으로써 세포주에 따라 FBS의 영향정도도 달라지는 것으로 여겨졌다.
이러한 결과는 FBS의 함량이 높을수록 바이 러스의 증식에는 불리한 환경이라는 기존의 보고와 유사한결과이나, FBS 함량변화에 비례하여 바이러스의 증식 정도가 변하지는 않았다. 이러한 결과는 바이러스의 증식이 세포의 증식과 연관되어 영향을 받음으로써 세포주에 따라 FBS의 영향정도도 달라지는 것으로 여겨졌다.
그러나 실험을 목적으로한 세포의 빠른 증식과 더욱 높은 생존율이 요구될 경우에는 그 이상의 FBS 농도에서 배양함이 좋음을 역시 보여주고 있다. 한편 바이러스의 증식에서도 그 목적에 따라 적절한 FBS 농도를 결정함이 필요함을 보여주어, 외래단백질의 발현을 목적으로 하는 경우에는 목적 단백질의 안정성과 관련지어 빠른 증식이 이루어지는 3~10%의 FBS 농도에서 증식이 필요함을 보여주며, 단순히 바이러스의 증식만을 목적으로 하는 경우에는 두 세포주 모두 최소의 FBS 함량인 3%에서의 증식만으로도 충분함을 보여주었다.
후속연구
이상의 결과는 세포 증식이나 바이러스의 증식 시 목적에 따라 적절한 FBS 농도에서 세포 및 바이러스의 증식이 필요함을 제시하여 주는 결과로써 세포를 증식함에 있어 단순히 계대배양간을 목적으로 하는 경우에는 생존율에 중점을 두고 최소의 FBS 농도로 최대한 천천히 계대배양을 함으로써, 비용 및 시간적인 측면에서 매우 경제적으로 세포를 유지할 수 있을 것으로 기대된다. 그러한 측면에서 본 연구의 결과 제시된 Sf21의 경우에는 80% 이상 생존율을 보이는 7% FBS 농도에서 그리고 Bm5 세포의 경우에는 5% FBS 농도에서 계대배양함이 좋을 것으로 여겨졌다.
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