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문제 정의
- 따라서 산림 토양으로부터 분리한 방선균의 역병균과 탄저병에 대한 길항력과 고추의 초기 생육에 미치는 영향 등을 조사하여 농업적 활용을 위한 기초자료를 얻고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 크추는 2007년 2월 1일에 최아시킨 고추(품종: 한여름)를 파종하여 실시하였다. 2007년 04월 06일까지 66일간 재배 후 총 신장과 엽수를 조사하였다. 대조구는 증류수와 균주 배양용 배지를 사용하였다.
- 고추 역병 및 탄저병균에 대한 항균활성은 Potato dextrose ager(Becton Dickinson Microbiology System, Sparks, USA) 배지에 분리균을 접종하여 2WC에서 7일간 정치 배양하고 chloroform으로 1시간 훈증 처리 후 병원균을 접종하였다. 병원균이 접종된 plate는 역병균과 탄저병 균을 각각 251와 281에서 5일간 배양한 후 항균 활성과 현미경을 통한 병원균 균사의 변형 여부를 확인하였다.
- 단독으로 계대배양하였다. 고추열매를 이용한 항균활성은 분리 미생물을 YMB(Yeast extract 3.0 g, Malt extract 3.0 g, Peptone 5.0 g, Dextrose 10.0 g, dH2O 1Z)을이용하여 281에서 7일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 대상 병원균의 포자를 수확하여 농도를 IO' spores/으로 조절한 후 선발 미생물 배양액과 1:1로 혼합하였고, 병원균의 농도는 5X 104spores/㎕, 선발 미생물의 농도는 5X 106cfu/m/되도록 조절하여 접종원으로 사용하였다.
- 0 g, dH2O 1Z)을이용하여 281에서 7일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 대상 병원균의 포자를 수확하여 농도를 IO' spores/으로 조절한 후 선발 미생물 배양액과 1:1로 혼합하였고, 병원균의 농도는 5X 104spores/㎕, 선발 미생물의 농도는 5X 106cfu/m/되도록 조절하여 접종원으로 사용하였다. 준비된 접종원 50 ㎕를 멸균한 paper disk에 접종하여 cork borer로 상처 낸 열매에 접종하고 습도가 유지되도록 처리된 20cmX25cmX5cm 크기의 플라스틱 box에 옮겨 25℃ 와 28℃에서 7일간 배양한 후 병원균에 의한 감염율과병반의 크기를 측정하였다.
- 5%가 되도록 첨가하여 제조한 검정용 배지의 중앙에 분리 균주를 접종하고 28℃에서 7일간 배양한 후 균총 주변의 투명대형 성 여부로 검정하였다. 또한 PDB 배지 50mZ에 인광석(총 인산 : 30.9%) 0.5%를 첨가하여 28℃에서 진탕배양기(190~200 rpm)로 6일간 배양하면서 24시간 간격으로 배양 상징액을 취하여 유리인산의 농도를 바나도몰리브덴산법으로 비색정량하여 인산가용화 활성을 최종 검정하였다(Lee, 2001).
- 접종하였다. 병원균이 접종된 plate는 역병균과 탄저병 균을 각각 251와 281에서 5일간 배양한 후 항균 활성과 현미경을 통한 병원균 균사의 변형 여부를 확인하였다.
- 비경작 산림 토양으로부터 고추 역병균과 탄저병균에대한 항균활성, 불용태 인산의 가용화 및 식물체 초기생육 촉진 효과를 보이는 방선균을 분리하였다. 선발된 미생물의 16S rDNA 염시서열을 분석한 결과, Streptomyces sp.
- 분석을 통하여 수행하였다. 선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGIAA TACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3) primer 를 사용하여 94℃에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization 시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 결과물을 0.
- 선발 미생물의 식물생육촉진 효과는 YMB를 이용하여 28℃, 150rpm/min 및 pH 6.8의 조건으로 7일간 배양 한 균체를 포함한 배양액의 원액과 10배 희석액을 7일 간격으로 3회 엽면살포하여 검정하였다. 크추는 2007년 2월 1일에 최아시킨 고추(품종: 한여름)를 파종하여 실시하였다.
- 인산가용화 능력은 PDA를 기본 배지로 하여 CaCb와 K2HPO4의 최종농도를 0.5%가 되도록 첨가하여 제조한 검정용 배지의 중앙에 분리 균주를 접종하고 28℃에서 7일간 배양한 후 균총 주변의 투명대형 성 여부로 검정하였다. 또한 PDB 배지 50mZ에 인광석(총 인산 : 30.
- 대상 병원균의 포자를 수확하여 농도를 IO' spores/으로 조절한 후 선발 미생물 배양액과 1:1로 혼합하였고, 병원균의 농도는 5X 104spores/㎕, 선발 미생물의 농도는 5X 106cfu/m/되도록 조절하여 접종원으로 사용하였다. 준비된 접종원 50 ㎕를 멸균한 paper disk에 접종하여 cork borer로 상처 낸 열매에 접종하고 습도가 유지되도록 처리된 20cmX25cmX5cm 크기의 플라스틱 box에 옮겨 25℃ 와 28℃에서 7일간 배양한 후 병원균에 의한 감염율과병반의 크기를 측정하였다.
- 선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGIAA TACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3) primer 를 사용하여 94℃에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization 시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 결과물을 0.8% agarose gel electrophoresis를 수행한 후 분리 정제하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer# 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 RDP(RNA database project)를 활용하여 분석하였다.
- 최종 선발된 미생물 동정은 16S rDNA의 염기서열 분석을 통하여 수행하였다. 선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGIAA TACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3) primer 를 사용하여 94℃에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization 시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다.
- 휘발성 물질에 의한 항균활성은 분리균과 역병 원균을 양분된 plate에 7일간 동시 배양 후 병원균의 균총(Q mm) 을 새로운 배지에 치상하여 각각 25℃와 28℃에서 5일간 배양 후 균총의 직경을 측정하여 조사하였으며, 대조 구는 병원균을 단독으로 계대배양하였다. 고추열매를 이용한 항균활성은 분리 미생물을 YMB(Yeast extract 3.
대상 데이터
- 이에 따라 선발된 균주는 Streptomyces sp. MG 121로 명명하였다.
- Changes in soluble phosphate concentration during the cultivation of Streptomyces sp. MG121 (●: Control, O: MG 121).
- 2007년 04월 06일까지 66일간 재배 후 총 신장과 엽수를 조사하였다. 대조구는 증류수와 균주 배양용 배지를 사용하였다. 토양은 일반 밭 토양과 피트모스를 1:1 비율로 혼합하여 2회 멸균 후 사용하였다.
- 문경 주흘산의 산림 토양 10개 시료로부터 총 400여 균주를 분리하였다. 분리 미생물 중 MG 121을 고추역병균과 탄저병균에 대한 항균 활성에 기초하여 최종 선발하였다(Fig.
- 미생물은 시료를 6UC에서 3시간 건조 후 살균수로 3단 희석한 후 200 B를 취하여 방선균 분리용 배지(Difbo™ Actinomycete Isolation Agar)에 도말하고 28P의 배양기에 배양하면서 전형적인 방선균의 균총을 형성하는 균을 분리하여 4℃의 냉장고에 보관하며 사용하였다. 병원균은 이병식물체로부터 직접 분리하여 실험에 사용하였다.
- 시료로부터 총 400여 균주를 분리하였다. 분리 미생물 중 MG 121을 고추역병균과 탄저병균에 대한 항균 활성에 기초하여 최종 선발하였다(Fig. 1A-G). 대치 배양에 의한 고추역병에 대한 항균활성은 접종원을 중심으로 MG 121 균주 방향으로 생육이 이루어지 않아 강한 것으로 나타났으며, 탄저병에 대한 항균 활성 또한 대조구와 비교하여 높은 것으로 나타났다(Fig.
- 유용 미생물을 분리하기 위한 시료는 작물의 재배과정 중에 투여되는 미생물을 배제하기 위하여 문경 주흘산 일원의 비경작 산림 토양을 채집하여 사용하였다. 미생물은 시료를 6UC에서 3시간 건조 후 살균수로 3단 희석한 후 200 B를 취하여 방선균 분리용 배지(Difbo™ Actinomycete Isolation Agar)에 도말하고 28P의 배양기에 배양하면서 전형적인 방선균의 균총을 형성하는 균을 분리하여 4℃의 냉장고에 보관하며 사용하였다.
- 8의 조건으로 7일간 배양 한 균체를 포함한 배양액의 원액과 10배 희석액을 7일 간격으로 3회 엽면살포하여 검정하였다. 크추는 2007년 2월 1일에 최아시킨 고추(품종: 한여름)를 파종하여 실시하였다. 2007년 04월 06일까지 66일간 재배 후 총 신장과 엽수를 조사하였다.
데이터처리
- 8% agarose gel electrophoresis를 수행한 후 분리 정제하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer# 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 RDP(RNA database project)를 활용하여 분석하였다.
이론/모형
- 토양은 일반 밭 토양과 피트모스를 1:1 비율로 혼합하여 2회 멸균 후 사용하였다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 하였다.
성능/효과
- 3469와 99%의 상동성을 보였으며 Streptomyces griseus 와는 98%의 상동성을 보였다(Fig. 3). 이에 따라 선발된 균주는 Streptomyces sp.
- 이러한 항균활성은 acetic acid 등의 약산성 휘발성 물질에 의한 세포질의 산성화에 따른 것으로 추측된다(Kim 등, 2007). 고추 열매를 이용한 역병 및 탄저병 억제효과를 검정한 결과, 병원균 단독처리구의 경우 접종된 모든 과일에서 병반이 형성되었으나, 병원균과 선발된 MG 121 균주를 혼합 처리한 경우 상처부위에 국부적인 병반만이 형성되었다(Fig. 1H~K, Table 1).
- 1A-G). 대치 배양에 의한 고추역병에 대한 항균활성은 접종원을 중심으로 MG 121 균주 방향으로 생육이 이루어지 않아 강한 것으로 나타났으며, 탄저병에 대한 항균 활성 또한 대조구와 비교하여 높은 것으로 나타났다(Fig. 1C&D). 또한 MG 121 균주와 인접한 병원균의 균사는 팽윤현상이 초래되어 정상적인 생육이 이루어지지 않은 것으로 나타났다(Fig.
- 1C&D). 또한 MG 121 균주와 인접한 병원균의 균사는 팽윤현상이 초래되어 정상적인 생육이 이루어지지 않은 것으로 나타났다(Fig. IE). 이러한 균사 팽윤 현상은 탄저병균보다 역병균에서 뚜렷하게 나타났다.
- 4% 정도 큰 것으로 나타났다. 배양여액의 10배 희석액 처리로 두 대조구에 비해 9% 이상 증가한 것으로 나타났다. 엽수의 경우 대조구에 비해 배양 원액의 경우 10.
- 분리한 400여 균주 중 1차 불 용태 인산의 가용화 활성을 검정한 결과, MG 121균주를 포함한 3균주가 가용화 활성을 보였다, 인광석(총 인산 :30.9%) 0.5%를 첨가한 PDB 배지에 선발 균주를 접종한 후 배양시간에 따른 유리인산의 농도로 불용태 인산의 가용화 활성을 측정한 결과, 24시간 후 유리인산의 농도는 215 pg/m/이 었으며 48시간 후의 농도는 616 ㎍/ml이 었다. 배지 내 유리인산의 농도는 배양초기인 48시간 후까지 급격히 증가하였으나, 72시간 후 완만히 증가하여 144 시간 후에는 762 ㎍/ml까지 증가하였다(Fig.
- 선발된 MG121 균주의 배양 원액과 10배 희석의 엽면살포에 의한 고추 유묘 생육에 미치는 효과를 검정한 결과(Table 2), 대조구와 배양 배지 처리 구의 초장은 각각 16.08 cm와 16.32 cm로 조사되었다. 배 양 원액 처리구의 경우 18.
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