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문제 정의
- 본 연구의 목적은 수세기에 걸쳐 발기부전(impotence), 정액루 (spermatorrhea), 유뇨증(enuresis), 천식 (asthma) 및 알레르기 관련질병의 치료제로 사용되고 있는 토종 복분자(#)와 외래종 복분자(R occidma/is)의 항염증활성을 비교, 분석해 보고자 했다. 그 결과 토종 복분자의 에탄을 추출물이 외래종 복분자의 에탄올 추출물에 비교해 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 현저히 억제시키는 것을 관찰할 수 있었으며, NO와 PGE 생합성 효소인 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 또한 억제시킴을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 4 pun로 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였다. HPLC는 Agilent 1100 system(Palo Alto, CA, US A) 을 사용하였으며, EcHpse XDB-C18 column(4.6 X 250 mm, 5 jim, Agilent)을 사용, 유속은 1 mL/min로 유지 하였고, water : methanol: acetate = 5:2: 93(A, v/v/v)와 8:2: 90(B, v/v/v)을 이동상으로 하여 4/14/25/37 min, 5/ 35/60/100% B gradient로 분석하였으며, 검출은 자외선 파장 254 nm에서 이 루어 졌 다.
- 각 복분자 추출물을 400ug/ml과 LPS 1 ug/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 18시간 배양하였다. PGE0 측정은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 병리학적 반응이 일어나게 된다(13-17, 19, 20). RAW264.7 세포에 LPS(1 ng/mL) 단독처리 혹은 LPS와 각 복분자 추출물을 50, 100, 200, 400|ig/mL의 농도로 동시에 처리한 후, 각 복분자 추출물에 의한 NO 생성억제효과를 확인하였다. LPS에 의한 NO 생성 저해 효과는 토종과 외래종 복분자의 미성숙 및 중간성숙추출물에서 확인할 수 있었다(Fig.
- URCE, UROE, HRCE, HROE, RCE 및 ROE의 세포독성 여부를 확인하였다. 각 복분자 추출물을 50, 100, 200, 400μg/mL의 농도로 마우스 macrophage 세포주인 RAW264.
- 그 후, iNOS와 COX-2의 specific antibodies를 이용하여 4>C에서 밤새 반응시켰다. iNOS와 COX-2 발현 양은 horseradish peroxi- dase(HRP)가 붙어있는 secondary antibodies로 실온에서 2시간 반응 후 chemiluminescence reagents(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 확인하였다.
- 이에, 본 실험에서는 토종 복분자(R coreanus) 추출물과 외래종 복분자(R. occidentalism 추출물의 항염증효과 차이를 비교하였다.
- 7 세포를 24-well plate에 5X lO'/well이 되도록 분주하고 12시간 배양하였다. 각 복분자 추출물을 0, 50 100, 200 또는 400 μg/mL과 Lipopolysaccharidee(LPS) 1 ug/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 18시간 배양하였다. Nitrite양의 측정은 Griess reagent system(Promega)을 이용하여 측정하였다.
- 7 세포를 96-well plate에 2Xl(y/well이 되도록 분주하고 12시간 배양하였다. 각 복분자 추출물을 0, 50, 100, 200 또는 400jig/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포독성을 측정하였다.
- 다음으로, 염증반응의 또 다른 체내 매개물질 중 하나인 PGE2 생성에 대한 각 복분자 추출물의 효과를 검토하였다. 고농도(400 pg/mL)의 각 복분자 추출물을 LPS와 함께 RAW264.
- 각 복분자 추출물을 #과 LPS 1 # 농도로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 상층액을 이용하여 IW-a와 IL-6를 ELISA kit로 측정하였다.
- URCE, HRCE, UROE, HORE 모두에서 농도 의존적인 NO 생성억제효과가 확인되었으나, 토종 복분자 추출물인 URCE와 HRCE가 외래종 복분자 추출물에 비해 유의적인 NO 생성 저해 효과를 나타내었다. 성숙 복분자 추출물은 토종 복분자와 외래종 복분자 모두에서 LPS에 의한 NO 생성억제효과를 관찰할 수 없어, 이후 실험에서는 RCE 와 ROE를 제외하고 진행 하였다. 위의 실험결과 토종 복분자의 경우 외래종 복분자와 달리 저농도(50, 100ug/mL)에서도 유의성 있는(?<0.
- occidentalism ROE) 이다. 추출방법은, 각 복분자 50 g에 95% 에탄올을 1L를 가하여 환류 추출 하였고, 이 과정을 3희 반복하고 얻은 추출물을 감압 농축하고, 마지막 남은 잔사를 물로 치환하여 동결건조하였다. 각 추출물의 수득률은 URCE 13.
- 토종 복분자와 외래종 복분자의 성숙도에 따른 ellagic acid 함량을 비교해 보았다(Table 1). Table 1에 나타나 있듯이 토종 복분자의 에탄올추출물에서 URCE가 g당 4.
대상 데이터
- Dul- becco's Modified Eagle's Medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin 그리고 streptomycine Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. CellTiter 96® AQueous One Solution과 Griess reagent systeme Promega사(Madison, WI, USA)에서 구입하였고, PGE, enzyme-linked immunosorbent assayfELISA) kit는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였다. Tumor necrosis factor-a(TNF-a)와 interleukin-6(IL-6) ELISA kit는 eBioscience사 (San Diego, CA, USA), cell extraction buffer Biosource Inter- national사(Camarillo, CA, USA), 그리고 iNOS와 COX-2 항체는 BD Biosciences사(San Jose, CA, USA)로부터 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입을 하였다. Dul- becco's Modified Eagle's Medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin 그리고 streptomycine Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. CellTiter 96® AQueous One Solution과 Griess reagent systeme Promega사(Madison, WI, USA)에서 구입하였고, PGE, enzyme-linked immunosorbent assayfELISA) kit는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였다.
- Lipopolysaccharide(LPS), ellagic acid를 포함한 모든 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입을 하였다. Dul- becco's Modified Eagle's Medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin 그리고 streptomycine Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다.
- RAW264.7 murine macrophages는 한국세포주은행 (Seoul, Korea) 으로부터 구입하였고, 세포배양은 DMEM에 10% FBS, 100U/mL penicillin, 그리고 100 (ig/rnL streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며, 배양기를 이용하여 371와 5% CO2를 유지하였다.
- CellTiter 96® AQueous One Solution과 Griess reagent systeme Promega사(Madison, WI, USA)에서 구입하였고, PGE, enzyme-linked immunosorbent assayfELISA) kit는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였다. Tumor necrosis factor-a(TNF-a)와 interleukin-6(IL-6) ELISA kit는 eBioscience사 (San Diego, CA, USA), cell extraction buffer Biosource Inter- national사(Camarillo, CA, USA), 그리고 iNOS와 COX-2 항체는 BD Biosciences사(San Jose, CA, USA)로부터 구입하였다.
- 토종 복분자(R coreamis)와 외래종 복분자(R occidentalism 강원도 횡성에 소재한 농장에서 구입하여 사용하였다. 식물의 동정은 서울대학교의 지형준 명예교수로부터 도움을 받았다. 에탄올을 이용하여 추출물을 만들었으며, 본 연구에 사용된 추출물은토종 미성숙 복분자(unripe fruits of R.
- 식물의 동정은 서울대학교의 지형준 명예교수로부터 도움을 받았다. 에탄올을 이용하여 추출물을 만들었으며, 본 연구에 사용된 추출물은토종 미성숙 복분자(unripe fruits of R. coreanus, URCE), 토종 중간성숙 복분자(halRripened fruits of R. coreanus, HRCE), 토종성숙 복분자(ripened fruits of R. coreanus, RCE), 외래종 미성숙 복분자(unripe fruits of R. occidentalis, UROE), 외래종 중간성숙 복분자(haBripened of R. occidentalism HROE) 그리고 외래종 성숙 복분자(ripened fnjits of R. occidentalism ROE) 이다. 추출방법은, 각 복분자 50 g에 95% 에탄올을 1L를 가하여 환류 추출 하였고, 이 과정을 3희 반복하고 얻은 추출물을 감압 농축하고, 마지막 남은 잔사를 물로 치환하여 동결건조하였다.
- 토종 복분자(R coreamis)와 외래종 복분자(R occidentalism 강원도 횡성에 소재한 농장에서 구입하여 사용하였다. 식물의 동정은 서울대학교의 지형준 명예교수로부터 도움을 받았다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 3회 이상 실험을 반복하여 얻은 자료를 GraphPad Prism 4.0 software(GraphPad software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 각 시료 간의 통계적 유의성은 Duncan's multiple range tests로 검증하였다. p<0.
이론/모형
- Cells were treated with 0, 50, 100, 200, or 400 μg/mL of various extracts for 24 hr. Cell viability was determined using the CellTiter 96* AQUCOUS One Solution Assay. The results are expressed as mean ± SEM from four independent experiments.
- 각 복분자 추출물을 0, 50 100, 200 또는 400 μg/mL과 Lipopolysaccharidee(LPS) 1 ug/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 18시간 배양하였다. Nitrite양의 측정은 Griess reagent system(Promega)을 이용하여 측정하였다.
- 각 복분자 추출물의 세포 독성여부 확인은 CellTiter 96* AQueous One Solution Assay를 이용하여 측정하였다. RAW264.
- 특히 초기 염증반응에 깊이 관여하고 있다. 각 복분자 추출물이 염증성 cytokine의 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위해, RAW264.7 세포에 LPS(1 jig/mL) 단독처리 혹은 LPS와 각 복분자 추출물을 400gg/mL의 농도로 24시간 처리 후, 배지로 분비된 TNF-a와 IL-6의 농도를 ELISA방법으로 측정하였다. URCE와 UROE의 LPS에 의한 TNF-a의 생성억제율은 각각 57.
- 염증반응 매개물질인 NO와 PGE/는 각각 NOS와 COX라는 효소에 의해 생합성 된다. 위에서 관찰된 복분자 추출물에 의한 NO 와 PGE:, 의 생성억제효과가 이들을 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현억제에 기인하는가의 여부를 이들 단백질에 대한western blot 방법으로 조사하였다. RAW264.
성능/효과
- 그 결과 토종 복분자의 에탄을 추출물이 외래종 복분자의 에탄올 추출물에 비교해 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 현저히 억제시키는 것을 관찰할 수 있었으며, NO와 PGE 생합성 효소인 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 또한 억제시킴을 확인할 수 있었다. LPS 유도에 의한 TNF-a와 1L-6의 생성억제 효과도 토종 복분자 에탄올 추출물이 외래종 복분자 추출물에 비해 탁월함이 관찰 되었다. 이러한 연구결과로 볼 때 토종 복분자 에탄올 추출물이 macrophage에 의해 생성되는 염증반응의 매개물질인 NO, PGE, , 염증성 cytokine 등의 생성을 억제함으로 염증반응을 완화시켜 줄 것으로 판단된다.
- 7 세포에 LPS(1 ng/mL) 단독처리 혹은 LPS와 각 복분자 추출물을 50, 100, 200, 400|ig/mL의 농도로 동시에 처리한 후, 각 복분자 추출물에 의한 NO 생성억제효과를 확인하였다. LPS에 의한 NO 생성 저해 효과는 토종과 외래종 복분자의 미성숙 및 중간성숙추출물에서 확인할 수 있었다(Fig. 2). URCE, HRCE, UROE, HORE 모두에서 농도 의존적인 NO 생성억제효과가 확인되었으나, 토종 복분자 추출물인 URCE와 HRCE가 외래종 복분자 추출물에 비해 유의적인 NO 생성 저해 효과를 나타내었다.
- 비교해 보았다(Table 1). Table 1에 나타나 있듯이 토종 복분자의 에탄올추출물에서 URCE가 g당 4.09 mg의 함량을 보였으며, HRCE는 g당 1.18 mg, RCE g당 0.63 mg으로 성숙도에 따라 그 함량이 감소함을 보였다. 외래종 복분자의 경우에는 UROE가 g당 1.
- 2). URCE, HRCE, UROE, HORE 모두에서 농도 의존적인 NO 생성억제효과가 확인되었으나, 토종 복분자 추출물인 URCE와 HRCE가 외래종 복분자 추출물에 비해 유의적인 NO 생성 저해 효과를 나타내었다. 성숙 복분자 추출물은 토종 복분자와 외래종 복분자 모두에서 LPS에 의한 NO 생성억제효과를 관찰할 수 없어, 이후 실험에서는 RCE 와 ROE를 제외하고 진행 하였다.
- 7 세포에 LPS(1 jig/mL) 단독처리 혹은 LPS와 각 복분자 추출물을 400gg/mL의 농도로 24시간 처리 후, 배지로 분비된 TNF-a와 IL-6의 농도를 ELISA방법으로 측정하였다. URCE와 UROE의 LPS에 의한 TNF-a의 생성억제율은 각각 57.3%, 37.4% 로 토종 복분자 추출물이 우위였으나3 <0.001), HRCE(28.1%)와 HROE(32.15%)간의 차이는 확인할 수 없었다(Fig. 5A). 각 복분자 추출물에 의한 IL-6의 생성억제효과도 TNF-a와 유사하여 URCE(65.
- 5A). 각 복분자 추출물에 의한 IL-6의 생성억제효과도 TNF-a와 유사하여 URCE(65.6%)가 UROE(35.7%)에 비해 IL-6의 생성억제효과가 유의적으로 탁월하였다(Fig. 5B).
- 확인하였다. 각 복분자 추출물을 50, 100, 200, 400μg/mL의 농도로 마우스 macrophage 세포주인 RAW264.7 세포에 24시간 처리 후 세포독성 여부를 확인하였으나 각 복분자 추출물의 세포독성은 400ug/mL의 고농도에서도 관찰되지 않았다(Fig. 1).
- 추출방법은, 각 복분자 50 g에 95% 에탄올을 1L를 가하여 환류 추출 하였고, 이 과정을 3희 반복하고 얻은 추출물을 감압 농축하고, 마지막 남은 잔사를 물로 치환하여 동결건조하였다. 각 추출물의 수득률은 URCE 13.98%, I-TRCE 37.72%, RCE 42.92%, UROE 16.76%, HROE 25.38% 그리고 ROE 41.86%이었다.
- 고농도(400 pg/mL)의 각 복분자 추출물을 LPS와 함께 RAW264.7 세포에 처리 후, 배지중의 PGEe의 농도를 측정한 결과 URCE, UROE, HRCE, HROE 모두에서 유의적인 PGEj 생성억제효과를 관찰할 수 있었으며, 토종 복분자와 외래종 복분자의 pge2 생성억제효 과에 대한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 3).
- 7 세포에 LPS(1 pig/ mL) 단독처리 또는 LPS와 각 복분자 추출물을 400jig/mL의 농도로 동시에 처리한 후 18시간 동안 배양하였다. 그 결과 LPS 처리에 의해 증가된 iNOS 단백질의 발현을 각 복분자 추출물(URCE 80.1%, UROE 75.6%, HRCE 57.3%, HROE 25.3%)이억제시키는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 토종 복분자가 외래종 복분자에 비해 iNOS 단백질 발현억제효과가 탁월함을 알 수 있었으며, iNOS의 발현억제가 NO의 생성억제를 유도함을 확인할 수 있었다(Fig.
- 그 결과 토종 복분자의 에탄을 추출물이 외래종 복분자의 에탄올 추출물에 비교해 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 현저히 억제시키는 것을 관찰할 수 있었으며, NO와 PGE 생합성 효소인 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 또한 억제시킴을 확인할 수 있었다. LPS 유도에 의한 TNF-a와 1L-6의 생성억제 효과도 토종 복분자 에탄올 추출물이 외래종 복분자 추출물에 비해 탁월함이 관찰 되었다.
- 본 실험을 통해 복분자 추출물이 염증반응을 매개하는 다양한 인자(NO, PGE, , 염증성 cytokine)의 생성을 억제하는 효과가 있으며, 이러한 항염증효과는 복분자의 성숙도에 따라 복분자에 함유되어 있는 ellagic acid를 포함한 2차 대사산물의 함량에 기인하는 것으로 판단되며, 토종 복분자가 외래종 복분자에 비해 항염증 효과가 월등함을 확인하였다.
- 본 연구진에 의한 연구결과 미성숙한 복분자 추출물이 성숙한 복분자 추출물에 비해 탁월한 항염증효과를 보였으며, 물 추출물보다는 에탄올 추출물에서 뛰어난 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다(22). 이에, 본 실험에서는 토종 복분자(R coreanus) 추출물과 외래종 복분자(R.
- 4A). 염증반응을 직접 유발하는 효소 단백질인 COX-2 단백질 발현 양의 변화도 iNOS 실험과 동일하게, LPS 처리에 의해 증가된 단백질을 각 복분자 추출물(URCE 49.8%, UROE 28.4%, HRCE 32.3%, HROE 26.6%)이 감소시키는 결과를 얻었으며, 토종 복분자가 외래종 복분자에 비해 LPS에 의해 유도된 COX-2 단백질 발현 양의 감소효과가 우위임을 확인하였다(Fig. 4B). 이상의 결과들을 종합하여 보면, 토종 복분자 추출물이 LPS에 의한 염증반응 유발 시, iNOS와 COX-2 단백질 발현 양을 감소시켜 NO 및 PGE: 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타내며, 이러한 항염증활성은 외래종 복분자에 비해 토종 복분자가 탁월한 것으로 판단되었다.
- 63 mg으로 성숙도에 따라 그 함량이 감소함을 보였다. 외래종 복분자의 경우에는 UROE가 g당 1.68mg이었으며, HROE는 g당 1.81 mg으로 대동소이한 차이를 나타냈으나, 완전 성숙된 ROE과 같은 경우는 g당 0.52 mg으로 가장 낮은 함량을 나타내었다. Rubus종의 주 유효성분인 ellagic acid의 함량이 토종 및 외래종의 복분자의 성숙도에 따라 크게 감소 하는 것으로 나타났으나, ellagic acid 이외의 성숙도에 따른 주 유효성분의 함량 변화는 향후 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 성숙 복분자 추출물은 토종 복분자와 외래종 복분자 모두에서 LPS에 의한 NO 생성억제효과를 관찰할 수 없어, 이후 실험에서는 RCE 와 ROE를 제외하고 진행 하였다. 위의 실험결과 토종 복분자의 경우 외래종 복분자와 달리 저농도(50, 100ug/mL)에서도 유의성 있는(?<0.05) NO 생성억제효과를 보여 외래종 복분자보다 항염증 효과가 뛰어난 것으로 추측할 수 있다.
- 3%)이억제시키는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 토종 복분자가 외래종 복분자에 비해 iNOS 단백질 발현억제효과가 탁월함을 알 수 있었으며, iNOS의 발현억제가 NO의 생성억제를 유도함을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 염증반응을 직접 유발하는 효소 단백질인 COX-2 단백질 발현 양의 변화도 iNOS 실험과 동일하게, LPS 처리에 의해 증가된 단백질을 각 복분자 추출물(URCE 49.
- LPS 유도에 의한 TNF-a와 1L-6의 생성억제 효과도 토종 복분자 에탄올 추출물이 외래종 복분자 추출물에 비해 탁월함이 관찰 되었다. 이러한 연구결과로 볼 때 토종 복분자 에탄올 추출물이 macrophage에 의해 생성되는 염증반응의 매개물질인 NO, PGE, , 염증성 cytokine 등의 생성을 억제함으로 염증반응을 완화시켜 줄 것으로 판단된다. 차후 항염증활성을 갖는 복분자 추출물의 성분을 동정하는 연구가 더욱더 필요할 것으로 사료되며, 토종 복분자가 천연 항염증활성을 갖는 제품 개발에 있어 유용한 식물자원 원료로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 4B). 이상의 결과들을 종합하여 보면, 토종 복분자 추출물이 LPS에 의한 염증반응 유발 시, iNOS와 COX-2 단백질 발현 양을 감소시켜 NO 및 PGE: 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타내며, 이러한 항염증활성은 외래종 복분자에 비해 토종 복분자가 탁월한 것으로 판단되었다.
후속연구
- 52 mg으로 가장 낮은 함량을 나타내었다. Rubus종의 주 유효성분인 ellagic acid의 함량이 토종 및 외래종의 복분자의 성숙도에 따라 크게 감소 하는 것으로 나타났으나, ellagic acid 이외의 성숙도에 따른 주 유효성분의 함량 변화는 향후 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 이러한 연구결과로 볼 때 토종 복분자 에탄올 추출물이 macrophage에 의해 생성되는 염증반응의 매개물질인 NO, PGE, , 염증성 cytokine 등의 생성을 억제함으로 염증반응을 완화시켜 줄 것으로 판단된다. 차후 항염증활성을 갖는 복분자 추출물의 성분을 동정하는 연구가 더욱더 필요할 것으로 사료되며, 토종 복분자가 천연 항염증활성을 갖는 제품 개발에 있어 유용한 식물자원 원료로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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