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문제 정의
- 魚腥草가 자궁근종 세포의 증식억제와 세포자멸사에 미치는 영향을 알아보기 위하여 魚腥草를 100, 200. 300 飓/mi의 농도로 처리한 후 증식억제 효과, 세포자멸사와 관련한 세포주기 분석 및 유전자 분석을 시도한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 魚腥草를 처리한 후 세포주에서 세포자멸사에 관계하는 유전자의 발현을 보고자 시행하였다. 분쇄한 세포에서 Lysis Buffer (lOmmol Tris-Cl (pH 7.
- 이에 저자는 魚腥草가 자궁근종과 정상 자궁근세포에 대한 효과를 알아보고 임상에 유용한지를 알아보고자 이 연구를 계획하였으며 유의한 결과를 얻었으므로 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0), 130 mmol NaCl. 1% TritonX-100), 0.2M phenyl-methyl-s ulfonyl fluoride, proteinase inhibitor cock tail을 넣고 얼음에 30분간 둔 후 원심분리하여 상층액을 취하고 Biorad protein assay kit (Bio-Rad Laboratories Inc., U SA)를 이용하여 단백질을 추출한 후 분광광도계 (Du① 650, Beckman Coulter I nc., USA)의 595nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. 얻어진 단백질 분획을 전기영동하고 Nitrocellulose p aper (Immobilon, Milipore Co.
- 각 well 당 One Solution Reagent를 20贝 넣고 37C, 5% CO? incubator에 배양한 후 1-4시간 사이. 1시간 간격으로 MTS 측정하였다. 9 6 well plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 魚腥草를 100, 200. 300 飓/mi의 농도로 처리한 후 증식억제 효과, 세포자멸사와 관련한 세포주기 분석 및 유전자 분석을 시도한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- lOOOrpm 으로 3분간 원심분리하고 상층액 제거하고 PBS 수세한 후. Trisodium citrate (S igma, USA) 0.1%, IGEPAL-Ca-630 (Si gma. USA) 0.1 %가 함유된 용액에 RN ase A 5mg/®l, propidium iodide (Sigm a. USA) 용액을 첨가하여 암실에서 1 시간 동안 4笆에서 염색하였다. 유세포 분석기를 이용하여 DNA 함량에 따른 hist ogram을 측정하였다.
- 모아진 세포를 10% fetal bo vine serum °1 든 Dulbecco's modified ea gle's medium/Nutrient mixture F-12 ha m 배양액에서 부유시킨 후 37℃, 5% C 。2 배양기에서 배양하고, 24-48시간 후배양액을 교환하였다. 배양된 세포는 sm ooth muscle actin에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 양성 및 음성 결과에 따라 근육 세포인지를 확인하였다.
- 1 X TBS-T 용액으로 nitrocellulose 막을 1 0분간 3번 세척하여 비 특이적으로 결합해 있는 항체를 제거하였다. 세척 후 막에 남아있는 TBS-T를 제거하고 ECL West ern Blotting Detection Reagent (Amersh am Bioscience, USA)로 검출하였다.
- 9 6 well plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 대조군의 흡광도를 100으로 환산하였을 때의 각 농도별 약물 처리군의 흡광도를 상대적으로 비교하여 나타내었다.
- , USA)의 595nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. 얻어진 단백질 분획을 전기영동하고 Nitrocellulose p aper (Immobilon, Milipore Co., USA) 로전기이동 (electrotransfer)을 시행하였다. 전기 이동된 막을 blocking용액 (5% ski m dry milk in PBS-T buffer)에 넣어 co Id chamber 내에서 12시간 shaking 하였다.
- USA) 용액을 첨가하여 암실에서 1 시간 동안 4笆에서 염색하였다. 유세포 분석기를 이용하여 DNA 함량에 따른 hist ogram을 측정하였다.
대상 데이터
- 이것으로 보아 魚腥草가 자궁근종 세포에 선택적으로 증식을 차단하며, 자궁근 세포에서는 300 如/ml의 농도에서는 약물의 독성으로 인한 증식 억제를 보인다 하겠다. 시간별 투여로 적절한 시간은 24시간 이후가 가장 적절한 것으로 나타나 이후의 실험은 자궁근종 세포에서의 24시간 魚 腥草 투여를 실험 대상으로 하였다.
- 실험에 사용한 魚腥草는 대구한의대학교 부속한방병원 약제과에서 구입하여사용하였다. 魚腥草 50g에 증류수 2000CC 를 첨가하여 2시간 동안 가열하여 탕제 500 ml를 주줄하였다.
- 자궁조직은 계명대학교 동산의료원 산부인과학 교실에서 자궁근종으로 수술받은 5예의 환자에서 수술시 신선한 자궁 근종과 자궁 근 조직을 채취하여 실험 시까지 -78 ℃에서 냉동 보관하여 사용하였다. 조직의 채취는 환자의 동의와 윤리 위원회에 통과한 지침서에 준해서 시행하였다.
데이터처리
- 통계의 처리는 대조군과 실험군 사이의 유의성을 student-t 방법을 이용하여 검정하였으며, 최소 3번의 실험을 하여 mean ± SD로 나타내었고, p<0.05 일 때 유의성이 있다고 나타내었다.
성능/효과
- 1. 魚腥草 처리 후 자궁근종 세포에서는 자궁근종 세포에서는 24시간 후부터 농도 의존적으로 유의한 증식억제 효과가 나타났으며 정상 자궁근 세포에서 는 300 妲/ml 의 농도에 서만 유의 한 억제가 나타났다.
- 자궁근종 세포에 魚腥草를 100. 200, 3 00(血//의 농도로 처리하고 24시간 후세포 자멸 사의 관련 유전자의 발현을 측정한 결과, 魚腥草의 처리 농도에 비례하여 Bid와 Fas 유전자의 발현은 증가되었으며, Bcl-2 유전자는 발현이 감소되었다. Fas 유전자의 하부에 영향을 받는 p ro-caspase 8을 측정하여, 비활성 형태의 pro-caspase 8 단백질의 양적 감소가 관찰되었다.
- 200. 3 00 必/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 DNA fragmentation을 분석한 결과, 대조군에 비하여 魚腥草의 농도가 증가할수록 DNA의 분절현상이 증가함을 관찰하였다 (Fig. 3).
- 3. 魚腥草 처리 후 세포자멸사의 특징인 D NA fragmentation이 농도가 증가할수록 더욱 현저하게 관찰되었다.
- 魚腥草를 농도별로 처리한 후 24시간 후 세포주기 분석을 시도한 결과. 300 昭/ml 농도에서 15%의 subGl기의 지연이 확인되었으며 농도가 증가할수록 sub G1의 연장되었다.
- 200. 300 瞄 ml의 농도로 처리한 후 24, 48, 72 시간 지난 후의 세포를 회수하여 생존 세포 수를 측정한 결과, 300 昭/血의 농도에서 자궁근종 세포의 증식억제 효과가 70%의 높은 결과를 나타내었으며 또한 농도가 높아질수록 증식억제 효과가 증가되는것이 관찰되었다 (Fig. 1). 이것으로 보아 魚腥草가 자궁근종 세포에 선택적으로 증식을 차단하며, 자궁근 세포에서는 300 如/ml의 농도에서는 약물의 독성으로 인한 증식 억제를 보인다 하겠다.
- 200. 300 腕/ ml 농도로 처리한 후 24, 48, 72 시간 지난 후의 세포를 회수하여 생존 세포 수를 측정한 결과, 자궁근종세포에서는 24시간 후부터 농도 의존적으로 증식의 억제가 있었으며 100 妲/血에서 p<0.05. 200.
- 4. 魚腥草 처리 후 농도에 비례하여 Fas 와 Bid 유전자의 발현은 증가되었으며, Bcl-2 유전자는 발현이 감소되었다. Fas 유전자의 하부에 영향을 받는 pro-caspase-8을 측정하여, 비활성 형태의 pro-caspase 8 단백질의 양적 감소가 관찰되었다.
- 200, 3 00(血//의 농도로 처리하고 24시간 후세포 자멸 사의 관련 유전자의 발현을 측정한 결과, 魚腥草의 처리 농도에 비례하여 Bid와 Fas 유전자의 발현은 증가되었으며, Bcl-2 유전자는 발현이 감소되었다. Fas 유전자의 하부에 영향을 받는 p ro-caspase 8을 측정하여, 비활성 형태의 pro-caspase 8 단백질의 양적 감소가 관찰되었다. 그러나 Bax 유전자의 변화는 없었다 (Fig.
- 魚腥草에 의한 세포자멸사 유도 효과를 알아보기 위하여 자궁근종 세포에 魚 腥草를 100, 200, 300 飓/而의 농도로 처리하고 24시간 후 DNA fragmentation 분석을 시도한 결과, 대조군에 비하여 魚腥草의 농도가 증가할수록 특징적인 DNA의 분절현상이 증가됨을 관찰 한바 魚腥草에 의한 증식억제 효과는 세포자멸사에 의한 것임을 확인하였다 (Fig. 3).
- 특히 세포막에 존재하는 Fas 단백은 caspase-8을 활성화 시켜 Bid의 작용을 활성화 한다고 알려져 있다”I. 그러므로 본 연구자도 pro- caspase-8의 발현이 농도 의존적으로 감소하고 있는 것을 확인하였으며, Fas에의한 유도로 생각되었다 (Fig. 4).
- 본 실험에서 세포자멸사 관련 유전자의 발현을 검색한 결과, 魚腥草의 처리농도에 비례하여 Fas와 Bid 유전자의 발현은 증가되었으며, Bcl-2 유전자는 발현이 감소되었다. 이것은 위에서도 언급했듯이 세포막의 death receptor와 미토콘드리아의 경로가 동시에 유발되어 일어나는 것으로 생각된다.
- 앞의 실험을 통하여 魚腥草가 자궁근종 세 포의 증식 억 제 에 미 치 는 효과를 확인하였으므로 魚腥草가 자궁근종 세포의 세포주기에 미치는 영향을 조사하기 위하여 자궁근종 세포에 魚腥草를 100, 20 0, 300 昭/前의 농도 처리하고 24시간 후유 세포 분석기를 이용하여 세포 주기를 분석한 결과 대조군은 subGl 이 7.06%로 나타났으나, 魚腥草 300 ug/ml 농도에서는 15%의 subGl기의 지연이 확인되어 세포자멸사의 量的 증거를 확인하였고 농도의 증가에 따라 subGl의 연장이 증가됨을 관찰하였다 (Fig. 2).
- 이러한 결과는 魚腥草에 의해서 자궁근종 세포의 증식억제가 일어나며 이러한 현상은 세포자멸사에 의한 것이며 그기전은 Fas, Bid의 발현 증가와 Bcl-2의감소로 인한 세포자멸사가 일어나는 것과 pro-caspase 8의 발현이 감소하는 것으로 보아 종국에는 caspase-8 pathway 를 거쳐 세포자멸사를 유도하는 것으로 사료된다.
- 자궁근종 세포에 魚腥草를 100, 200, 3 00 娼/ml의 농도로 처리하고 24시간 후세포 주기를 분석한 결과, 대조군은 subG 1이 7.06%로 나타났으나 魚腥草 300 昭/ ml 농도에서는 15%의 subGl기의 지연이 확인되어 세포자멸사의 量的 증거를 확인하였고 농도의 증가에 따라 subGl 의 연장이 증가됨을 관찰하였다 (Fig. 2).
- 정상 자궁근세포에서 는 300 娼/ml 의 농도에서만 유의한(p<0.01) 억제가 나타났다 (Fig. 1).
후속연구
- 魚腥草가 세포자멸사를 유발하는 것으로 확인되었으므로 작용 경로에 대해 알아볼 필요가 있었다. 세포자멸사는 다른 정상 세포의 활동과 마찬가지로 신호 전달 체계와 신호 수용체에 의해 조절될 수 있다.
- 魚腥草가 자궁근종세포의 증식억제와 세포자멸사를 유도하는 것이 밝혀짐으로써 향후 자궁근종의 치료에 있어서 응용을 해볼 수 있는 계기가 될 것으로 사료되며 魚腥草의 어떤 성분이 이러한 효과를 미치는 지에 대해서는 추가 연구가 필요하다 하겠다.
- 魚腥草는『名醫別錄』 36)에 “哉”으로 처 음 기재되 었으며 淸熱 解毒, 消癱排膿, 利尿通淋의 효능이 있으며 1°)瘤를 치료하고 억제하며 組織再生 을 촉진하는 작용을 하는 것으로 알려져 있고 11) 정 등12), 한 등I气 이 등1气 이 등1 5, , 정 등⑹의 보고에 의하면 魚腥草가암세포를 억제하는 효과가 있는 것으로 나타나 있다. 이러한 사실들로 미루어볼 때 魚腥草가 자궁근종 세포의 성장억제와 세포자멸사를 유도할 것으로 생각되어 본 실험을 계획하게 되었으며 자궁근종 세포의 직접적인 증식억제 효과를 조사하고 분자생물학적 기법인 세포주기 분석 법 을 통하여 세 포주기와 관련 한 유전자들의 발현을 조사하였으며 DNA fra gmentation 정량 분석을 통하여 이러한 증식억제 효과가 세포자멸사와 관련된 것임을 확인하고 또한 세포자멸사를 일으키는 기전에 대하여 관찰한 바 유의 한결 과를 얻을 수 있었다.
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