햄스터 난소세포에서 Daidzein과 Genistein에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 Vitamin C의 효과 Effect of Vitamin C on Oxidative Stress Induced by Daidzein and Genistein in Hamster Ovary Cells원문보기
The oxidative stress causes many diseases like cancer, aging, cardiovascular disease, degenerative neurological disorders (Parkinson’s disease, and Alzheimer's disease) by damage of cell membrane, protein deformation, and damage of DNA due to the oxidation of lipid of cell membrane, protein of tissu...
The oxidative stress causes many diseases like cancer, aging, cardiovascular disease, degenerative neurological disorders (Parkinson’s disease, and Alzheimer's disease) by damage of cell membrane, protein deformation, and damage of DNA due to the oxidation of lipid of cell membrane, protein of tissue or enzyme, carbohydrate, and DNA. It is caused by the reactive oxygen species (ROS) that is produced in the metabolic process of oxygen in cell. The superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) in cell systemize the antioxidative enzymes to control the oxidative stress. In this research, it is measured that the survival rate of cell by the typical isoflavonoid of daidzein or genistein, activity of antioxidative enzyme, and ROS level, in order to study the effect of isoflavonoid over the ROS production in cell and antioxidative system. As the similar action of the isoflavonoid with the estrogen is examined, women are encouraged to get bean. In view of this trend, it is very important to find out a combination medicine that lowers the oxidative stress caused by the daidzein in the ovarian cell. In the combined treatment of the typical antioxidant of vitamin C to oxidative stress which induced by daidzein recover the control level particularly lowering the ROS in cell by 30%. However, it made no effect in the combined treatment with genistein. Therefore, the research took the combination effect of daidzein with vitamin C in order to check it effect over the antioxidative system. In conclusion, it was disclosed that the oxidative stress caused by daidzein is related to the lowering activity of SOD, and the specific combination effect of daidzein with vitamin C is related to the recovery of SOD activity.
The oxidative stress causes many diseases like cancer, aging, cardiovascular disease, degenerative neurological disorders (Parkinson’s disease, and Alzheimer's disease) by damage of cell membrane, protein deformation, and damage of DNA due to the oxidation of lipid of cell membrane, protein of tissue or enzyme, carbohydrate, and DNA. It is caused by the reactive oxygen species (ROS) that is produced in the metabolic process of oxygen in cell. The superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) in cell systemize the antioxidative enzymes to control the oxidative stress. In this research, it is measured that the survival rate of cell by the typical isoflavonoid of daidzein or genistein, activity of antioxidative enzyme, and ROS level, in order to study the effect of isoflavonoid over the ROS production in cell and antioxidative system. As the similar action of the isoflavonoid with the estrogen is examined, women are encouraged to get bean. In view of this trend, it is very important to find out a combination medicine that lowers the oxidative stress caused by the daidzein in the ovarian cell. In the combined treatment of the typical antioxidant of vitamin C to oxidative stress which induced by daidzein recover the control level particularly lowering the ROS in cell by 30%. However, it made no effect in the combined treatment with genistein. Therefore, the research took the combination effect of daidzein with vitamin C in order to check it effect over the antioxidative system. In conclusion, it was disclosed that the oxidative stress caused by daidzein is related to the lowering activity of SOD, and the specific combination effect of daidzein with vitamin C is related to the recovery of SOD activity.
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문제 정의
이와 같은 결과는 성분에 따라 항산화효과가 다르게 나타날 수 있다는 것을 알 수 있다. Vitamin C를 병용 처리한 결과 daidzein에 의해 유도됐던 ROS가 유의적으로 감소하였으므로 이와 관련된 항산화 효소 활성에미치는 영향을 검토하기 위하여 다음 실험을 실행하였다. ROS 관련실험과 동일한 농도인 daidzein 50 μM에 ROS level을 감소시키는데 유의적인 영향을 줄 수 있는 최대 농도인 vitamin C 1 mM을 병용 처리하여 24시간 후에 단백질을 추출하고 위의 항산화효소 활성측정방법으로 효소활성을 측정하였다.
하지만 이전 연구결과에서 보는 바와 같이 햄스터의 난소세포에서 daidzein이나 genistein에의해 산화적 스트레스가 유도됨을 확인하고9, i°)이 스트레스를감소시켜주는 약물을 찾는 일은 매우 중요하다고 사료되었다. 본 실험에서는 특히 여성들에게 유익한 성분으로 알려진 daidzein이나 genistein0] 암세포에서는 항암효과가 있는 것으로알려져 있지만 설치류의 난소 상피세포인 Chinese hamster ovary-Kl(CHO-Kl)세포에서는 ROS가 상승되는 결과를 보고 이를 감소시키기 위하여 항산화제로 잘 알려진 vitamin C를 투여하여 효과를 검토하고자 하였다. 이를 위해 세포 생존율을 알아보기 위 한 MTT assay, reactive oxygen species(ROS) level 의변화, 항산화 효소의 활성 변화 등을 측정하고 vitamin C의 ROS 소거 효과를 검토하여 보고하고자 한다.
본 연구에서는 hamster.의 정상 난소세포에서 대표적 iso flavonoid 물질인 daidzein과 genistein이 유도하는 ROS를 감소시킬 수 있는 항산화제를 찾고 ROS가 감소되는 기전을 효소학적으로 살펴보고자 하였다. Hamster의 난소세포인 CH0-K1 에 daidzein과 genistein을 각각 투여하여 세포생존율을 측정한 결
본 실험에서는 특히 여성들에게 유익한 성분으로 알려진 daidzein이나 genistein0] 암세포에서는 항암효과가 있는 것으로알려져 있지만 설치류의 난소 상피세포인 Chinese hamster ovary-Kl(CHO-Kl)세포에서는 ROS가 상승되는 결과를 보고 이를 감소시키기 위하여 항산화제로 잘 알려진 vitamin C를 투여하여 효과를 검토하고자 하였다. 이를 위해 세포 생존율을 알아보기 위 한 MTT assay, reactive oxygen species(ROS) level 의변화, 항산화 효소의 활성 변화 등을 측정하고 vitamin C의 ROS 소거 효과를 검토하여 보고하고자 한다.
제안 방법
것이 이미 밝혀진 바 있으므로9, 1。)이 산화적 스트레스유발과 항산화효소와의 연관성을 조사하기 위하여 daidzein과 genistein에 항산화제인 vitamin C를 병용 투여하여 세포생존율을 즉정하였다. Daidzein과 genistein의 농도는 거의 세포독성을나타내지 않는 최고 농도인 50 μM로 동일하게 처리하였으며 병용 처리하는 vitamin C는 0.
5, 1, 2, 4mM)로 처리하여 24시간 배양하였다. Culture dish에서 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 농도별 sample을 얻고 상등액을 제거한 pell어에 lysis buffer ImZ을 가하였다. Lysis bu血er를 가한 각각의 sample을 14, 000 rpm, 4°C 에서 5분간 원심분리한 후 상층액 만을 취하여 enzyme assay sample로 사용하였다.
그 결과, 병용처리 농도가 증가함에 따라 세포생존율이 농도 의존적으로 감소하였다. Daidzein 또는 genistein 50 |iM 과 vitamin C, ImN을 병용 처리한 경우 daidzein은 63%, genistein은 66%의 (Fig. 3, 4) 세포 생존율을 나타냈으므로 이 농도를 vitamin C 최고 농도로 하여 실험을 시행하였다.
즉정하였다. Daidzein과 genistein의 농도는 거의 세포독성을나타내지 않는 최고 농도인 50 μM로 동일하게 처리하였으며 병용 처리하는 vitamin C는 0.5—4 mM 농도 범위에서 실험을 시행하였다. 그 결과, 병용처리 농도가 증가함에 따라 세포생존율이 농도 의존적으로 감소하였다.
Vitamin C를 병용 처리한 결과 daidzein에 의해 유도됐던 ROS가 유의적으로 감소하였으므로 이와 관련된 항산화 효소 활성에미치는 영향을 검토하기 위하여 다음 실험을 실행하였다. ROS 관련실험과 동일한 농도인 daidzein 50 μM에 ROS level을 감소시키는데 유의적인 영향을 줄 수 있는 최대 농도인 vitamin C 1 mM을 병용 처리하여 24시간 후에 단백질을 추출하고 위의 항산화효소 활성측정방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과, daidzein 단독 처리로 인해 45% 가량 감소했던 SOD활성이 control 수준이상으로 완전히 회복되었다(Fig.
Lysis bu血er를 가한 각각의 sample을 14, 000 rpm, 4°C 에서 5분간 원심분리한 후 상층액 만을 취하여 enzyme assay sample로 사용하였다. Sample protein의 정량은 bovine serum albumin(BSA)을 standard로 사용하여 BCA protein assay을 하였다.皿
Valetine의 방법 에 의 해 측정하였다.⑷ GPx의 반응동안 glutathione(GSSG)은 GSH의 일정 농도에 대해서 제공되는 과잉의 glutathione reductase(GR)에 의해 환원되며 °1 때 reduced nicotin-amide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)의 산화를 관찰하였다. 0.
과, 농도가 50jiM 때 daidzein인 경우에는 생존률이 89%, genistein인 경우에는 77%로 거의 세포 독성을 나타내지 않았으므로 50 μM을 최고 농도로 하여 실험을 실행하였다(Fig. 1, 2).
그러므로 본 연구에서 daidzein 및 genistein고卜 항산화제인 vitamin C를 병용 처리하여 항산화 효소의 활성, ROS level을 측정하여세포 내 산화적 스트레스에 대해 살펴본 결과, 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
배양기에서 24시간 동안 안정화 시킨 후 daidzein나 genistein에 vitamin C를 4가지 농도(0.5, 1, 2, 4mM)로 처리하여 24시간 배양하였다. Culture dish에서 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 농도별 sample을 얻고 상등액을 제거한 pell어에 lysis buffer ImZ을 가하였다.
본 연구의 그래프와 표의 모든 수치는 각 실험 횟수에 대한 평균과 표준오차로 표시하였으며, 모두 triplicate set로 세 차례 이상 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student 'test를 시행하여 계산하였다.
DCF-DA는 ROS의 세포 내 변화를 볼 때 사용하는 세포 투과성 염료로, HQ?나 superoxide에의해 산화될 때 형광을 나타낸다. 산화된 DCF의 형광성은 485 nm의 excitation wavelength와 530 nm의 emission wavelength 에서 측정하였다.⑸
시료의 처리와 단백질 정량 -3xl06ceIls/mZ의 CHO-K1 cell suspension을 100 n tissue culture dish에 가하였다. 배양기에서 24시간 동안 안정화 시킨 후 daidzein나 genistein에 vitamin C를 4가지 농도(0.
5) 1 m/에 각각의 sample을 50 p/씩 가하고 &분 동안 미리 배양 시켰다. 여기에 5mM hematoxylin을 30p/을 가한 후 phosphate buffer를 blank로 하여 UV/visible spectropho- tometer를 사용해 568nm에서 흡광도를 측정하였고 5분 후 다시 흡광도의 변화를 측정하였다.
1 m/을 각각 넣은 후 5분간 미리 배양시켰다. 여기에각 각의 sample을 가하여 UV/visible spectrophotometer 340 nm에서 흡광도를 측정하고 5분 후 다시 흡광도를 측정하였다.
5)을 만들었다. 이 substrate solution 1 m/에 각 sample 50 g를 가한 후 43.6 M」cm』의 exitinction coefficient를 사용하여 UV/visible spectrophotometer로 240nm 에서 phosphate buffer를 blank로하고 30초마다 1분 동안 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
세포주는 Chinese hamster ovary(CHO-Kl)을 American type culture collection(ATCC)에서 구입하였다.
blue는 Gibco BRL life Technologies Inc. 제품을 사용하였고, fetal bovine serum(FBS)은 BioWhittakeF「M로부터 , pro tease inhibitor cocktail tablets은 Roche로부터, MTT[3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoIium bromide], bic- inchonic acid protein assay kit, p-nicotinamide adenine dinu cleotide phosphate reduced form(p-NADPH), glutathione reduced form 및 hematoxylin^ Sigma Co에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student 'test를 시행하여 계산하였다.
이론/모형
Catalase(CAT)의 활성측정 —CAT의 활성 측정은 hydrogen peroxide의 분해에 따라 감소하는 흡광도를 측정하는 Aebi 방법을 이용하였다.'* 50 mM phosphate buffer(pH 7.
Glutathione peroxidase(GPx)의 활성측정 - GPx의 활성은 PSglia와 Valetine의 방법 에 의 해 측정하였다.⑷ GPx의 반응동안 glutathione(GSSG)은 GSH의 일정 농도에 대해서 제공되는 과잉의 glutathione reductase(GR)에 의해 환원되며 °1 때 reduced nicotin-amide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)의 산화를 관찰하였다.
Superoxide dismutase(SOD)의 활성 측정 - SOD 활성 즉정은 hematoxylin을 이용한 Martin의 방법을 사용하였다.⑵ Hematoxylin은 자연상태에서 붉은색인 hematin으로 자가 산화한다.
성능/효과
나타났다. Daidzein 50)iM과 vitamin C 0.25〜 ImM를병용 처리한 세포 내 ROS를 측정한 결과 농도의존적인 결과는아니었지만 vitamin C 1 mM로 병용 처리하였을 때는 control 수준까지 감소시키는 결과를 얻었으나(Fig. 5), 반면에 genistein에의해 유도된 ROS 제거에는 유의적인 효과가 없었다(Fig. 6). Daidzein나 genistein이 두 가지 모두 isoflavonoid이면서 햄스터의 난소세포에서 산화적 스트레스를 일으키는 물질임에도 불구하고 vitamin C는 daidzein涅 인한 ROS 소거에 효과가 크고 genistein에는 거의 영향을 미치지 않았다.
Daidzein 단독처리 시 항산화효소와 관련하여 볼 때 SOD의효소활성이 저하되었으나 vitamin C를 병용처리 함으로써 SOD 효소 활성이 control 수준 이상으로 회복되었으며 CAT나 GPx 활성에는 거의 변화가 없었다.
Daidzein고卜 대표적인 항산화제인 vitamin C를 병용처리 한 세포에서 daidzein에 의해 유도되었던 산화적 스트레스가 감소되는것으로 나타났다. Daidzein 50)iM과 vitamin C 0.
ROS 관련실험과 동일한 농도인 daidzein 50 μM에 ROS level을 감소시키는데 유의적인 영향을 줄 수 있는 최대 농도인 vitamin C 1 mM을 병용 처리하여 24시간 후에 단백질을 추출하고 위의 항산화효소 활성측정방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과, daidzein 단독 처리로 인해 45% 가량 감소했던 SOD활성이 control 수준이상으로 완전히 회복되었다(Fig. 7). CAT와 GPx인경우 vitamin C를 병용 처리하여도 daidzein(50 jiM}을 단독 처리였을 때와 마찬가지로 이들 활성에는 유의적인 변화가 없었다 (Fig.
5—4 mM 농도 범위에서 실험을 시행하였다. 그 결과, 병용처리 농도가 증가함에 따라 세포생존율이 농도 의존적으로 감소하였다. Daidzein 또는 genistein 50 |iM 과 vitamin C, ImN을 병용 처리한 경우 daidzein은 63%, genistein은 66%의 (Fig.
처리함。로써 산화적 스트레스로 부터 회복된다는 것을 알 수있었다.
후속연구
적용되어지는 daidzein。] 세포 상태에 따라 최적으로활용되기 위해서는 향후 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
참고문헌 (15)
Scandalios, J. G. : Oxidative stress molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. 38, 995 (2005)
Halliwell, B. : Free radicals in biochemistry and medicine. Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine 2, 330 (1996)
Scandalios, J. G. : Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 527-568 (1997)
McCord, J. M. : Superoxide, superoxide dismutase and oxygen toxicity. Reviews in Biochemical Toxicology 1, 109 (1979)
Middleton, E. : Biological properties of plant flavonoids: an overview. Int. J. Pharmacognosy 34, 344 (1996)
Coward, L., Barnes, N. C., Setchell, K. D. R. and Barnes, S. : Genistein, daidzein, and the ${\beta}$ -glycoside conjugates: Antitumor isoflavones in soybean foods from American and Asian diets. J. Agric. Food Chem. 41, 1961 (1993)
Anderson, J. J. and Garner, S. C. : The effects of phytoestrogens on bone. Nutr. Res. 17(10), 1617 (1997)
Yamamoto, S., Sobue, T., Kobayashi, M., Sasaki, S. and Tsugane, S. : Soy, isoflavones, and breast cancer risk in Japan. J. Natl. Cancer Inst. 95, 906 (2003)
Kim, M. H. and Kim, A. K. : Effect of daidzein on activity and expression of antioxidant enzyme in hamster ovary cells. Cancer. Prevention Res. 11(4), 321 (2006)
Kim, M. H. and Kim, A. K. : Effect of genistein on activity and expression of antioxidant enzyme in Hamster ovary cells. Yakhak Hoeji 51, 75 (2007)
Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. and Klenk, D. C. : Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76 (1985)
Martin, J. P., Dailey, M. and Sugarman, E. : Negative and Positive ass superoxide dismutase based on hematoxylin autoxidation. Arch. Biochem. Biophys. 255(2), 329 (1987)
Aebi H. : Catalase in vitro. Method in Enzymology 105, 93 (1984)
Paglia, D. E. and Valentine, W. N. : Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med. 70, 158 (1967)
Sattler, M., Winkler, T., Verma, S., Byrne, C. H., Shrikhande, G., Salgia, R. and Griffin, J. D. : Hematopoietic growth factors signal through the formation of reactive oxygen species. Blood 93, 2928 (1999)
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