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문제 정의
- 본 연구에서는 쑥속 식물중 바닷가에 주로 서식하는 큰비쑥 (Artemisia fuiado을 대상으로 그 유효성분이 염증성 질환의 예 방 및 치료제 개발의 기초자료로 사용 될 수 있는지 탐색하고, 식품산업에서 항염증 활성을 갖는 기능성 식품으로의 가능성을 밝히고자 극성에 따라 순차적으로 용매 분획하여 추출물 및 분 획물을 가지고 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 염증성 cytokine인 # 그리고 I L-6의 억제 효과를 관찰하고, NO의 생성억제 효과 및 iNOS, COX-2 그리고 PG5 생성 및 활 성 억제를 조사하여 기능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- 7 세포에서 LPS로 유도된 TNF- a, II.-ip 그리고 I L-6와 같은 pro-inflammatory cytokine과 NO의 생성억제 효과, 그리고 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제효과 및 PGEj 생성 억제효과 등을 통해 알아보았다. 대식세포 계열인 RAW 264.
- free한 조건하에서 이루어졌다. 1 ug의 total RNA를 oligo(dT) 18 primer, dNTP(0.5 pM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase(2U)로 70C 5 min, 25C 5 min, 37C 60min, 그리고 70C에서 10 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다.
- iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS(l : 1000) (Cal biochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2(1:1000)(BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TIBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US A) 과 1-3 분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
- Polymerase chain reactioii(PCR)은 합성된 cDNA로부터 유전자를 증폭시키기 위하여 2pL cDNA, uM의 5, 과 3' primer, 10x buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250 uM dNTR 25 mM MgCl2, 1 unit Taq polymerase (Promega, Madison, WI, USA)를 섞고 distilled water로 전체를 25 uL로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler(Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR cyclee 94C/45초, 55501/45초, 72C/60초, 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.
- RAW 264.7 세포에 LPS(1 mL)를 사용하여 COX-2의 생성을 유도한 후 큰비 쑥 주출물과 분획 물을 50 jig/mL 농도로 처리하여 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 확인 하였다. 그 결과, iNOS의 단백질 발현 양상과 마찬가지로 헥산, 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig.
- RAW 264.7 세포에 LPS(11mL)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 큰비쑥 주줄물과 분획물을 50 ug/mL 농두루- 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting를 통해 알아보았다. 그 결과 immunoblotting에 의한 iNOS의 단백질 생성은 헥산, 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig.
- RAW 264.7 세포에서 염증성 PGEj 억제 효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. RAW 264.
- 1% Tween 20 -TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS(l : 1000) (Cal biochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2(1:1000)(BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TIBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US A) 과 1-3 분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
- 5X105 cells/mL)를 DMEM 배지에 추출물 시료와 LPS(1 /mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 배양 배지를 얻어 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. lDH(lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 pl와 reconstituted substrate mix를 50 |1L를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50gL의 stop solution을 넣은 후microplate reader(Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000) 의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- , Vermont, WI, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000) 의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- 즉 분말 건조된 시료에 80% 에탄올로 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전히 건조시켰다. 건조된 에탄올 추출물에 10배량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
- 건조된 에탄올 추출물에 10배량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
- 본 연구는 쑥 추출물의 항염 활성이 prostaglandins 합성의 저해 및 pro-inflammatory cytokine의 억제기전과 관련이 있을 것으로 예상되어짐에 따라, 큰비쑥(4 fukudo)%: 대상으로 80% EtOH 로 추출하고 추출물을 극성에 따라 용매분획을 실시하여, 큰 비쑥 에탄올 추출물 및 용매분획물들이 염증반응의 주체가 되는 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 TNF- a, II.-ip 그리고 I L-6와 같은 pro-inflammatory cytokine과 NO의 생성억제 효과, 그리고 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제효과 및 PGEj 생성 억제효과 등을 통해 알아보았다.
- , Norwalk, CT, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR cyclee 94C/45초, 55501/45초, 72C/60초, 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band을 확인하였다( Table 1).
- 큰비쑥의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CHzC.), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH)을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다. 즉 분말 건조된 시료에 80% 에탄올로 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전히 건조시켰다.
- 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 큰비쑥 추출물과 분획물의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO.
대상 데이터
- 대식세포 계열 (muBne macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 penicillin-streptomycin 100units/mL 과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지 (GIBCO, Grand Island, NY USA)를사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.
- 세포로부터의 total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC, Cincinnati, OH, USA)를 이용하였으며, RNase.free한 조건하에서 이루어졌다. 1 ug의 total RNA를 oligo(dT) 18 primer, dNTP(0.
- 제주도 해안가 일대에 자생하고 있는 큰비쑥(4 fiikudd)^ 2006 년 9월경에 채집하여 제주대학교 생명과학과에 의뢰하여 동정하였으며, 채집된 시료는 증류수로 2-3회 수세한 뒤 물기를 제거한 뒤 2주간 음건한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치표준편차 (SD)를 구하여 신뢰수준 95% 0< 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- Supernatants were then collected after 24 hr and prostaglandin E2 concentration from supernatants was determined by ELISA method. Cell viability was determined using lactate dehydrogenase method. The data represent the mea- standard deviation of triplicate experiments.
- fukudo for 24 hr. Supernatants were then collected after 24 hr and prostaglandin E2 concentration from supernatants was determined by ELISA method. Cell viability was determined using lactate dehydrogenase method.
성능/효과
- 7 세포에서 염증성 PGEj 억제 효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. RAW 264.7 세포에 LPS (11umL)를 사용하여 PGEe의 생성을 유도한 후 큰비쑥 추출물과 분획물을 50 gg/ mL 농도로 처리하여 확인한 결과, PGEj 생성억제는 디클로로메탄 분획물에서 다른 분획물에 비해 높은 억제 효과를 나타내었다(Fig. 3). 이는 큰비쑥의 디클로로메탄 분획물에 의해 LPS에 의해 발현되는 PGEj 억제에 영향을 준다는 것을 의미하며, 이러한 결과는 COX-2의 생성 억제가 PG0 생성 억제를 통한 것으로 여겨진다.
- 7 세포에 LPS(11mL)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 큰비쑥 주줄물과 분획물을 50 ug/mL 농두루- 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting를 통해 알아보았다. 그 결과 immunoblotting에 의한 iNOS의 단백질 생성은 헥산, 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2). 본 연구 결과, NO 생성 억제 효과와 초기-염증성 인자 (pro-inflammatory factor) 생성 억제 효과가 가장 두드러지게 나타났던 디클로로메탄 분획물이 iNOS 의 발현 또한 강하게 억제시키는 걸로 보아 NO의 생성 억제 기전은 iNOS 발현 억제를 통해 이루어진 것으로 여겨진다.
- 의 형태로 측정하였다. 그 결과 헥산과디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다( Table 3). 특히 디클로로메탄 분획물인 경우 50ug/mL/ 농도에서도 세포독성 효과도 보이지 않으면서 아주 우수한 NO 생성 억제효과를 보여주었다.
- 7 세포에 LPS(1 mL)를 사용하여 COX-2의 생성을 유도한 후 큰비 쑥 주출물과 분획 물을 50 jig/mL 농도로 처리하여 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 확인 하였다. 그 결과, iNOS의 단백질 발현 양상과 마찬가지로 헥산, 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2).
- -ip 그리고 I L-6와 같은 pro-inflammatory cytokine과 NO의 생성억제 효과, 그리고 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제효과 및 PGEj 생성 억제효과 등을 통해 알아보았다. 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 큰비쑥 추출물을 처리하여 확인해 본 결과, 추출물 및 분획 물들이 다소 차이는 있었지만 TNF- a, I L-ip 그리고 I L-6에서 생성억제 효과를 나타났다. 또한 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성억제 효과가 강하게 나타났으며, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서는 iNOS, COX-2 및 PGE2 생성 억제 효과가 다른 분획물에 비해 강하게 나타났다.
- 대식세포인 RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인(pro inflammatory cytokine)의 발현 정도를 RT-PCR를 통해 알아 본 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 TNF- a, I L-ip 그리고 I L-6 생성억제에 대한 큰비쑥 추출물 및 용매분획물을 50|ig/mL 농도로 처리하였을 때, TNF- a 생성 억제는 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타냈으며, I L-10 생성 억제는 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 분획물에서는 I L-고의 생성을 오히려 증가시켰지만 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 보였으며, II.-6 생성 억제는 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 강한 억제 효과를 나타내었다 (Fig.
- 7 세포에 LPS로 자극을 주고 큰비쑥 추출물을 처리하여 확인해 본 결과, 추출물 및 분획 물들이 다소 차이는 있었지만 TNF- a, I L-ip 그리고 I L-6에서 생성억제 효과를 나타났다. 또한 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성억제 효과가 강하게 나타났으며, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서는 iNOS, COX-2 및 PGE2 생성 억제 효과가 다른 분획물에 비해 강하게 나타났다. 이러한 결과는 큰비쑥에서 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다.
- 2). 본 연구 결과, NO 생성 억제 효과와 초기-염증성 인자 (pro-inflammatory factor) 생성 억제 효과가 가장 두드러지게 나타났던 디클로로메탄 분획물이 iNOS 의 발현 또한 강하게 억제시키는 걸로 보아 NO의 생성 억제 기전은 iNOS 발현 억제를 통해 이루어진 것으로 여겨진다.
- 25%이었다. 에탄올 추출물에 대한 각 순차분획물 중 헥산 분획물 수율이 9.01%로 가장 낮았고, 수용성 분획물이 33.05%로 가장 높은 수율을 보였다.
후속연구
- 또한 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성억제 효과가 강하게 나타났으며, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서는 iNOS, COX-2 및 PGE2 생성 억제 효과가 다른 분획물에 비해 강하게 나타났다. 이러한 결과는 큰비쑥에서 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다. 또한 큰비쑥 추출물로부터 염증억제 성분을 도출하고자 활성분획인 헥산과 디클로로메탄 분획물에 대하여 활성 성분의 분리가 진행 중이다.
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